生物化学与分子生物学技术-重点试题归纳.doc

1、 说出三种蛋白质的测定方法，若你选择，你会选择哪一种？为什么？答：双缩脲法、lowry改良法、考马斯亮蓝（Bradford）法、BCA（二喹啉甲酸）法、紫外线分光光度法。我会选择BCA法。双缩脲法灵敏度差，特异性不高。Lowry改良法对样品的溶解度要求高、易受物质干扰且容易产生测量误差。紫外线分光光度法的精确度差。而BCA法则能较好地弥补以上方法的缺点。它具有操作便捷快捷、精确度高、抗干扰能力强、能使用于微板孔等特点。2、 western blot印记中封闭液的作用？答：封闭液可以结合非相关蛋白的位点以降低非特异性结合的背景。3、 球蛋白的提取过程。答：（1）盐析中性盐沉淀： 通过加入半包和硫酸铵可以使球蛋白沉淀，清蛋白留在溶液中。得到球蛋白粗制品。 （2）脱盐凝胶柱层析： 经过凝胶柱层析，使得大分子的蛋白质和小分子的盐分离。 （3）纯化DEAE纤维素阴离子交换层析 用阴离子交换层析可以把在PH=6.3的缓冲液中的带负电的、球蛋白和带正电的球蛋白分离。使球蛋白被洗脱出来被纯化。 （4）经过浓缩得到浓度高的球蛋白4、离子交换剂的原理答：离子交换剂是一种在高分子的不溶性载体上结合有若干活性基团，这些活性基团含可解离的离子并和溶液中的其他离子进行交换。5、 如果western blot中出现两条带，是否说明有杂质？为什么？答：并不说明有杂质。因为在实验中我们的检测对象是人血清IgG，IgG是由两条轻链和两条重链通过二硫键结合起来，变形后轻、重链分开，形成两条带（21KD、57KD）6、 分别简述DNA提取中蛋白酶K、SDS、无水乙醇、RNase的作用答：蛋白酶K：将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。SDS：破坏细胞的细胞膜、核膜并使组织蛋白和DNA分子分离无水乙醇：可以使DNA沉淀RNase：可以去除溶液中的RNA（EDTA：抑制细胞中的DNase活性）7、 试述转化质粒蓝白筛选的原理。答：载体质粒DNA带有b-半乳糖苷酶N端146个氨基酸残基（片段）的编码信息，经过改造的宿主菌含有b-半乳糖苷酶C端（片段）的序列。只有当两个片段都存在的时候才能形成有活性的b-半乳糖苷酶（这种现象称为-互补）。b-半乳糖苷酶在IPTG的存在下可以使底物X-gal转变为蓝色产物，使菌落变为蓝色。当外源DNA片段插入载体的多克隆位点后。便不能表达片段，转化细菌后不能分解底物，结果使菌落呈现白色。互补筛选又称为蓝白筛选。8、 简述RT-PCR原理及核酸类型。答：首先，经逆转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。实验中所加入的特殊试剂聚丙酰胺凝胶电泳：P47-48、531、TEMED（三羟甲基氨基甲烷）：加速剂，在碱性环境下处于自由碱基的状态并加速过硫酸铵的作用。2、AP（过硫酸铵）：产生自由基，使丙烯酰胺单体双链打开，形成自由基丙烯酰胺，引发聚合反应。3、水层：在胶面封以水层可以避免直接与空气接触（O2能妨碍聚合），也可以使胶面变得平整。4、考马斯亮蓝：染色液5、溴酚蓝：样品示踪染液6、蔗糖溶液：保证样品的稳定性，不易悬浮在液体中。7、A液：Acr-BisB液：浓缩胶缓冲液C液：分离胶缓冲液 D液：电极缓冲液E液：1%过硫酸铵溶液8、EB（溴化乙锭）：核酸染色剂，可插入DNA双螺旋结构两个碱基之间，在紫外线的激发下发出橙光。9、硫基乙醇：使二硫键还原。DNA琼脂糖凝胶电泳：P5657*1、TBE：Tris-硼酸，EDTA（抑制细胞中的DNase活性）Western blot：P61631、封闭液：封闭膜上可能结合非相关蛋白的位点，降低非特异性结合的背景。本实验用的是牛血清白蛋白。2、辣根过氧化物酶（HRP）：标记羊抗人IgG抗体3、3,3-一二氨基联苯胺：HRP底物4、考马斯蓝：用于凝胶，检查蛋白质转移是否完全。5、丽春红S：用于NC膜上，可将蛋白质染红，短暂显色，判断是否有转移出蛋白质。6、TBS：成分NaCl,Tris,HCl，用作缓冲液。酶动力反应：P77、P841、磷酸苯二钠：被碱性磷酸酶水解成酚和磷酸盐。2、4-氨基安替比林：与酚在碱性溶液中作用形成红色的醌衍物。3、铁氰化钾：催化酚和4-氨基安替比林反应质粒DNA提取：P9194：*1、溶液I：Tris-Hcl：控制PH。 EDTA：二价金属离子的螯合剂，可抑制Dnase的活性 葡萄糖：提高溶液黏度，防止DNA断裂，比重大，使细菌不易沉淀*2、溶液II：NaOH：溶解细胞 SDS：当溶液III进入时，SDS与K+结合变为PDS，PDS不溶于水沉淀。因SDS可结合2个氨基酸。所以PDS沉淀时使绝大部分蛋白质一起沉淀。*3、溶液III：乙酸钾：提供K+ 冰乙酸：同上*4、TE：含RNase 用于消除RNA（质粒DNA提取提及） 含Tris-HCl, EDTA（基因组DNA的提取）5、饱和酚：使蛋白质变性沉淀6、酚：氯仿，用于萃取酚基因组DNA的提取：P9394*1、蛋白酶K：将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。*2、SDS：破坏细胞的细胞膜、核膜并使组织蛋白和DNA分子分离*3、AR（无水乙醇）：可以使DNA沉淀*4、RNase：可以去除溶液中的RNA5、70%乙醇：用于洗涤质粒DNA沉淀，除去盐分RNA的提取：P100102*1、Trizol试剂：异硫氰酸胍：在溶解细胞时保持RNA完整，使RNA释放，酸性条件下使得RNA与DNA分离苯酚：沉淀蛋白质2、氯仿：使溶液变成三层（RNA/DNA/蛋白质）3、异丙醇：沉淀RNA4、DEPC（焦碳酸二乙酯）：可消除RNase限制性内切酶：1、 DTT（二硫苏糖醇）：还原剂DNA的转化和筛选：P1091101、X-gal：底物2、CaCl2：增加细胞膜的通透性3、甘油：灭菌4、IPTG：诱导剂，让细胞产生更多半乳糖苷酶血清球蛋白提取：P114115*1、半饱和硫酸铵：沉淀球蛋白，使球蛋白和清蛋白分离*2、DEAE纤维素阴离子交换剂：将、球蛋白和球蛋白分离*3、磺基水杨酸：检测蛋白质，白色即有*4、奈氏试剂：检测NH4+，黄色或红棕色即有另外归纳SDS：1、 阴离子去污剂，可以破坏蛋白质分子间以及其他物质分子间的非共价键，使得蛋白质变性解离成单一亚基，形成SDS-蛋白质负离子。（SDS-PAGE）2、破坏细胞的细胞膜、核膜并使组织蛋白和DNA分子分离（基因组DNA的提取）