香菇多糖的研究.doc

香菇菇活性多糖研究的进展
姓名： *** 专业： 食品科学与工程
学号：*** 指导老师：刘璘

摘要
香菇多糖是从香菇的子实体或发酵菌丝体中提取的多糖分子．由于分离方法的差异，所得多糖分子的结构及构效关系亦有很大的不同。目前，研究较多的是具有分支的以8(1—3)糖苷键连接的吡喃葡聚糖，作为免疫激活剂已广泛地应用于抗肿瘤临床实践中．香菇(Lentius edodes)为担子菌纲伞形科真菌，是世界上第2大食用菌。香菇是药食两用菌类， 作为食用菌， 由于其营养丰富， 历来受到人们的爱慕； 作为药物， 由于其具有香菇多糖、 香菇嘌呤、 氨基酸等多种有效成分而倍受药物研究工作者的关注， 特别是其中香菇多糖的抗病毒、 抗肿瘤以及调节免疫功能等作用被发现以后， 其研究更进一步、 更多元化。中医理论认为香菇具有多种功效。香菇多糖是香菇中最重要的一种生物活性物质，作为一种免疫促进剂，在20世纪60年代已引起人们广泛的爱好．现代研究表白：香菇多糖具有抗病毒、抗肿瘤，调节免疫力、降血糖、抗氧化等功能。有关香菇多糖的研究，特别是结构方面的研究已引起国内外学者的高度关注，并有望成为多糖领域的研究热点。
一、 发展史
-----香菇多糖生物活性研究进展
1 　香菇多糖简介及国内外研究概况多糖的来源大体分为植物来源多糖、动物来源多糖、海藻来源多糖和微生物来源多糖即细菌产生的多糖和真菌产生的多糖,这是至今研究得比较详尽的一类多糖。迄今为止,几百种天然多糖的发现,已给人类提供了丰富的生物多聚体宝库。真菌多糖作为药物研究始于50 年代,在60 年代以后成为免疫促进剂而引起人们爱好。香菇多糖就是研究得较透彻的多糖之一, 香菇(Lentinusedodes(Berk. ) Sing) 是侧耳科( Pleurotaceae) 的担子菌,世界名贵食用兼药用菌之一,它具有多种有效药用组分,特别是它具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和刺激干扰素形成等功能的香菇多糖(lentinan 简称LNT) 增强人体免疫力的水溶性木质素这2 种药用生理活性物质,而引起人们广泛的重视。LNT 的药理作用是它并非直接袭击致病源,而是通过刺激免疫细胞成熟、分化和增殖,改善宿主机体
平衡,达成恢复和提高宿主细胞对淋巴因子、激素及其它生理活性因子的反映性。因此,人们常称LNT 为生物反映修饰剂( biologicalresponsemodifier ,BRM) 。
1968 年日本千原吴郎一方面运用热水从香菇子实体中浸提出6 种胞外LNT,1970 年Chihard 和Sasaki 用热水浸提结合有机溶剂沉淀从香菇中提取到此外4 种多糖,80 年代以来,LNT 的研究更为进一步、多元化。如Schulty 从深层发酵香菇菌丝体中提取到一种胞内多糖KS2 ,是一种相对分子质量在(6. 0～9. 5) ×10^4之间,含α链的甘露糖苷,并伴有少量肽类(由丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸构成) 的免疫活性物质。尽管有关LNT 的成分和结构报道甚
多,但已明确结构与免疫活性关系的只有β- 葡聚糖物质。该多糖的一级结构具有β- D(1 →3) 连接的毗喃葡聚糖主链,在主链中葡萄糖的C6 位上具有支点(每5 个D - 葡萄糖有2 个支点) ,其侧链是由β- D(1 →6) 键和β- D(1 →3) 键相连的D - 葡萄糖聚合体组成,在侧链上也具有少数内部β- D (1→6) 键。现己知道:水溶性β- D 葡聚糖为线状结构,无长分枝。另一些香菇中的多糖物质由D - 葡萄糖、D - 半乳糖、D - 甘露糖、L - 阿拉伯糖、D - 木糖所组成,也有来源于深层发酵香菇菌丝体中的α- 甘露糖苷,这也许因提取方法和原料(涉及香菇来源品种及部位) 的不同所致。
　　蛋白质、核酸和多(寡) 糖为最重要的3 种生物大分子。糖类的研究工作和蛋白质、核酸的研究工作相比,在我国还是一个薄弱环节。现在国际上多糖研究以日本、美国、德国、加拿大处在领先地位,我国多糖的研究起步较晚,通过一个相对寂静的时期以后,自80 年代各地的研究如雨后春笋般掀起。目前,国内外己从高等担子菌中筛选到200 余种有生物活性的多糖物质,我国发现有价值的真菌多糖有28 种。其中化学结构较清楚的15 种。国内外研究的重要目的是:一方面通过对LNT 药理和临床实验的研究进一步寻找活性更高,特别是对肿瘤、艾滋病更有效的多糖:另一方面进行构效关系的研究,通过对LNT 化学修饰的研究,以寻找更有效的多糖药物。这将不仅对发现新多糖起指导作用,并且对药物学、分子生物学的理论作出新奉献。
香菇多糖生物活性机制研究前沿
随着分子生物学的发展和香菇多糖研究的不断进一步,科学家们已经开始在基因水平探讨香菇多糖生物活性的机制。香菇多糖在不同品系小鼠中的抗肿瘤活性有较大差异,在DBA/ 2、SWM /MS 和A/J 等小鼠中抗肿瘤活性明显, 而在Balb/ C、C57BL/ 6 和C3H/ HE 等小鼠中则不明显。研究香菇多糖对不同品系小鼠的巨噬细胞分泌细胞毒素及TNF 的影响,也发现香菇多糖的生物活性与基因型有密切关系,巨噬细胞毒素的产生受H2 基因和背景基因的影响,而TNF 的产生则只受H2 基因的影响。交联分析表白, 香菇多糖引起显著的VDH是由多基因调控的,其中优势基因Ltnr3、次要基因Ltnr4、ltnr5、ltnr6 分别定位于第6、9、15 、16 号染色体上,而DTAPP 反映则是由两个隐型基因调控的,Ltnr1、Ltnr2 分别位于第3、11 号染色体上。香菇多糖免疫调节的基因定位无疑为沟通多糖、蛋白质、核酸间的活性调节关系架起一座新桥梁。多糖生物活性与结构间的关系的研究还落后于核酸与蛋白质的研究。有关香菇多糖的成分和结构的报道甚多,但明确和免疫活性有关的只有β- 1 ,3 葡聚糖物质,该多糖的一级结构具有β- D - 1 ,3 吡喃葡聚糖主链,C6 上带有分支侧链,β- 1 ,3和β- 1 ,6结合的侧链共存是抗肿瘤活性所必不可少的。此外,二、三级结构比一级结构更具免疫活性,X衍射和粘度分析发现,香菇多糖的β三维螺旋一旦破坏,免疫活性随之消失。有关多糖受体的发现对阐明其作用机制有重要意义。多糖具有抗原性,可以推测其分子中也存在活性决定簇。对兔进行亚急性免疫可得到anti - LNT - Ab ,该抗体具有辨认LNT 的特异性,不辨认其他多糖如淀粉、葡聚糖等[17 ] ,以此可以方便地用ELISA 方法来检测样品中LNT[18 ] 。anti - LNT - Ab 的研究可为探测香菇多糖受体及其活性决定簇的分子结构基础提供根据。
二、 作用
1 　香菇多糖免疫调节
活性香菇多糖的免疫调节活性是其生物活性的重要基础。香菇多糖是典型的T 细胞激活剂,体内外均能促进细胞毒T 淋巴细胞(CTL) 的产生,提高CTL 的杀伤活力,增强正常或免疫功能低下小鼠的迟发型超敏反映(DTH) ,提高抗体依赖性细胞毒细胞(ADDC) 活性。香菇多糖在体内一方面诱导巨噬细胞产生急相蛋自诱导因子(APPIF) ,随后血清中出现血管膨胀出血诱导因子(VDHIF) 、白细胞介素1 诱导因子( IL1PF) 、IL3 (CSF) 等。这些因子再作用于淋巴细胞、肝细胞、血管内皮细胞等,导致与免疫和炎症有关的许多免疫应答的产生。香菇多糖的抗肿瘤活性能被巨噬细胞拮抗剂所阻抑,因此认为,香菇多糖是一种胸腺依赖型T 细胞导向,并有巨噬细胞参与的免疫调节剂。香菇多糖在体内能激活NK细胞,而体外不能;其激活NK细胞与促进干扰素( IFN) 的分泌有关。香菇多糖受体内给药12 小时后IFN 分泌量可达成高峰。此外,香菇多糖还能激活补体系统,促进抗体生成,使巨噬细胞溶酶体酶和IL1 分泌量增长,而克制巨噬细胞释放PGE、PGF。PGs 是免疫系统克制剂,这是香菇多糖提高机体免疫功能的重要因素。免疫系统是由各种免疫细胞和免疫因子互相促进或克制组成的复杂网络系统。为研究香菇多糖免疫调节活性的触发机制,Oka 等[1 ]设想香菇多糖必须一方面结合到宿主细胞上,通过体外香菇多糖与宿主细胞共培养,流式细胞仪免疫荧光检测,发现多数香菇多糖能结合到人单核细胞上,这种结合作用受antiCR3mAb克制,能被antiCR1mAb 强烈克制,而被antiCR1mAb+ antiCR3mAb 完全克制。体内注射香菇多糖3～4小时,外周血中结合香菇多糖的单核细胞数明显上升,5 小时后又降到低水平。这一过程中未发现结合香菇多糖的中性粒细胞和淋巴细胞。因此认为香菇多糖结合到人单核细胞上也许是其影响免疫系统的首要因素。
2 　香菇多糖抗感染作用
据报道香菇多糖可用于治疗结核杆菌感染,能使耐药性结核病人痰菌转阴,病人外周血嗜中性粒细胞吞噬活性增长。香菇多糖还能延长李司忒氏菌感染小鼠的生存时间,这与其提高巨噬细胞功能有关。香菇多糖对泡状口炎病毒感染引起的小鼠脑炎有显著的治疗和防止作用,治疗组100 %存活而对照组所有死亡。香菇多糖对Abelson 病毒、A2(H2N2) 病毒、12 型腺病毒及流感病毒感染均有克制作用,是治疗各种肝炎特别是慢性迁移型肝炎的良好药物。香菇多糖抗病毒作用与其诱生IFN 和提高NK细胞活性有关。香菇多糖抗感染的机制与多糖自身的特性有关。病原体表面的糖蛋白辨认正常细胞表面的糖分子并发生粘附作用,是引起感染的必要前提。体液中游离的糖分子可以与病毒结合起到屏蔽作用,因此糖分子的干扰也是其抗感染的机制之一。HIV 是日前最难对付的病毒之一。硫酸化香菇多糖具有显著抗HIV 作用,体外10mg/ L 就完全克制HIV 抗原的表达,干扰HIV 对MT4 细胞的侵染,克制合胞体形成;临床使用能协同叠氮胸苷(AZT) 更好地克制HIV 抗原的表达。
3 　香菇多糖的抗肿瘤作用
香菇多糖能有效防止化学性或病毒性肿瘤的发生, 对小鼠S180 实体瘤的克制率可达70 %～100 % ,其中90 %小鼠的肿瘤完全消退; 还能克制化学致癌剂3 甲葱酮的致癌作用,防止小鼠肠溃疡恶化导致的结肠癌的发生。香菇多糖是通过CTL 、MΦ、NK、ADDC、LAK 等细胞发挥抗肿瘤作用的。这与免疫监视学说观点一致,后者认为,机体免疫系统可以通过细胞免疫机制杀灭肿瘤,CTL 、MΦ、NK、ADDC、LAK等细胞组成防治肿瘤的强大细胞免疫体系。香菇多糖在治疗胃癌、结肠癌、肺癌等方面具有良好疗效。作为免疫辅助药物,香菇多糖重要用来克制肿瘤的发生、发展与转移,提高肿瘤对化疗药物的敏感性,改善患者的身体状况,延长其寿命。香菇多糖与化疗剂联合使用有减毒增效的作用,它能通过免疫调节作用或影响一些关键酶的活性,来提高肿瘤对化疗药的敏感性。如谷胱甘肽转移酶( GST) 是帮助肿瘤产生耐药性的关键酶,在顺铂(CDDP) 克制小鼠结肠26 肿瘤的实验中,LNT + CDDP 组的抑瘤率显著高于单独用CDDP 组或对照组,而GST酶活显著低于对照组,说明香菇多糖提高肿瘤对CDDP 的敏感性,与影响GST 活性有关。嘧啶核苷磷酸酶能催化5DFU R 生成5FU ,该酶可被肿瘤细胞中多种细胞因子诱导。香菇多糖与5DFU R 联合用药能显著提高后者对AH66肿瘤的克制率;香菇多糖组的该酶活性显著高于对照组;联合用药组肿瘤产生的肿瘤坏死因子(TNF) 和肿瘤生长因子(TGF) 显著少于对照组。表白香菇多糖能特异性诱导肿瘤中嘧啶核苷磷酸酶活性, 提高肿瘤对5DFU R 的敏感性。

三、 提取与分离。
1 　材料与方法
材料　实验材料: 干香菇。实验试剂; 氯仿、正丁醇、乙醇、甲醇、NaCl 、葡萄糖甘露糖、木糖、乙醚等均为分析纯。
原料的解决: 粉碎法。具体分三种情况,一是将原料粉碎成可过80 目的筛子; 二是将原料粉碎成直径为2 - 3mm的颗粒; 三是不粉碎。
加水量的选择: 设加水量分别为: 原料/ 无离子水(W/ W) = 1∶10 , 1∶15 , 1∶20 , 1∶25 , 1∶30。按上述比例分别进行蒸煮。
蒸煮温度的选择: 设蒸煮温度分别为85 ,96 , 105 , 120 ℃。其中, 前两个温度蒸煮3 - 5hrs ,后两温度个蒸煮40 -80Mins。
蒸煮物的过滤: 采用压滤法。
滤液的浓缩: 采用热浓法。将滤液倒入浓缩锅中, 在92 - 94 ℃条件下加热, 直至滤液的体积降为本来的1/ 4 —1/ 5 为止。
多糖的沉淀与脱色: 采用乙醇法。向浓缩液中加入95 - 99 %的乙醇至50 , 60 , 70 , 80 %饱和度。
多糖中的蛋白质杂质的去除: 采用BECM法。即将正丁醇、乙醇、氯仿、甲醇、NaCl 按一定比例混制成一种特殊的试剂, 然后加到多糖溶液中。搅拌20 - 30Mins 后静置6 - 10hrs。
多糖的分级纯化: 用甲醇分级沉淀法。向多糖溶液中分别加入一定比例的甲醇, 3 000rpm 离心15mins。将分级的样品分别测其比旋, 并用酸完全水解, 作纸层析。
多糖的干燥: 分别采用自然干燥法, 高温烘干法和冻干法三种方法。自然干燥法的条件是25 ℃96hrs ; 高温烘干法采用70 ℃48hrs 和105 ℃16hrs ; 冻干法为真空度20 - 50pa 下干燥18 - 22hrs。
多糖总量测定: 采用苯酚———硫酸法
(9) 。以葡萄糖为标准品。
工艺流程: 原料→烘干→粉碎→称重→调配→热水抽提→过滤→滤液→脱色→醇析→复溶→去除杂蛋白→分级沉淀→香菇多糖→干燥。
2 　结果与讨论
较佳的粉碎度　不同粉碎度的实验结果表白,以粒径为2 - 3mm的香菇颗粒为好。较细的颗粒虽然有助于多糖的浸出, 但给后面的分离过滤导致困难, 使粗多糖溶液大量流失, 因此最后得率并不高; 整块香菇子实体不经粉碎直接进行蒸煮抽提,虽然不存在过滤问题, 但是香菇子实体体积太大,不利于多糖的浸出, 因此效果不及粒径为2 - 3mm的香菇颗粒子.
较适的加水量　不同加水量的实验结果表白,原料/ 无离子水(W/ W) = 1∶20～1∶25 为好。若加水过少, 在没有达成最佳蒸煮时间之前, 浸出液已经变得很少, 甚至糊锅, 从而影响多糖得率; 若加水过多, 则浸出液过多, 不利于以后的分离浓缩。
适宜的蒸煮温度　不同蒸煮温度的实验结果表白, 在96 ℃条件下蒸煮3～4hrs , 可以达成较高的多糖得率。温度过低(85 ℃) , 溶剂的渗透能力和溶解能力减少, 使多糖不能有效的溶出; 温度过高(100 ℃以上) 导致多糖的裂解, 使多糖得率大大减少。.
醇析作用对多糖得率的影响　取一定量的多糖浸提液分装于4支试管中, 并依次加入无水乙醇,直至乙醇浓度分别为50 %、60 %、70 %、80 % , 放置一定期间后, 离心收集沉淀并烘干称重, 乙醇终浓度在70 %左右时效果最佳, 经醇析后沉淀即为多糖粗品。
215 　多糖粗品中的蛋白质杂质的去除　BECM法脱蛋白的结果表白, 杂蛋白的去除率为99.198%。BECM法不仅杂蛋白的去除率高, 并且工艺简朴,无需大的动力和设备, 大大减少了运转成本。
216 　多糖的分级纯化　用甲醇分级沉淀法可将去除杂蛋白的多糖分为L1 , L2 , L3 三个级分, 分别测其比旋, 并用酸完全水解L1 , L2 , L3 , 作纸层析结合苯酚———硫酸法的测定结果表白, L1 , L2 ,L3 的葡聚糖含量分别为68.109%，79.125%, 100 %。
217 　多糖的干燥　多糖的干燥方法虽有多种, 如自然干燥法, 高温烘干法, 真空低温冷冻干燥法等, 但自然干燥法耗时太长且干燥不彻底。而高温烘干法中70 ℃48hrs 的条件下, 不仅耗时仍较长,并且有部分多糖被降解; 105 ℃16hrs 这样的条件下, 虽然干燥很彻底, 但多糖降解严重。真空低温冷冻干燥法虽然能耗较多, 但条件温和, 应是制备有活性生化制品的有效方法。
四、 结论
香菇素以色、香、味俱佳而著称, 堪称食用菌中的上品。近几十年来的研究发现, 香菇中具有一种能治疗癌症, 抗恶性肿瘤, 抗病毒, 抗感染, 提高人体免疫力等多种生理功能的物质———香菇多糖。医学研究证明, 它是通过刺激机体的免疫系统使机体的免疫功能得到恢复和提高, 由机体自身的抵抗力去杀死肿瘤细胞。它的作用是间接的, 所以毒副作用小, 在各类抗癌药物中, 它被认为是毒副作用可以忽略不计, 剂量低, 疗效好的天然的抱负药物。香菇多糖1969 年在日本一方面发现, 关于其抗恶性肿瘤, 抗病毒, 抗感染等生理功能的报道已不少, 关于运用多种原料发酵法生产香菇多糖的研究也时有报道, 至于如何获得纯净的香菇多糖则所见报道不多。由于文献所介绍的方法因工艺复杂, 收率低, 而使成本高, 售价高达60 美元/ mg , 普通肿瘤病人无法接受。
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