健康人与腹泻患者粪便标本中金黄色葡萄球菌检出情况及特征分析.pdf

疾病防治：46 4Jiangsu J Prev Med,Jul.Vol.34,No.42023江苏预防医学2 0 2 3年7 月第34卷第4期健康人与腹泻患者粪便标本中金黄色葡萄球菌检出情况及特征分析李东迅，王维钧，张阳，牛桓彩，舒高林北京市昌平区疾病预防控制中心，北京10 2 2 0 0摘要：目的了解北京市昌平区健康人与腹泻患者粪便标本中金黄色葡萄球菌（SA）检出情况，及其肠毒素分布、耐药类型和PFGE型别。方法对2 0 18 年549份健康人和7 0 4份腹泻患者的粪便标本进行SA菌检测，并对菌株进行肠毒素（SEs）/类肠毒素（SEls）、耐药和PFCE分型检测。结果SA菌检出率健康人为17.12%，腹泻患者为11.93%，差异有统计学意义(X=6.82,P0.01)。腹泻患者来源SA菌SEs/SEls基因总检出率为7 0.2 4%，健康人为53.19%，差异有统计学意义（X2=5.43,P=0.02）；腹泻患者来源SA菌中sea、s e g、s e i、s e l n、s e l x、s e l y 等基因检出率均高于健康人（P值均 0.0 5）。健康人来源和腹泻患者来源SA菌均对青霉素耐药率最高，其次为红霉素和克林霉素。腹泻患者检出10 株MRSA菌，检出率11.90%，健康人检出12 株，检出率12.7 7%，差异无统计学意义（X2=0.03,P=0.86）。PFG E分析显示，两种来源SA菌的PFCE带型散在分布，呈多样性。结论北京市昌平区健康人/腹泻患者来源SA菌携带多种肠毒素基因，存在不同程度的耐药性和多重耐药现象，且出现MRSA菌株，PFGE带型多样关键词：金黄色葡萄球菌；肠毒素；耐药；脉冲场凝胶电泳中图分类号：R117文献标识码：B文章编号：10 0 6-90 7 0(2 0 2 3)0 4-0 46 4-0 5金黄色葡萄球菌（staphylococcusaureus，SA）是革兰阳性球菌，可产生多种毒力因子，其中肠毒素是引起该菌食物中毒的主要致病因子，主要症状为呕吐和腹泻1-2 。该菌广泛存在于自然界，在人和动物的皮肤表面、咽喉、鼻咽、肠道等常见，在肠道中定植可造成环境污染及院内传播和感染34。研究显示，腹泻患者粪便标本中SA菌检出率高于致泻性大肠埃希菌、副溶血性弧菌和沙门菌5。为探究健康人与腹泻患者粪便标本中SA菌是否有差异，对两类便标本进行SA菌分离鉴定,并对分离出的SA菌进行肠毒素基因检测、药敏和脉冲场凝胶电泳（pulsedfieldgel elec-trophoresis,PFCE）分型等实验，比较两种来源SA菌所产肠毒素的类型及分布、耐药特性和PFGE分子型别，为防控SA菌中毒和感染提供参考。1材料与方法1.1标本来源采样时间为2 0 18 年，腹泻患者粪便标本来源于本辖区某哨点医院肠道门诊，共7 0 4份，患者临床症状表现为：每日排便3次，大便性状呈稀便、水样便、黏脓便或脓血便等，均未服用抗生素。健康人粪便标本来源于在区疾控中心进行行业健康体检且合格的从业人员，共549份。所有对象均知情同意。本研究通过单位伦理审查。1.2试剂与仪器7.5%氯化钠肉汤（北京路桥）；金黄色葡萄球菌显色培养基（上海科玛嘉）；SeakemGold琼脂糖（美国CambrexBio ScienceRockland）；溶菌酶（Si g ma）；蛋白酶K（德国Merck）；限制性内切酶XbaI和SmaI（美国NEB）;革兰阳性需氧菌药敏检测板L板（上海星佰）；VITEK全自动细菌鉴定仪和GP鉴定卡（法国梅里埃）;PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统和脉冲场凝胶电泳及配套设备（美国Bio-Rad）；2 T 5SuperPCRMix及引物合成（北京擎科）。1.3方法1.3.1SA菌分离及鉴定增菌：用无菌拭子取适量粪便至10 mL7.5%氯化钠肉汤于37 培养18 2 4h；菌株分离、初步鉴定与确证鉴定参照食品国家安全标准（CB4789.102016）。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistance staphylococcus aureus,MRSA）定义为对头孢西丁筛选耐药或对苯唑西林最小抑菌浓度4g/mL的菌株6 1.3.2肠毒素基因检测对检出的SA菌进行2 2 个肠毒素（SEs）/类肠毒素（SEls）基因（sea、s e b、s e c、s e d、see、s e g、s e h、s e i、s e l j、s e l k、s e l l、s e l m、s e l n、s e l、s e l u、s e r、selp、s e l o、s e s、s e t、s e l x、s e l y）检测，其引物及退伙温度参D01:10.13668/j.issn.1006-9070.2023.04.026作者简介：李东迅（198 9一），女，四川乐山人，主管技师，主要从事病原微生物检测相关工作通信作者：舒高林，副主任技师，E-mail：b j c p c d c 16 3.c o m.465JiangsuJPrevMedVol.34,No.4江苏预防医学2 0 2 3年7 月第34卷第4期照文献7 。基因组DNA提取采用水煮法,PCR扩增体系及条件参照北京擎科新业生物技术有限公司2 T5SuperPCRMix说明书。阳性PCR产物送北京擎科新业生物技术有限公司进行测序，整理测序序列并输入Genbank数据库比对，进行确证。1.3.3药敏实验对检出SA菌进行13类共15种抗生素药敏检测，具体步骤见上海星佰生物技术有限公司革兰阳性需氧菌药敏检测板L板说明书，结果输人该公司微生物鉴定药敏分析系统进行分析。质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC29213。1.3.4PFGE分型按照PulseNetChina网络实验室制定的金黄色葡萄球菌PFEG标准，用BioNumerics7.6软件采用UPGMA方法进行聚类分析。1.4统计分析采用SPSS17.0软件进行统计分析，计数资料采用X检验,P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1SA菌检出结果704份腹泻患者标本中检出8 4株SA菌，检出率为11.93%；549份健康人标本中检出94株，检出率为17.12%，差异有统计学意义（X=6.82,P0.01)。2.2SEs/SEls基因检出情况腹泻患者来源SA菌中SEs/SEls基因检出率为7 0.2 4%（59株），健康人来源SA菌检出率为53.19%（50 株），差异有统计学意义(X=5.43,P=0.02)。2 2 种SEs/SEls基因中,see、ser、s e s、s e t 等4种基因均未检出；腹泻患者来源SA菌中selx（48.8 1%）、s e l m（35.7 1%）检出率较高，健康人来源SA菌selu（2 6.6 0%）、s e l m（2 6.6 0%）检出率较高。腹泻患者来源SA菌中sea、s e g、s e i、s e l n、s e l x、s e l y检出率均高于健康人来源SA菌（P值均 0.0 5）；进一步分析显示，腹泻患者来源SA菌中51.19%（43株）同时检出SEs和SEls，高于健康人来源SA菌的2 3.40%（2 2 株），差异有统计学意义(X=14.77,P 0.0 5）。见表2。2.4MRSA检出情况腹泻患者中检出10 株MRSA菌，检出率11.90%，健康人中检出12 株，检出率12.77%，差异无统计学意义(X=0.03,P=0.86）。2 2株MRSA菌中有15株菌检出1 11种SEs/SEls基因，腹泻患者来源MRSA菌中8 株检出SEs/SEls基因，检出率8 0.0 0%，健康人来源MRSA菌中7 株检出SEs/SEls基因，检出率58.33%，差异无统计学意义（X=1.21,P=0.27)。表1金黄色葡萄球菌肠毒素基因检出情况肠毒素健康人腹泻患者X值P值基因检出数检出率(%)检出数检出率(%）sea55.321315.485.040.03seb1313.831011.900.140.70sec11.0655.953.260.07sed11.0633.571.310.25seg1313.832529.766.710.01seh11.0611.191.310.25sei1010.642226.197.280.01seli99.5778.330.080.77selk1010.6478.330.270.60sell55.3267.140.250.61selm2526.603035.711.730.19seln1617.022833.336.340.01selq1111.7078.330.550.46selu2526.602934.521.320.25selp33.1955.950.790.38selo1819.152529.762.730.10selx77.454148.8138.540.01sely22.131113.107.880.01表2 金黄色葡萄球菌耐药性健康人腹泻患者抗生素X值P值耐药菌株数耐药率（%）而耐药菌株数耐药率（%）苯唑西林（青霉素类）1212.771011.900.030.86青霉素（青霉素类）9196.817791.672.250.13红霉素（大环内酯类）4446.813440.480.720.40克林霉素（林可酰胺类）2324.472023.810.010.92左氧氟沙星（氟喹诺酮类）00.0022.383.030.08四环素（四环素类）99.5789.520.010.99庆大霉素（氨基糖苷类）1111.701011.900.010.97万古霉素（糖肽类）00.0011.191.510.22替考拉宁（糖肽类）00.0011.191.510.22利福平（安莎霉素类）11.0611.19 0.0 5)。表3金金黄色葡萄球菌耐药谱健康人腹泻患者耐药种类耐药谱耐药型耐药菌株数耐药率(%)耐药菌株数耐药率(%)单重耐药1ERYR100.0011.191LEVR200.0011.191PENR34446.813845.24双重耐药2DAP-PENR400.0011.192ERY-PENR52021.28910.712SXT-PENR600.0011.192TET-PENR711.0622.382(OXC-PEN)-ERYR800.0011.192(OXC-PEN)-CFXR900.0011.19多重耐药3ERY-CLI-PENR1022.1311.193ERY-SXT-PENR1100.0022.383ERY-TET-PENR1200.0011.193(OXC-PEN)-DAP-CFXR1322.1300.003(OXC-PEN)-ERY-CFXR1411.0611.193(OXC-PEN)-TET-CFXR1500.0011.194ERY-CLI-GEN-PENR1633.1922.384ERY-CLI-TET-PENR1722.1322.384(OXC-PEN)-ERY-CLI-CFXR1855.3244.764(OXC-PEN)-TET-GEN-CFXR1911.0600.005ERY-CLI-CEN-SXT-PENR2055.3289.525ERY-CLI-TET-PEN-CFXR2111.0600.005(OXC-PEN)-ERY-CLI-TET-CFXR2222.1311.195(OXC-PEN)-CLI-(VAN-TEC)-DAP-LZDR2300.0011.196ERY-CLI-GEN-RIF-SXT-PENR2411.0600.006ERY-CLI-LEV-TET-RIF-SXTR2500.0011.196ERY-CLI-TET-GEN-SXT-PENR2611.0600.00注：OXC为苯唑西林，PEN为青霉素，ERY为红霉素，CLI为克林霉素，LEV为左氧氟沙星，TET为四环素，GEN为庆大霉素，VAN为万古霉素，TEC为替考拉宁，RIF为利福平，SXT为复方新诺明，DAP为达托霉素，LZD为利奈唑胺，CFX为头孢西丁。2.6PFCE分型本实验得到143株菌的PFGE图谱，分为10 3种PFCE带型，其中2 2 种PFGE带型包含2 5株菌，相同带型菌株的来源相同或不同。腹泻患者来源SA菌PFGE带型52 种，健康人来源SA菌58种，两种来源SA菌的PFCE带型散在分布，呈现多样性。见图1。3讨论SA菌是北京市细菌性食物中毒的主要病原菌之_8。肠毒素是引起SA菌食物中毒的主要原因，其中有明确致呕吐作用的命名为肠毒素（SEs），无或致呕吐作用尚待确证的命名为类肠毒素（SEls）4)SEs/SEls均具有超抗原活性，可选择性激活大量T细胞,刺激大量炎性因子释放，引起发热、低血压，甚至致死性休克9。已发现至少2 7 种SEs/SEls，其中5种经典肠毒素SEASEE是引起食物中毒的主要类型10 。与5种经典肠毒素相比，本研究中selm、s e l u、selx、s e l n、s e l o、s e g、s e i 等7 种新型SEs/SEls基因携带率较高，提示应加强新型SEs/SEls基因监测，关注变化趋势。分析显示，sea、s e g、s e i、s e l n、s e l x、s e l y 等基因在腹泻患者来源的SA菌中检出率较高，但这6 种基因是否会引起腹泻，需再研究。Jiangsu JPrevMed,Vol.34,No.4.467江苏预防医学2 0 2 3年7 月第34卷第4期PFOE-SnalPFGE-SmalKey祥品来源肠毒索基因耐药谱SA46腹泻惠着DAP-PENSA45sci-sem-sen-seu-sco-sexPENSA08度污惠者ERY-CLI-LEV-TET-RIF-SXTSA24霞泻惠者scb-scg-sci-scm-sen-scu-sco-scxOXC-ERY-PENSA59腹泻惠者scc-seg-sei-scl-sem-sen-seu-sco-sexERY-PENSA44腹污惠者seb-seg-sei-sem-sen-seu-seoERY-PENSA81腹得惠者wcb-seg-sem-sen-scu-sco-sexERY-SXT-PENSA110健康人seb-seg-semPENPTO15A96健康人scb-seg-sci-scetn-seuERY-PENSA06冯惠者seg-sem-sen-seu-scoERY-PENSA72腹洱惠者seb-scg-sei-sem-sen-seu-sco-scxERY-SXT-PENSA167健康人sem-sen-seu-seoPENSA168健康人sem-sen-seu-seoPENPT02SA33腹泻惠者seg-sci-sem-scn-seu-sexERY-PENSA123假健康人PENSA133健康人seb-seg-scm-sen-scu-seoPENPT03SA31腹泻惠者seg-sei-sem-sen-scu-sco-sceyPENSA51腹冯惠者sem-seu-seyPENPT04SA52腹泻惠者seg-sei-sem-sen-scul-sco-sex-seyPEN54114健康人scg-sei-sem-sen-scu-scoPENSA30腹泻惠者ERY-PENSA36PENSA50腹泻惠者PENPT05SA149健康人PENSA91健康人PENSA109健康人PENSA151健康人PENSA166.健康人PENPT06S.A39股泻想者PENS447搬湾惠者LEVSA153健康人PENSA84健康人PENSA28股泻惠者sexPENSA130健康人/PENSA141健康人seaPENSA129健康人PENSA75腹洱惠着cbPENSA15sea-sch-sck-seq-sexSA70腹泻惠者sep-sexERY-CLI-GEN-SXT-PENSA74酸泻惠者se-sexPEN5434腹泻惠者sec-selsepSA1Oscc-sed-seg-sei-sej-sel-scm-sen-seu-sco-sex ERY-.CLI-GEN.SXT-PENSA76腹泻想者sec-sed-seg-sei-sej-sel-sem-sen-scu-sco-sex ERY-CLI-GEN-SXT-PENSA62酸得惠者sec-sed-scg-sci-sej-c-sem-sen-eu-seo-sexERY.CLI-GEN-SXT-PENPTO07SA27霞泻惠者seg-sem-sen-scu-scoERY-EICSA159健康人setm-scuERY-CLI-GEN-SXT-PENSA180股泻惠者scj-sem-sen-scuERY-CLI-GEN-SXT-PENPTO8SA58腹泻惠者seg-sei-sej-sem-sen-seu-sco-sexERY-CLI-GEN-SXT-PENSA118健康人sej-sem-scu-seoERY-PENSA124健康人seg-sei-sej-sel-scm-scu-scoERY-CLI-GEN-RIF-SXT-PENSA175健康人seg-sej-sem-scu-seoERY-PENPT095A126健康人sej-sem-scu-scoERY-PENSA87健康人sec-sed-seg-seisgj-sel-scm-sen-seu-seo-sex ERY-CLI-GEN-SXT-PENSA172健康人seg-sej-sel-sem-sen-scu-scoERY-CLI-GEN-SXT-PENSA1OS健康人seji-sem-seuPENSA20腹泻惠者seg-sei-sem-sen-seu-sco-sexERY-PENSA12TET-PENSA23腰泻患者ep-sexTET-PENSA106健康人TET-PENSA116健康人sepERY-CLI-GEN-PENSA117健康人ERY-CLL-GEN-PENPT101SA171健康人PENSA178骏得惠者ERY-CLI-GEN-SXT-PENSA53度得患者sea-sexPENSA147健康人PENPT115A68搬泻惠者sea-sexPENSA09搬泻惠者sea-sexERY-PENSA35散泻惠者sea-sexPENPT12SA165健康人sea-sck-seqPENSAI1泻忠者sea-sexPENSA37霞泻惠者seo-SexPENSA92健康学生seaPENSA142健康人PENSA144健康人sea-scbPENPT13SA.32腹泻惠者sea-SexPENSA173健康人seh-sek-sel-segOXC-ERY-PEN-CFXSA107健康人seg-nepERY-PENSA108健康人ERY-PENPT14SA155健康人PENSA19服码惠者seg-sci-sem-sen-seu-sco-sexOXC-ERY-CLI-PEN-CFXSA83健康人PENSA77腹污惠者scg-sei-sem-sen-seu-seo-sexPENSA78服泻惠者seg-sci-sem-sen-scu-sco-sexPENSA79腹污惠者seg-sei-sem-sen-seu-scoPENSA80腹泻惠者seg-sei-sem-sen-seu-sco-sexPENPT15SA158健康人sem-seu-scoPEN$A02腹泻惠者scg-sei-sem-sen-seu-sep-sco-scxPENSA157健康人ERY-PENSA103健康人PENSA179腹得惠者PENPT16SA102健康人OXC-DAP-PEN-CFXSA100便健康人ERY-PENSA41腹泻惠者PENSA63腹泻患者PENPT17SA21得惠者PENSA43泻惠者ERY-TET-PENSA60霞惠者XPENPT18SA161健康人seuERY-PENSA176健康人ERY-PENPT19SA139食健康人ERY-PENSA148健康人1PENPT20SA122健康人ebERY-PENSA95健康人OXC-ERY-CLI-PEN-CFXSA127健康人ERY-CLI-TET-PENSAOI腹泻惠者scb-sek-seq-sex-seyERY-CLI-TET-PENSA128健康人scb-sck-scqOXC-TET-GEN-PEN-CFXSA71霞瑪惠者scb-sck-scq-seyOXC-ERY-CLI-TET-PEN-CFXSA112健康人acb-sck-seqOXC-ERY-CLI-PEN-CFXSA138健康人seb-sck-segOXC-ERY-CLI-PEN.CFXPT215A86健康人sex-seyOXC-ERY-CL-TET-PEN-CFXSA61腹冯惠者scb-sck-seq-sex-seyOXC-TET-PEN-CFX5A169健康人seb-sck-seqOXC-ERY-CLI-TET-PEN-CFXSA88健康人sck-seq-sex-scyOXC-ERY-CLI-TET-PEN-CFXSA170健康人OXC-ERY-CLI-PEN-CFXSA140健康人scb-sek-segPENSA26搬泻惠者sca-sck-scq-sex-seyOXC-ERY-CLI-PEN-CFXSA57夏惠者scb-sck-scq-sex-seyERY-CLI-TET-PENSA132健康人ERY-CLI-TET-PENSA134健康人web-sck-segOXC-ERY-CLI-PEN-CFXSA54馥泻惠者sca-scb-sek-seq-sex-seyOXC-ERY-CLI-PEN-CFXSA55霞得惠者ex-seyOXC-ERY-CLI-PEN-CFXHSA48霞泻惠者OXC-ERY-PEN-CFXSA119健康人sepERY-PENSA101健康人OXC-DAP-PEN-CFXSA113健康人sei-sel-sem-sen-seu-scoPENSA115健康人scb-sck-scqERY-CL-PEN5A73度湾惠者seg-sci-sem-sen-seu-sexERY-PENSA67腹泻惠者seg-sci-sem-scn-seu-sco-sexERY-PEN5A29腹泻惠者seg-scm-sen-seu-scoPENSA89健康人scg-scem-scn-seu-sco-scxPENSA90健康人seg-sei-sem-sen-seu-seo-sexERY-PENSA97健康人seg-sei-sem-sen-scu-seo-sexERY-PENSA145健康人seg-sei-sem-sen-seu-sco-sexPENSA162健康人seg-sci-sem-sen-scoERY-PENPT225A104健康人sem-sen-seuERY-PENSA69腰得惠者seg-sci-sj-sem-sen-scu-sco-sexPENSA121健康人scm-seu-seoPENSAOS酸泻惠者seu-seyPENSA1健康人sei-sem-sen-seu:1SA85健康人ERY-CLI-TET-PEN-CFX5A99健康人seuSA160健康人sej-semPENSA177废得惠着ERY-CTI-PEN图1金黄色葡萄球菌PFCE带型聚类分析编辑：周羚编辑：管芳468Jiangsu J Prev Med,Vol.34,No.4江苏预防医学2 0 2 3年7 月第34卷第4期本研究中，两种来源的SA菌对青霉素、红霉素和克林霉素的耐药率均在前3位，与之前北京地区结果一致,且多重耐药率接近1/3,提示在治疗SA菌感染时应慎重选择抗生素，依据药敏结果合理、适量用药6 。SA菌多重耐药现象已成为世界性的公共卫生问题,是临床治疗的挑战9。MRSA被称为“超级细菌”12 ,研究从腹泻患者、健康人标本中均有分离，一旦出现MRSA菌感染或传播将难以控制12 。万古霉素是治疗MRSA感染的首选用药，疗效欠佳时可考虑替加环素或利奈唑胺13，临床上已出现耐万古霉素的SA菌感染病例10 ,本研究也出现1株MRSA菌同时耐受万古霉素和替考拉宁，值得高度警惕。虽然全基因组测序日益流行且更有发展前景，但PFCE分型重复性好、分辨率高、结果稳定、易于标准化，能客观反映病原菌遗传基因相关性，仍是SA菌等食源性病原菌暴发流行时追查传染源的重要手段14。本研究中，SA菌PFCE型别较多，散在分布，与北京市特征相似8 ，可为本地区SA菌数据库的建立提供更详细的资料。参考文献1艾晓兰，龙燕，梁秉绍，等.儿童粪便金黄色葡萄球菌毒素基因的检测及分析J.中华检验医学杂志，2 0 2 1,44（4）：2 91-2 972章海通，邢家澡，傅晓，等.食源性金黄色葡萄球菌产肠毒素情况及耐药性分析J.食品研究与开发，2 0 19,40（2 0）：17 5-17 9.3汪永禄，张萍，陶勇，等.不同来源金黄色葡萄球菌肠毒素及耐药性检测分析J.实用预防医学，2 0 14,2 1（4）：48 8-491.4赵志鹏，李晓晨，李润青，等.金黄色葡萄球菌在儿童腹泻病人中（上接第46 0 页）机体细菌感染状态，适用于细菌性肺炎的早期诊断及病情评估，但PCT单独应用很难满足临床需要，需进一步联合其他生物学指标12 。本资料显示，血清PCT、CD 6 4、CD 54水平发生小儿社区获得性细菌感染肺炎组较未发生组高，联合早期诊断的灵敏度、AUC分别为98.8 8%和0.94，均高于单独诊断，与马彩燕等13 报告一致，值得临床推广。参考文献1张晓菲，秦俊峰，王璨.新乡市某医院获得性肺炎患者多药耐药菌感染状况及影响因素研究J.江苏预防医学，2 0 2 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