结核分枝杆菌Rv0081基因编码蛋白的生物信息学分析.pdf

基金项目:云南省地方本科高校联合专项面上项目()大理大学高层次人才资助项目()大理大学临床分子免疫学创新团队项目()作者简介:杨雨婷 女 硕士研究生 研究方向为感染免疫:.通讯作者 男讲师硕士生导师 研究方向为感染免疫:.收稿日期:结核分枝杆菌 基因编码蛋白的生物信息学分析杨雨婷 杨国平(.大理大学 基础医学院医学微生物学及免疫学教研室云南 大理.大理大学 云南省昆虫生物医药研发重点实验室云南 大理)摘 要 运用生物信息学分析软件预测结核分枝杆菌()蛋白的生物学特征及筛选潜在的优势抗原表位 从 数据库获取 蛋白的氨基酸序列利用生物信息学分析软件、及 分析 蛋白的理化性质及亲疏水性、.预测蛋白的跨膜区及信号肽.、.分别预测蛋白的糖基化位点及磷酸化位点 预测能与 相互作用的蛋白分别运用、预测蛋白的二、三级结构综合运用、预测蛋白的亚细胞定位运用 预测蛋白的 细胞抗原表位综合运用、.、.预测蛋白的 细胞抗原表位综合运用、.预测蛋白的 细胞抗原表位 结果表明 蛋白由 个氨基酸组成相对分子质量为 .亚细胞定位于细胞质中为稳定的疏水性蛋白无跨膜区和信号肽含有 个糖基化位点及 个磷酸化位点二级结构主要由 螺旋和无规则卷曲构成结构较松散与、及 蛋白存在相互作用关系综合分析各软件预测结果筛选出 个优势 细胞抗原表位、个优势 细胞抗原表位及 个优势 细胞抗原表位 蛋白具有较多潜在的候选、细胞抗原表位可作为研发新型结核疫苗的候选抗原关键词 结核分枝杆菌 蛋白生物信息学抗原表位疫苗中图分类号.文献标识码 文章编号 ():./.(.)().微生物学杂志 年 月第 卷 第 期 .结核病是由结核分枝杆菌()感染引起的危害人类健康的慢性传染病是全球十大致死原因之一 最新结核病流行病学报告指出每年约有 万人感染 万人死于结核病且全球约有 亿人口为 潜伏感染者 近年来由于 合并感染、耐药菌株的产生及卡介苗预防效果不佳等原因结核病的发病率明显上升结核病的防治面临着巨大挑战 因此开发安全、高效的新型结核疫苗对控制 在全球范围内的流行具有重要意义 以蛋白抗原表位为基础合成的多肽疫苗可通过提供大量特异性抗原精确启动高效的保护性体液免疫和细胞免疫且易于生产、储存产生的副作用较小 因此对 蛋白的抗原表位进行预测并对所预测结果进行综合分析从而筛选出优势抗原表位将为新型结核疫苗的研制奠定坚实的理论基础 休眠生存调节因子()通过调节约 个休眠相关基因的表达而使 进入休眠状态与 潜伏感染密切相关 基因是 调节系统中一个重要的转录调节因子其编码的 蛋白参与 在低氧等应激条件下的存活是 进入休眠状态的标志性抗原 研究发现 蛋白可通过促进全血细胞分泌干扰素()、白介素()等细胞因子启动机体的适应性免疫反应还可促进全血细胞分泌具有抗菌效应的促炎因子如肿瘤坏死因子()、等发挥抗 感染作用表明该蛋白具有一定的免疫原性有可能成为预防及诊断 潜伏感染的潜在靶点 本研究应用多种生物信息学分析软件对 蛋白的生物学特征及抗原表位进行预测为今后深入系统的分析 蛋白的免疫特性及研发新型结核疫苗提供参考 材料与方法.材料 蛋白的生物信息学分析所用分析软件及网址见表.方法.蛋白氨基酸序列的获取从 网站获取 蛋白的氨基酸序列(.)该蛋白含 个氨基酸 经 比对该蛋白氨基酸序列与卡介苗菌株中的 蛋白氨基酸序列同源性为.蛋白的理化性质分析 运用生物信息 学 分 析 软 件 中 的 及 对蛋白的理化性质如氨基酸数目、消光系数、等电点、半衰期、不稳定系数及亲疏水性进行分析.跨膜区、信号肽及亚细胞定位预测、.预测蛋白的跨膜区及信号肽综合运用 及 分析蛋白的亚细胞定位.蛋白的结构预测使用、及 分别预测蛋白的二、三级结构.蛋白糖基化及磷酸化位点的预测 利用在线软件.及.预测蛋白糖基化及磷酸化位点 微 生 物 学 杂 志 卷表 蛋白的生物信息学分析相关软件 分析内容 分析软件软件网址氨基酸序列获取:/./理化性质:/./亲疏水性:/./跨膜区.:/./.?.信号肽.:/./.?.亚细胞定位:/./.?亚细胞定位:/./二级结构:/./.?.三级结构:/./磷酸化位点.:/./.?.糖基化位点.:/./.?.相互作用蛋白:/./?细胞表位 为 无相应网址 细胞表位:/././.细胞表位.:/./.?.细胞表位.:/./.?.细胞表位:/././.细胞表位.:/./.?.蛋白抗原表位的预测分析 运用 预测蛋白的 细胞抗原表位综合分析蛋白的理化性质、二级结构、表面可及性、柔韧性及抗原指数筛选出优势 细胞抗原表位 运用、.、.预测蛋白的 细胞抗原表位 及 .预测蛋白的 细胞抗原表位综合分析各软件预测结果筛选出评分均较高的氨基酸序列作为优势 及 细胞抗原表位 结果与分析.蛋白的理化性质生物信息学分析结果显示 蛋白分子式为 相对分子质量为 .理论等电点为.主要由亮氨酸(.)、丙氨酸(.)及精氨酸(.)组成 序列中带正电荷的氨基酸残基数为(精氨酸 赖氨酸)个带负电荷的氨基酸残基数为(天冬氨酸 谷氨酸)个原子总量为 在 处消光系数为 不稳定系数为.小于 表明该蛋白在体外为稳定蛋白质 在哺乳动物体外半衰期为 在酵母菌体内半衰期 在大肠埃希菌体内的半衰期 满足原核表达系统的表达条件可在体外诱导表达 蛋白 亲疏水性预测结果显示该蛋白序列总平均亲水性为.序列中位 于 位 的 色 氨 酸()亲 水 性 最 强 为 位于 位的丙氨酸()疏水性最强为 预测结果与 基本一致预测该蛋白为疏水性蛋白(图)提示该蛋白可能以包涵体形式存在于细菌裂解液中后期可通过大肠埃希菌原核表达系统对该蛋白存在形式进行验证图 蛋白的亲疏水性分析.期 杨雨婷等:结核分枝杆菌 基因编码蛋白的生物信息学分析 .蛋白的跨膜区、信号肽及亚细胞定位使用 及.在线软件分别对 蛋白的跨膜结构、信号肽进行预测结果显示该蛋白具有胞内域及胞外域两个部分无跨膜结构(图)无信号肽(图)提示该蛋白属于非分泌型蛋白该蛋白进入宿主细胞发挥调控作用需借助非经典途径 综合分析 及 亚细胞定位预测结果预测该蛋白存在于细胞质中图 蛋白跨膜区及信号肽.:蛋白跨膜区预测:蛋白信号肽预测:.蛋白结构分析运 用、对 蛋白的二、三级结构进行预测结果显示 蛋 白 的 二 级 结 构 由 个 螺 旋()、个 转角(.)、个无规则卷曲(.)及 个延伸链(.)构成(图)与 预测结果基本一致三级结构预测结果显示该蛋白含有大量的螺旋及无规则图 蛋白二级结构预测.蓝色为 螺旋绿色为 转角紫色为无规则卷曲红色为延伸链 微 生 物 学 杂 志 卷卷曲(图)与二级结构预测结果一致 由于 螺旋、转角及无规则卷曲易于扭曲、折叠较易形成与 细胞表面受体()嵌合的结构而该蛋白存在较多上述结构提示该蛋白可能存在较多 细胞抗原表位.蛋白糖基化及磷酸化位点分析蛋白的糖基化及磷酸化修饰是重要的蛋白质翻译后修饰可通过影响蛋白质的电荷状态、疏水性、构象及稳定性而影响其功能.分析结果显示 蛋白在第 位有一个糖基化位点(图).分析结果显示 蛋白共存在 个氨基酸磷酸化位点其中含个丝氨酸磷酸化位点及个酪氨酸磷酸化位点(图)提示该蛋白可能参与细胞间的信号转导从而调控宿主细胞的功能图 蛋白三级结构预测.图 蛋白糖基及磷酸化位点预测.:蛋白糖基化位点预测:蛋白磷酸化位点预测:.与 相互作用蛋白的预测运用 数据库预测能与 相互作用的蛋白结果显示与 相互作用的 个蛋白评分从高到低为、(图)通过分析 的相互作用蛋白预测 蛋白可通过与 样受体()结合刺激巨噬细胞和外周血单核细胞分泌、等细胞因子参与肉芽肿的形成及维持减少 的生长从而控制 在机体内的复制及传播此外该蛋白还可能与抑制蛋白质合成有关并参与 期 杨雨婷等:结核分枝杆菌 基因编码蛋白的生物信息学分析 氧化还原反应 提示该蛋白可能能增强巨噬细胞的抗菌效应可作为研发新型多肽疫苗的候选抗原图 蛋白相互作用网络.蛋白抗原表位预测抗原表位是抗原分子上能与、细胞特异性结合并刺激其产生能特异性识别该抗原的致敏淋巴细胞及抗体的免疫活性区对蛋白抗原表位进行深入研究并筛选出优势抗原表位对研发新型结核疫苗及开发高效诊断试剂具有重要意义本研究运用、.、.、.等生物信息分析软件对 蛋白、细胞抗原表位进行预测综合分析后筛选出优势抗原表位.细胞抗原表位预测 分析结果显示 蛋白氨基酸存在于表面可能性较大的区域为 、位氨基酸残基其余位置存在于蛋白表面可能性较小蛋白柔韧性较大易与 细胞表面抗原受体结合形成表位可能性较大的区域为 、位氨基酸残基 预测该蛋白共有 个 细胞抗原表位:、位氨基酸残基(图)综合分析 蛋白的二级结构(螺旋、转角及无规则卷曲)、亲水性、柔韧性、表面可及性及抗原指数筛选出 个优势 细胞抗原表位:、位氨基酸残基(表)提示该蛋白可启动机体的体液免疫反应表 蛋白优势 细胞抗原表位信息 序号起始氨基酸位置表位序列图 蛋白 细胞抗原表位预测.微 生 物 学 杂 志 卷.细胞抗原表位预测综合分析多款软件预测结果可以弥补不同软件在预测过程中的缺陷提高预测结果的准确性因此本研究运用 种不同的 表位分析软件预测 蛋白、三种类型的 抗原表位(表)综合分析三种预测结果后筛选出 个优势 细胞抗原表位(表)提示该蛋白可启动由 介导的 型细胞免疫反应 细 胞 抗 原 表 位 预 测 运 用、软 件 预 测 蛋白 、限制性 细胞表位(表)筛选出 .预测的强结合表位且 得分较高的序列作为 细胞优势抗原表位(表)提示该蛋白可启动由 介导的 型细胞免疫反应表 蛋白 细胞抗原表位预测 表型分类表位数()/个.表位数(.)/个 .表位数(./)/个 个强结合位点 个弱结合位点 个强结合位点 个弱结合位点 个强结合位点 个弱结合位点表 蛋白优势 细胞抗原表位信息 表型分类起始氨基酸位置表位序列()().().表 蛋白 细胞抗原表位预测 表型分类表位数()/个.表位数(/)/个 个强结合位点 个弱结合位点 个强结合位点 个弱结合位点 个强结合位点 个弱结合位点 个强结合位点 个弱结合位点 个弱结合位点表 蛋白优势 细胞抗原表位信息 表型分类起始氨基酸位置表位序列().().注:表示强结合位点 期 杨雨婷等:结核分枝杆菌 基因编码蛋白的生物信息学分析 讨 论由 感染引起的结核病是严重危害人类健康的全球性公共卫生问题 目前全球约有/人口为 潜伏感染者其体内潜伏期 的重新激活是结核病的重要来源 因此识别潜在的 潜伏相关抗原以产生抵御潜伏期 的保护性免疫反应对于设计有效的新型结核疫苗至关重要生物信息学是由生物学、计算机科学、应用数学等学科相互交叉融合而成的一门新兴学科基于生物信息学分析工具从全基因水平筛选具有保护性免疫反应的候选抗原表位的反向疫苗学已被广泛运用于新型多肽疫苗的研发 本研究运用生物信息学技术对 潜伏期相关抗原 蛋白的生物学特征及表面抗原进行预测分析结果显示 蛋白为稳定的疏水性蛋白、无跨膜区及信号肽含有 个糖基化位点及 个磷酸化位点提示该蛋白属于非分泌型蛋白可能参与细胞间的信号转导该蛋白能与、及 等蛋白产生相互作用可能与抑制蛋白质合成及氧化还原反应有关还可通过与巨噬细胞和外周血单核细胞表面的 结合刺激细胞产生、和 等细胞因子增强机体的抗 感染作用其二级结构主要由 螺旋(.)、转角(.)和无规则卷曲(.)构成提示该蛋白可能含有较多能与 细胞表面受体相结合的抗原表位表面可及性及柔韧性分析结果显示 蛋白中可能存在于蛋白表面、易发生扭曲和折叠的氨基酸序列较少形成 细胞抗原表位的可能性较小 为提高表位预测的特异性、准确性和适用性本研究综合分析 蛋白的亲水性、表面可及性、柔韧性、抗原指数及二级结构并筛选出 个各软件评分均较高且存在于无规则卷曲及 转角中的氨基酸序列作为 细胞优势抗原表位:、位氨基酸残基 属 于 胞 内 寄 生 菌 感 染 早 期 主 要 由细胞介导的 型辅助性 细胞()型免疫反应发挥抗感染作用感染晚期主要由 细胞和自然杀伤细胞发挥细胞毒作用杀灭吞噬 的巨噬细胞启动由 细胞介导的适应性免疫反应是防御 感染的重要途径 研究表明蛋白质抗原不能通过其完整的分子发挥功能而是通过其表位分子反映抗原特异性 细胞表位是触发表位特异性保护性 细胞免疫反应的基础也是研发和设计新型结核疫苗、诊断试剂和治疗药物的关键 联合应用多个 限制性表位可诱导针对不同 基因位点的 细胞免疫反应拓宽免疫反应人群、是最常见的 类分子与蛋白表面抗原结合后启动机体细胞毒性 淋巴细胞()型免疫反应 本研究运用 种不同的 表位预测软件对 蛋白的、表位进行预测综合分析各软件预测结果后筛选出 个优势 细胞抗原表位:、位氨基酸残基、及 是最常见且研究较为广泛的 类分子与抗原表位结合后启动 型免疫反应 本研究运用、.预测 蛋白的 细胞表位综合分析两个软件预测结果后筛选出评分均较高的序列作为优势抗原表位共筛选出 个优势 细胞抗原表位:、位氨基酸残基本研究结果表明理论分子量为 .的 蛋白为稳定蛋白质可在体外诱导表达且含有多个潜在的、细胞抗原表位其中 位氨基酸残基为 细胞及 细胞共同优势抗原表位 及 位氨基酸残基为 细胞及 细胞共同优势抗原表位、位氨基酸残基为 细胞及 细胞共同优势抗原表位以这些共同表位为基础合成的多肽疫苗可同时启动机体的体液免疫及细胞免疫还可对不同感染阶段的 进行杀伤从而更好地控制 在体内的存活 这些结果共同表明 蛋白可作为研发预防潜伏期 重新激活的新型结核疫苗的候选优势抗原 今后 微 生 物 学 杂 志 卷将通过免疫实验(如)进一步验证所筛选出的优势抗原表位为新型结核疫苗的研制提供参考参考文献:.():.():.():.():.:.():.():.:./.:.:.():.:.:.():.:.():.():.():.:.():.():.():.:.():.:.刘田 万李 周勇等.结核分枝杆菌 基因编码蛋白 的原核表达及生物信息学分析.中国病原生物学杂志 ():.():.期 杨雨婷等:结核分枝杆菌 基因编码蛋白的生物信息学分析 ():.():.():.().():.()():.():.微 生 物 学 杂 志 卷