微生物发酵产酶技术省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

微生物发酵产酶技术 任务分配 PPT讲解人：张建华 问题讲解：梅延超、张娜、李虎第1页教学目标教学目标u产酶微生物及其保藏u酶发酵生产工艺u提升酶产量办法第2页（一）利用微生物产酶优点1.微生物种类多、酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样。2.微生物生长繁殖快，易提取酶，尤其是胞外酶。3.微生物培养基起源广泛、价格廉价。4.能够采取微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程，生产可连续化、自动化，经济效益高。5.能够利用以基因工程为主近代分子生物学技术，选育菌种、增加酶产率和开发新酶种。第3页（二）惯用产酶微生物要求1.不是致病菌，不产生有毒物质微生物，在系统发育上最好是与病原体无关；这么才能确保酶生产和应用安全；2.能够利用廉价原料，能在廉价底物上良好生长，繁殖快,发酵周期短，产酶量高；3.菌种不易变异退化，产酶性能稳定，不易感染噬菌体；4.产生酶轻易分离纯化，最好选取产生胞外酶菌种，有利于酶分离，回收率高；5.对医药和食品用酶，应考虑其安全性。第4页 一、产酶微生物及其保藏（一）惯用产酶微生物工业中惯用产酶微生物主要包含细菌、放线菌、真菌、酵母等。其中不少性能优良微生物菌株已经在酶发酵生产中广泛应用。惯用产酶微生物类别菌种名称产酶种类细菌枯草芽孢杆菌-淀粉酶、蛋白酶、-葡聚糖酶、碱性磷酸酶等大肠杆菌谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、-半乳糖苷酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等放线菌链霉菌葡萄糖异构酶、纤维素、碱性蛋白酶、中性蛋白酶等真菌米曲霉糖化酶、蛋白酶、氨基酰化酶、果胶酶等青霉葡萄糖氧化酶、纤维素酶Cx、脂肪酶、核酸酶P1等木霉纤维素酶C1、纤维二糖酶等根霉糖化酶、-淀粉酶、转化酶、酸性蛋白酶等毛霉蛋白酶、脂肪酶、凝乳酶等黑曲霉过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、橙皮苷酶、柚皮苷酶等酵母啤酒酵母转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等假丝酵母脂肪酶、尿激酶、尿囊素酶、等第5页（二）菌种保藏 酶制剂生产工业中，生产菌种（微生物）产酶能力退化是常发生。为预防菌种退化，一是尽可能降低传代次数，二是做好菌种保藏工作。菌种保藏方法很多，其基本原理是采取低温、干燥、绝氧等条件抑制菌种代谢活动，使之停顿繁殖，处于休眠状态。惯用菌种保藏方法有：1.斜面冰箱保藏法：试验室最惯用一个保藏方法，适于保藏 细菌、放线菌、酵母菌及霉菌等。将不一样菌种接种在适宜斜面培养基上，在适宜温度下培养，使其充分生长，培养好菌种置于45。C冰箱中进行保藏。2.砂土保藏最适合于霉菌、芽孢杆菌、放线菌等保藏，方法简便易行，般可保留多年至数十年。第6页 3.液体石蜡油封法：将灭菌过液体石蜡注入菌种斜面试管中，以隔绝氧气并预防水分蒸发，抑制细胞代谢从而到达延长保藏期目标。此法适于保藏霉菌、酵母菌、可保藏菌种打1-2年，且操作简单易行，但有些细菌（如固氮菌、乳酸杆菌、分枝杆菌和毛霉、根霉等）不宜用此法保留。4.冰冻干燥法：大多数微生物都可用冰冻干燥法来保藏，冰冻干燥是利用真空下结冰状态水分子直接升华汽化而使样品干燥。此法适合用于绝大多数微生物，保藏期长，有时可达以上。在冰冻和脱水过程中为预防对细胞造成损害，可用脱脂牛奶等作为保护剂来制备细胞悬液。第7页 5.液态超低温保藏法：将细胞在有甘油等保护剂存在下，先置冰箱中逐步降温，然后置液氮中储备。此法可长久保留菌种。二、酶发酵生产工艺酶发酵生产目标是取得大量所需要酶。所以，除了选择性能优良产酶细胞以外，还必须满足细胞生长、繁殖和发酵产酶各种工艺条件，并需要依据发酵过程改变进行优化控制。酶发酵生产普通工艺流程以下：第8页细胞固定化酶保藏菌种菌种活化种子扩大培养制备原生质体发酵分离纯化预培养原生质体固定化灭菌培养基无菌空气第9页（一）菌种活化与扩大培养1.菌种活化生产上为了预防菌种退化，普通都采取各种方法保藏菌种。保藏菌种活性很低，处于休眠情况，使用之前必须接种于新鲜斜面培养基上，在一定条件下进行培养，以恢复细胞生命活动，这一过程称为菌种活化。2.菌种扩大培养扩大培养是为了将活化了细胞再经过扁平或摇瓶及种子罐逐层扩大培养，最终取得一定数量和质量纯种过程。第10页（二）发酵培养基配制1.培养基基本组分培养基组成成份因所培养生物和目标酶不一样而各有差异。不过，各种培养基都包含碳源、氮源、无机盐、生长原因和水。2.微生物发酵产酶惯用几个发酵培养基（1）枯草杆菌BF7658-淀粉酶发酵培养基玉米粉8，豆饼粉4，磷酸氢二钠08，硫酸铵0.4，氯化钙0.2，氯化铵0.15（自然pH）。（2）枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶发酵培养基玉米粉4，豆饼粉3，麸皮3.2，糠1，磷酸氢二钠0.4，磷酸二氢钾0.03（自然pH）。第11页（三）发酵方式酶发酵方式依据微生物培养方式不一样，能够分为固体发酵、液体深层发酵和固定化细胞发酵等。1.固体发酵法指微生物在含有吸附水分而非游离水潮湿固体上生长。在酿酒工业糖化曲和调料工业酸性蛋白酶，尤其适合用于各种霉菌发酵产酶。其最大特点是固体曲酶活力高。主要固体发酵法有浅盘法、转桶法、后层发酵法等。2.深层液体发酵法是采取液体培养基，置于发酵容器中，经灭菌、冷却后接入产酶细胞，在一定条件下进行发酵。此法不但适合用于微生物细胞，也可用于各种植物细胞和动物细胞悬浮培养和发酵。3.固定化细胞发酵法又称为固定化细胞或固定化增值细胞，是采取各种方法固定在载体上，在一定空间范围进行生长、繁殖和新陈代谢细胞。第12页（四）发酵条件调控1.PH在配制培养基时应依据微生物需要调整pH值。普通情况下，多数细菌、放线菌生长最适pH 为中性至微碱性（pH6.5-8.0）；而霉菌、酵母最适生长pH值则偏酸性（pH4-6）；植物细胞生长最适pH值为 5-6；培养基pH值不但影响微生物生长和产酶，而且对酶分泌也有作用。惯用方法有依据PH值改变情况加酸或是加碱进行调整，也能够经过发酵过程中不了来控制PH。2.温度有些细胞发酵产酶最适温度与细胞生长最适温度往往有所不一样，而且往往低于生长最适温度。原因是在较低温度条件下，能够提升酶所对应mRNA稳定性，增加酶生物合成延续时间，从而提升酶产量。第13页3.溶解氧溶解氧是指溶解在培养基中氧气。在培养基中培养细胞普通只能吸收和利用溶解氧。溶解氧调整控制，就是要依据细胞对溶解氧需要量，连续不停地进行补充，使培养基中溶解氧量保持恒定。（1）调整溶解氧方法主要有：a.调整通气量增大通气量，能够提升溶氧速率。降低通气量，则使溶氧速率降低。在发酵生产过程在发酵生产过程中，应尽可能控中，应尽可能控制溶氧速率等于制溶氧速率等于或稍高于耗氧速或稍高于耗氧速率。率。第14页b.调整氧分压u增加发酵容器中空气压力u增加通入空气中氧含量u都能提升氧分压，从而使溶氧速率提升。c.调整气液接触时间u增加液层高度u降低气流速度u在反应器中增设挡板u延长空气流经培养液距离d.改变培养液性质u改变培养液组分或浓度，有效地降低培养液黏度u设置消泡装置或添加适当消泡剂第15页e.调整气液接触面积u在发酵容器底部安装空气分配管，使气体分散成小气泡进入培 养液中，是增加气液接触面积主要方法u装设搅拌装置u增设挡板三、提升酶产量办法在酶发酵生产过程中，为了提升酶产量，除了选育优良产酶细胞外，还能够采取一些与酶发酵工艺相关办法，比如：1.添加诱导物对于诱导酶发酵生产，在发酵培养基中添加诱导物能使酶产量显著增加。诱导物普通能够分为3类：（1）酶作用底物 比如青霉素是青霉素酰化酶诱导物。第16页（2）酶反应产物 比如纤维素二糖可诱导纤维素酶产生。（3）酶作用底物类似物 比如异丙基-D-硫代半乳糖昔（IPTG）对-半乳糖昔酶诱导效果比乳糖高几百倍。其中使用最广泛诱导物是不参加代谢底物类似物。2.控制(降低)阻遏物浓度微生物酶生产受到代谢末端产物阻遏和分解代谢物阻遏调整。阻遏作用依据其作用机制不一样，能够分为产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。产物阻遏作用是由酶催化作用产物或者代谢路径末端产物引发阻遏作用。分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物引发阻遏作用。第17页3.添加表面活性剂 因为它表面活性剂能够与细胞膜相互作用，改变(增加)了细胞通透性，使更多酶从细胞内透过细胞膜泄漏出来，从而打破了胞内酶合成反馈平衡，有利于胞外酶分泌，从而提升了酶产量。另外，有些表面活性剂对酶分子有一定稳定作用，能够提升酶活力，比如在霉菌发酵生产中添加 1%吐温可使纤维素酶产量提升几倍到几十倍。4.添加产酶促进剂产酶促进剂能够促进产酶，但作用机理并未说明清楚。添加产酶促进剂往往对提升酶产量有显著效果。谢谢谢谢观观赏赏第18页