浙江大学生物化学丙实验报告3、4.doc

专业： 农业资源与环境
姓名： 李佳怡
学号： 3130100246
日期： 2015.5. 26
地点： 生物实验中心310
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实验报告

课程名称： 生物化学实验（丙） 指导老师： 方祥年 成绩：__________________
实验名称： 蔗糖酶蛋白含量的测定、蔗糖酶活力测定及其分离纯化效果的评价
同组学生姓名： 金宇尊、鲍其琛、袁平、朱耀仁、蔡玉林
一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填）
三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填）
五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理
七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得
一、实验目的和要求
1、蔗糖酶蛋白含量的测定——Folin-酚法
①学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法；
②掌握分光光度法制作标准曲线，准确测定未知样品的蛋白质含量；
③掌握分光光度计的使用方法。
2、 蔗糖酶活力测定——3.5－二硝基水杨酸法
①掌握酶活力测定的基本原理和方法；
②学习酶的比活力的计算。
二、 实验内容和原理
1、 Folin-酚测定法
Folin-酚试剂是由甲、乙两种试剂组成的。甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜和酒石酸钾钠组成，在碱性条件下蛋白质中的肽键与酒石酸钾钠铜盐起作用，生成紫红色络合物；乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成，在碱性条件下，铜-蛋白质络合物以及蛋白质中的酪氨酸残基（酚基）和色氨酸还原磷钼酸-磷钨酸试剂（乙试剂）产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物），其色泽深浅与蛋白质含量成正比。可用500nm波长比色测定，适于测定蛋白质含量0.05～0.5g/L。
优点： 简单、迅速、灵敏度高；反应较稳定。
缺点： 该反应受多种因素的干扰。
2、 蔗糖酶活力测定
蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗糖）的1,2－糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。因此，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol还原糖。还原糖的测定有多种方法，例如：纳尔逊－索模吉试剂比色法，斐林试剂法等。
本实验采用3.5－二硝基水杨酸法测定还原糖的含量，由此可得出蔗糖酶水解速度。其原理是3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。因此可利用分光光度计在520nm进行比色测定，求得样品中的含糖量。此法操作简便、迅速、杂质干扰较小。
3、蔗糖酶活力单位(u)：
蔗糖酶在室温(25℃）, pH4.5的条件下，每分钟水解产生1μmol葡萄糖所需的酶量(ml)。
4、蔗糖酶比活力的计算：
酶的比活力——为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用酶活力单位/mg蛋白质表示。
酶的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，是表示酶的纯度高低的一个重要指标。
比活力＝活力单位/mg蛋白
三、 实验材料与试剂
1、实验材料
蔗糖酶提取的各步分离纯化样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。
2、实验试剂
①标准蛋白质溶液：0.5g/L牛血清白蛋白
② Folin-酚试剂（甲试剂；乙试剂）
③ 1g/L葡萄糖标准溶液(葡萄糖相对分子量180.16）；
④0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5；
⑤ 5％蔗糖溶液；
⑥ 3,5－二硝基水杨酸试剂；
甲液：溶解6.9g 结晶酚于15.2ml 10％NaOH溶液中，并用水稀释至69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。
乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH溶液中，再加入800ml 1%3,5-二硝基水杨酸溶液.
甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备用,在室温放置7-10天以后使用。
四、实验器材与仪器
1、 蔗糖酶蛋白含量的测定——Folin-酚法
①试管、试管架以及离心管（7ml）、离心管架；
②移液管（1ml、2ml、5ml）；
③微量移液枪（200μl,1000μl）及枪头;
④可见光分光光度计及1cm玻璃比色皿；
⑤恒温水浴箱(25℃）。
2、蔗糖酶活力测定——3.5－二硝基水杨酸法
①试管、试管架以及离心管（7ml)和离心管架；
②移液管（1ml、2ml、10ml)；
③微量移液枪（200μl,1000μl）及枪头;
④恒温水浴（25℃、100℃）；
⑤可见光分光光度计、1cm玻璃比色皿；
五、 操作方法和实验步骤
1、 蔗糖酶蛋白含量的测定——Folin-酚法
①制备Folin-酚法蛋白质标准曲线
取6支试管，编号1－6，按表1顺序依次加入各种试剂，并在分光光度计于500nm处测定光吸收值（A500nm值）。
②各步分离纯化的蔗糖酶蛋白测定
由于蔗糖酶提取、分离纯化的各个样品的蔗糖酶蛋白质含量较高，因此在测蔗糖酶提取分离纯化样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、 Ⅳ的蔗糖酶蛋白质含量以前，可根据各样品溶液的蔗糖酶蛋白质含量高低不同作适当的稀释，以测定蔗糖酶蛋白质含量,A500nm值在蛋白质含量标准曲线范围以内为宜。
取13支试管，编号1～13，按表2依次加入各种试剂，并在分光光度计于500nm处测定光吸收值（A500nm值）。
注：加入Folin-酚乙试剂后，要迅速混匀（加一管混匀一管），使还原反应产生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。
③绘制标准曲线并计算
⑴ 绘制标准曲线：
以光吸收值（A500nm）为纵坐标，标准蛋白质含量（mg/L）为横坐标，在坐标纸上绘制蛋白质标准曲线。
⑵ 计算：
蔗糖酶提取分离纯化的样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、 Ⅳ稀释溶液的光吸收值（A500nm），根据蛋白质标准曲线得蔗糖酶蛋白含量，再进行样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、 Ⅳ溶液的最终蔗糖酶蛋白含量的计算。
2、蔗糖酶活力测定——3.5－二硝基水杨酸法
①标准曲线的制作
按表3加操作，后以还原糖（mg数或μmol数 ）为横坐标，A520值为纵坐标，制作葡萄糖浓度－吸光值标准曲线。
②蔗糖酶的酶活力测定
按照表4加样，在520nm处测定吸光度。
六、 实验数据记录和处理
表1
试管号
1
2
3
4
5
6
0.5g/L标准蛋白质溶液（ml）
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
蒸馏水 （ml）
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
Folin-酚试剂甲 （ml）
5
5
5
5
5
5

混匀，在室温(25℃）下静置10 min
Folin-酚试剂乙 （ml）
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5

混匀，在室温下静置20min
A500nm
0
0.136
0.260
0.372
0.493
0.580
表2
样品
空白
I(稀释25倍)
Ⅱ(稀释10倍)
I(稀释5倍)
Ⅳ(原液)
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
样品液V(ml)
0.0
0.05
0.2
0.5
0.05
0.2
0.5
0.05
0.2
0.5
0.05
0.2
0.5
水(ml)
1.0
0.95
0.8
0.5
0.95
0.8
0.5
0.95
0.8
0.5
0.95
0.8
0.5
Folin－酚甲试剂(ml)

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

混匀后，室温（25 ℃ ）放置10分钟
Folin－酚乙试剂(ml)

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

混匀后，室温（25 ℃ ）放置20分钟
A500nm
0
0.164
0.090
0.112
0.103
0.206
0.643
0.051
0.661
1.418
0.075
0.228
0.633
表3

1
2
3
4
5
6
7
1g/L葡萄糖标准溶液（ml）
0.00
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
H2O （ml）
2.0
1.80
1.70
1.60
1.50
1.40
1.30
3.5－二硝基水杨酸 (ml)
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
将各管溶液混匀后，在100℃恒温水浴加热5分钟，取出立即用冷水冷却至室温
H2O（ml）
7
7
7
7
7
7
7
将各管溶液混匀
A520
0
0.128
0.069
0.137
0.440
0.643
0.815
表4
样品
空白
I(稀释200倍)
Ⅱ(稀释100倍)
I(稀释50倍)
Ⅳ(稀释25倍)
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
0.2mol/L乙酸缓冲液(ml)

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5
H2O(ml)
1.0
0.95
0.8
0.5
0.95
0.8
0.5
0.95
0.8
0.5
0.95
0.8
0.5
蔗糖酶液(ml)

0

0.05

0.2

0.5

0.05

0.2

0.5

0.05

0.2

0.5

0.05

0.2

0.5
5％蔗糖溶液 (ml)

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5
保温时间
立即混匀后，室温（25 ℃ ）保温10分钟（准确）
3.5－二硝基水杨酸试剂 (ml)

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

在100℃恒温水浴中加热5分钟
蒸馏水
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7

混匀
A520nm
0
0.025
0.304
0.978
0.028
0.349
1.727
0.866
>2.0
>2.0
0.014
0.030
0.223
七、 实验结果与分析
1、蛋白质含量标准曲线
由表2可得：
编号
1
2
3
4
5
6
标准蛋白质含（mg/L）
0
15.38
30.77
46.15
61.54
76.92
A500nm
0
0.136
0.260
0.372
0.493
0.580
由此得蛋白质含量标准曲线：
（1）在做标准曲线和样品曲线时，均应在加入乙试剂后要迅速混匀（加一管混匀一管），使还原反应产生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前,以防出现错误的实验结果。
（2）因为参照液蛋白质含量为0，所以标准曲线趋势线须过原点，即截距为零。所得R平方数为0.9944，较接近1，说明实验较为成功。
（3）蛋白质标准曲线的微小偏差可能来自于加入试剂后的局部未混匀以及添加试剂时的微小损失等。
2、样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、 Ⅳ溶液的最终蔗糖酶蛋白含量
将表2中的数据带入上述蛋白质含量标准曲线，可计算得：
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
稀释酶液蛋白质含量（mg）
0
0.135
0.074
0.092
0.085
0.169
0.529
0.042
0.544
1.167
0.062
0.188
0.521
稀释酶液蛋白质量平均含量（mg/mL）

0

2.7

0.37

0.184

1.7

0.845

1.058

0.84

2.72

2.334

1.24

4.09

1.042
原酶液蛋白质平均含量（mg/mL）

0

27.12

12.01

9.82

6.37
由表中数据可知，从样品I到样品IV，样品中蛋白质含量呈减少趋势，这说明，随着离心，乙醇沉淀，离子交换柱层析等纯化步骤的进行，杂蛋白在逐步被分离，蔗糖酶的含量在逐渐增多，即蔗糖酶的纯度在逐渐增高。
3、 葡萄糖标准曲线
由表3处理可得
编号
1
2
3
4
5
6
7
还原糖（mg）
0
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
A520
0
0.128
0.069
0.137
0.440
0.643
0.815
由此得葡萄糖标准曲线
（1）葡萄糖浓度-吸光值标准曲线的R平方为0.9953，跟1比较接近，说明我们在测定葡萄糖浓度-吸光值标准曲线的时候操作基本正确，没有出现较大的误差。微小误差的产生可能是在试剂转移或者反应时间方面有误差。
（2）尽管1号试管本身也有一定值的吸光度，但是因为将1号试管作为参照，所以将其吸光度视为0.为保证理论的正确性，使趋势线经过原点。
4、各步提取液酶活力测定
将表4数据代入上述葡萄糖标准曲线可得
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
稀释酶液葡萄糖含量（mg）
0
0.019
0.237
0.761
0.022
0.272
1.345
0.674
>1.557
>1.557
0.011
0.023
0.174
稀释酶液葡萄糖含量（umol）
0
0.105
1.316
4.224
0.122
1.510
7.466
3.741
>8.642
>8.642
0.061
0.128
0.966
蔗糖酶原液酶活力单位(u/mL)

0
41.999
131.600
168.960
24.402
75.500
149.320
374.100
>216.05
>86.42
3.050
1.600
4.830
5、蔗糖酶各步纯化样品的纯度比较

体 积(ml)
蛋白浓度(mg/ml)
总蛋白(mg)
活 力(u/ml)
总活力（u）
比活力u/mg
样品1
29.8
27.12
808.176
114.186
3402.743
4.210
样品2
26.8
12.01
321.868
83.074
2226.383
6.917
样品3
15.2
9.82
149.264
225.523
3427.955
22.966
样品4
9.7
6.37
61.789
3.160
30.652
0.496
总体蛋白质呈下降趋势，活力应呈上升趋势。因为杂质蛋白被除去，蔗糖酶纯度提高。我组实验总体上符合该趋势说明大致实验操作准确无误。但是在样品Ⅳ时，出现活力及比活力大幅度下降这一不正常现象。本次试验我们组用的是另外组的样品，参照他们之前得出的色谱图和试验情况，分析造成这一现象的原因可能为：
另外一组的同学在做实验之前，不小心将保存样品4的离心管打翻，造成了大量样品的损失，后来为了保证样品量足够，对其进行了稀释，使其浓度下降，从而导致蔗糖酶活力、比活力等的下降，并且由于未记录稀释倍数，故无法计算原有样品的酶活力，造成样品4活力显著低于前三个样品。
八、 讨论、心得
①由于一开始做出结果颜色过深，活性过大，我们组稀释倍数较大。
②酶活力测定时，要控制好反应时间，各管的酶反应时间一定要一致，否则会影响整体结果；加各反应试剂的体积一定要准确且不能加错，否则将无法得到理想结果。
③本实验结果不是很理想，因为本次实验的结果与前面两次实验的操作密切相关，所以可能是因为前面两次实验中的操作不当。如可能是第一步时碾压不够，得出的样品一量较少，以及分离时操作不当，使得样品二含量也较少，还有离子交换柱制备时可能存在问题，使一部分蔗糖酶没能够分离出来，还有本次实验中可能实验时间控制的不够准确，造成结果的偏差。
④缺乏小组成员之间的沟通。我们在做实验之前并不知道另一小组的同学把样品打翻了，如果知道的话就应该用我们组的样品。所以在实验前和实验过程中能够好好沟通，就不会造成实验结果的不正常现象。
⑤在实验中应注意：1）酶活力测定时，要控制好反应时间，各管的酶反应时间一定要一致，否则会影响整体结果；2）加各反应试剂的体积一定要准确，否则也会影响最终结果。3）加入Folin-酚乙试剂后，要迅速混匀（加一管混匀一管），使还原反应产生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。
⑥使用分光光度计时应注意波长的设置，以免发生测完之后发现波长设置错误的问题。
⑦本实验的主要操作是各种溶液的取用以及酶液的稀释，每管各种溶液的取用量都不同，且不同组的稀释倍数不同，因此取用时应特别注意，防止取错溶液或取量不对，还要注意不要加错试管等。如果在配制出现加错等情况，应重新配置。
⑧本实验结果分析中，制作标准曲线时，采用了图像过原点的趋势线，以保证理论上的正确性。
⑨本实验步骤较繁琐，三个人应该明确分工，有条不紊，这样才可以做到高效的完成实验。