资源描述
1、 说出三种蛋白质的测定方法，若你选择，你会选择哪一种？为什么？
答：双缩脲法、lowry改良法、考马斯亮蓝（Bradford）法、BCA（二喹啉甲酸）法、紫外线分光光度法。我会选择BCA法。双缩脲法灵敏度差，特异性不高。Lowry改良法对样品的溶解度要求高、易受物质干扰且容易产生测量误差。紫外线分光光度法的精确度差。而BCA法则能较好地弥补以上方法的缺点。它具有操作便捷快捷、精确度高、抗干扰能力强、能使用于微板孔等特点。
2、 western blot印记中封闭液的作用？
答：封闭液可以结合非相关蛋白的位点以降低非特异性结合的背景。
3、 γ球蛋白的提取过程。
答：（1）盐析—中性盐沉淀：
通过加入半包和硫酸铵可以使球蛋白沉淀，清蛋白留在溶液中。得到γ球蛋白粗制品。
（2）脱盐—凝胶柱层析：
经过凝胶柱层析，使得大分子的蛋白质和小分子的盐分离。
（3）纯化—DEAE纤维素阴离子交换层析
用阴离子交换层析可以把在PH=6.3的缓冲液中的带负电的α、β球蛋白和带正电的γ球蛋白分离。使γ球蛋白被洗脱出来被纯化。
（4）经过浓缩得到浓度高的γ球蛋白
4、离子交换剂的原理
答：离子交换剂是一种在高分子的不溶性载体上结合有若干活性基团，这些活性基团含可解离的离子并和溶液中的其他离子进行交换。
5、 如果western blot中出现两条带，是否说明有杂质？为什么？
答：并不说明有杂质。因为在实验中我们的检测对象是人血清IgG，IgG是由两条轻链和两条重链通过二硫键结合起来，变形后轻、重链分开，形成两条带（21KD、57KD）
6、 分别简述DNA提取中蛋白酶K、SDS、无水乙醇、RNase的作用
答：蛋白酶K：将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。
SDS：破坏细胞的细胞膜、核膜并使组织蛋白和DNA分子分离
无水乙醇：可以使DNA沉淀
RNase：可以去除溶液中的RNA
（EDTA：抑制细胞中的DNase活性）
7、 试述转化质粒蓝白筛选的原理。
答：载体质粒DNA带有b-半乳糖苷酶N端146个氨基酸残基（α片段）的编码信息，经过改造的宿主菌含有b-半乳糖苷酶C端（ω片段）的序列。只有当两个片段都存在的时候才能形成有活性的b-半乳糖苷酶（这种现象称为α-互补）。b-半乳糖苷酶在IPTG的存在下可以使底物X-gal转变为蓝色产物，使菌落变为蓝色。当外源DNA片段插入载体的多克隆位点后。便不能表达α片段，转化细菌后不能分解底物，结果使菌落呈现白色。α互补筛选又称为蓝白筛选。
8、 简述RT-PCR原理及核酸类型。
答：首先，经逆转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。
实验中所加入的特殊试剂
聚丙酰胺凝胶电泳：P47-48、53
1、TEMED（三羟甲基氨基甲烷）：加速剂，在碱性环境下处于自由碱基的状态并加速过硫酸铵的作用。
2、AP（过硫酸铵）：产生自由基，使丙烯酰胺单体双链打开，形成自由基丙烯酰胺，引发聚合反应。
3、水层：在胶面封以水层可以避免直接与空气接触（O2能妨碍聚合），也可以使胶面变得平整。
4、考马斯亮蓝：染色液
5、溴酚蓝：样品示踪染液
6、蔗糖溶液：保证样品的稳定性，不易悬浮在液体中。
7、A液：Acr-Bis
B液：浓缩胶缓冲液
C液：分离胶缓冲液
D液：电极缓冲液
E液：1%过硫酸铵溶液
8、EB（溴化乙锭）：核酸染色剂，可插入DNA双螺旋结构两个碱基之间，在紫外线的激发下发出橙光。
9、硫基乙醇：使二硫键还原。
DNA琼脂糖凝胶电泳：P56~57
*1、TBE：Tris-硼酸，EDTA（抑制细胞中的DNase活性）
Western blot：P61~63
1、封闭液：封闭膜上可能结合非相关蛋白的位点，降低非特异性结合的背景。本实验用的是牛血清白蛋白。
2、辣根过氧化物酶（HRP）：标记羊抗人IgG抗体
3、3,3’-一二氨基联苯胺：HRP底物
4、考马斯蓝：用于凝胶，检查蛋白质转移是否完全。
5、丽春红S：用于NC膜上，可将蛋白质染红，短暂显色，判断是否有转移出蛋白质。
6、TBS：成分NaCl,Tris,HCl，用作缓冲液。
酶动力反应：P77、P84
1、磷酸苯二钠：被碱性磷酸酶水解成酚和磷酸盐。
2、4-氨基安替比林：与酚在碱性溶液中作用形成红色的醌衍物。
3、铁氰化钾：催化酚和4-氨基安替比林反应
质粒DNA提取：P91~94：
*1、溶液I：Tris-Hcl：控制PH。
EDTA：二价金属离子的螯合剂，可抑制Dnase的活性
葡萄糖：提高溶液黏度，防止DNA断裂，比重大，使细菌不易沉淀
*2、溶液II：NaOH：溶解细胞
SDS：当溶液III进入时，SDS与K+结合变为PDS，PDS不溶于水沉淀。因SDS可结合2个氨基酸。所以PDS沉淀时使绝大部分蛋白质一起沉淀。
*3、溶液III：乙酸钾：提供K+
冰乙酸：同上
*4、TE：含RNase 用于消除RNA（质粒DNA提取提及）
含Tris-HCl, EDTA（基因组DNA的提取）
5、饱和酚：使蛋白质变性沉淀
6、酚：氯仿，用于萃取酚
基因组DNA的提取：P93~94
*1、蛋白酶K：将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。
*2、SDS：破坏细胞的细胞膜、核膜并使组织蛋白和DNA分子分离
*3、AR（无水乙醇）：可以使DNA沉淀
*4、RNase：可以去除溶液中的RNA
5、70%乙醇：用于洗涤质粒DNA沉淀，除去盐分
RNA的提取：P100~102
*1、Trizol试剂：异硫氰酸胍：在溶解细胞时保持RNA完整，使RNA释放，酸性条件下使得RNA与DNA分离
苯酚：沉淀蛋白质
2、氯仿：使溶液变成三层（RNA/DNA/蛋白质）
3、异丙醇：沉淀RNA
4、DEPC（焦碳酸二乙酯）：可消除RNase
限制性内切酶：
1、 DTT（二硫苏糖醇）：还原剂
DNA的转化和筛选：P109~110
1、X-gal：底物
2、CaCl2：增加细胞膜的通透性
3、甘油：灭菌
4、IPTG：诱导剂，让细胞产生更多半乳糖苷酶
血清γ球蛋白提取：P114~115
*1、半饱和硫酸铵：沉淀球蛋白，使球蛋白和清蛋白分离
*2、DEAE纤维素阴离子交换剂：将α、β球蛋白和γ球蛋白分离
*3、磺基水杨酸：检测蛋白质，白色即有
*4、奈氏试剂：检测NH4+，黄色或红棕色即有
另外
归纳SDS：
1、 阴离子去污剂，可以破坏蛋白质分子间以及其他物质分子间的非共价键，使得蛋白质变性解离成单一亚基，形成SDS-蛋白质负离子。（SDS-PAGE）
2、破坏细胞的细胞膜、核膜并使组织蛋白和DNA分子分离（基因组DNA的提取）
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