谢建ZnPP对种植性乳腺癌血管生成影响的实验研究.doc

·大会交流·
ZnPP对种植性乳腺癌血管生成影响的实验研究
谢建 杨渊 刘胜春
400016 重庆，重庆医科大学附属第一医院普外科

【摘要】目的 探讨锌原卟啉（ZnPP）对种植性乳腺癌VEGF和血管生成的影响。方法 应用种植性乳腺癌模型，通过ZnPP和钴原卟啉（CoPP）解决，检测乳腺癌组织中的血红素氧合酶1(HO-1)酶活性，免疫组化、Western blot蛋白印迹杂交检测癌组织中HO-1、VEGF蛋白表达，RT-PCR检测VEGFmRNA，CD34染色肿瘤微血管内皮细胞并对其进行定量分析。结果 ZnPP组肿瘤直径（7±1.06mm，n=7，）明显小于其余各组(t=3.5334 ,P<0.001 )；CoPP组（13±2.82 mm，n=13，）大于空白对照组（10±1.63mm，n=8） (t=3.6564, P<0.002)。CoPP组VEGFmRNA (0.3046±0.0102)明显高于空白对照(0.1524±0.0046)及ZnPP组(0.1216±0.0043)（t=8.8491,P<0.001）。 ZnPP解决组HO-1及VEGF蛋白印迹杂交结果低于CoPP组和空白对照组（t=4.698,P<0.005）（t=5.5428,P<0.005）。ZnPP解决组MEA为224.81±79.4266明显低于CoPP组448.79±138.46 (t=5.3426, P<0.05)。结论 ZnPP也许通过克制HO-1蛋白的表达来减少VEGF表达，减少肿瘤血管生成，并也许由此减少了肿瘤细胞的增殖生长。
【关键词】血红素氧合酶-1；乳腺肿瘤；血管内皮细胞生长因子；血管生成

Experiment study of Effect of Zinc Protoporphyrin on angiogenesis in planted breast carcinoma XIE Jian,YANG Yuan,LIU Sheng-chun. Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital, Chongqing University of Medical Science, Chongqing 400016,China

【Abstract】Objective To investigate the effect of Zinc Protoporphyrin(ZnPP) on VEGF and angiogenesis in planted breast carcinoma. Methods The planted breast carcinoma was treated with ZnPP and Cobalt Protoporphyrin(CoPP), the Haem oxygenase-1(HO-1) protein and enzyme activity in carcinoma tissue were assessed by western blot and so on. At the same time VEGF were examined by RT-PCR, western blot and microvessel endothelial cell were stained by immunohistochemstery with CD34. Microvessel Endothelial Area(MEA) were estated. Results The diameter of tumor in ZnPP group was significantly smaller than that in other groups (t=3.5334 ,P<0.001 ) and that in CoPP group was biggest(t=3.6564, P<0.002)。The VEGF mRNA in tumor of ZnPP group(0.1216±0.0043) were lower than those in other groups, and which in CoPP group were highest(0.3046±0.0102)（t=8.8491,P<0.001）. The MEA in ZnPP group (224.81±79.4266) were lower than those in CoPP group(448.79±138.46）(t=5.3426, p<0.05). Conclusions ZnPP is likely to inhibit HO-1 protein expression to decrease expression of VEGF mRNA and VEGF protein, consequently decrease the angiogenesis in the planted breast carcinoma.
【Key words】Haem oxygenase-1; Breast carcinoma; VEGF; Angiogenesis

血红素氧合酶-1(haem oxygenase-1, HO-1)，又称热休克蛋白32(heat shock protein 32, HSP32)是降解血红素为胆绿素、CO和Fe2+的起始酶和限速酶。近年研究发现HO-1相应激反映的细胞保护起重要作用，本组实验拟通过ZnPP克制HO-1在种植性乳腺癌细胞中的表达探讨ZnPP对种植性乳腺癌血管生成的影响。

材料和方法
1验对象：SHZ-88鼠源性乳腺癌细胞（由本院普外科实验室提供）培养在含10%的新鲜胎牛血清的RMPI1640培养液中，分别加入50u/ml的青霉素及50mg/ml的链霉素，预先37℃、 5% CO2 和100%相对湿度环境中培养，细胞进入对数生长期。
2 试剂：ZnPPIX Zinc (Zn) protoporphyrin (PP) 美国Sigma-Aldrich公司产品。配制：将ZnPP溶于0.1M NaOH， pH7.4，终浓度为1mg/ml。CoPPIX Cobalt protoporohyrin (CoPP) 美国Sigma公司产品，由Professor Song Weihong (The University of British Columbia)惠赠。配制方法同ZnPP。
3 细胞培养及解决: SHZ-88鼠源性乳腺癌细胞培养细胞进入对数生长期。后更换分别具有2uMCoPP和ZnPP细胞培养液继续培养48小时,对细胞进行HO-1原位免疫组化检测。
4 实验动物分组: 产后7天SD乳鼠18只，前胸壁常规消毒后皮下注射SHZ-88细胞悬液0.2ml/只（106/ml）。随母鼠喂养并自由摄水摄食。两周后随即分为三组：A组，空白对照组：不给予任何解决因素。B组，ZnPP组：按1.5mg/Kg/D体重经腹腔注射ZnPP。C组，CoPP组：按5mg/Kg/D体重经腹腔注射CoPP。一周后处死幼鼠并立即切取肿瘤组织，将其一分为二，分别置-80℃保存和多聚甲醛固定，石蜡包埋。
5 HE及免疫组化检测: 常规HE染色，免疫组化所用兔抗鼠HO-1、VEGF、CD34均购自武汉博士德公司采用SABC法染色，实验中设立阳性及阴性对照。
血管计数CD34染色以血管内皮细胞染为棕黄色为阳性，采用真彩色图像分析仪(MD20型、德国LEICA)进行CIAS定量分析：在25.6×10倍镜下选择3着色密度最高区域对染色面积进行定量测定(除外血管腔≥8个红细胞或管壁可见平滑肌者)，并求出微血管内皮细胞面积MEA.
6 RT-PCR检测VEGFmRNA的表达
经典总RNA提取试剂盒（上海生工，SK1351）提取总RNA，按试剂盒操作说明合成第一条链。紫外分光光度计测定RNA浓度，琼脂糖电泳证实RNA的完整性。
VEGF的引物序列为：正义引物5'-TCGCIQCCTCCGAAACCATGA-3',反义引物5'-CCTGGTGAGAGATCTGGTTC-3',产物cDNA 262bp；β-actin正义引物 5-GTAAAGACCACTTTGCCAACA-3’ 反义引物 3’-CACCATCATCCTTCAGGGAG-5’，产物长度214bp。PCR反映条件：预变性94℃2min，95℃变性1min，55℃退火40s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸5min。产物在质量浓度为1%的琼脂糖上电泳，运用Syngene系统进行图象分析，作ODHO-1/ODβ-actin光密度比值测定。
6 HO-1的酶活性测定: 取100mg肿瘤组织按1:4加入0.1molKH2PO4 ,冰上匀浆，4℃下12,000×g离心20min后在将上清液在4℃下12,000×g离心60min。20μl上清，50mmHemin，2mmG-6-P，G-6-P脱氢酶，0.25μl 0.8mM NADPH，1.8ml 0.1ml KH2PO4，标准肝组织匀浆上清液20μl，37℃避光反映60min后冰上终止反映。以不含NADPH的样品作空白对照，464nm、530nm测定胆红素生成（胆红素的摩尔消光系数为40mmol/L.cm）。
7 HO-1、VEGF蛋白印迹杂交: 4℃下在匀浆器中用0.5ml蛋白提取液提取0.1g肿瘤组织总蛋白，紫外分光光度计测定并调整总蛋白浓度为0.5mg/ml，10%SDS-PAGE电泳（电泳电压9V/cm，进入分离胶后增长为15V/cm）,电泳4小时后电转到硝酸纤维膜上（电流0.65mA/cm, 时间15小时）。5%脱脂奶粉PBST封闭1小时，加兔抗鼠HO-1 、VEGF多克隆抗体（1:200）过夜，羊抗兔二抗HRP（1:1000,Santa Cruz,北京中山生物试剂公司分装）1小时，运用ECL试剂盒（SC-2048,Santa Cruz）化学发光法显色，胶片暴光3’-5’,扫描入计算机分析积光光密度。
8 记录学解决: 实验结果中计量资料采用均数±标准差(D)表达，运用SPSS软件进行分析，组间比较采用t检查，以p<0.05为差异有显著性。

结　　果
1 HO-1在体外细胞中的表达：HO-1蛋白重要表达在肿瘤细胞胞浆及胞膜（见图1），其表达强度可以看出通过CoPP诱导出了HO-1在肿瘤细胞内表达。
2 动物模型及肿瘤巨体检查: 所有幼鼠均有肿瘤形成，共生成肿瘤28个，ZnPP组肿瘤直径（7±1.06mm，n=7，）明显低于其余各组(t=3.5334 ,P<0.001 )；CoPP组（13±2.82 mm，n=13，）大于空白对照组（10±1.63mm，n=8） (t=3.6564, P<0.002)。
3 HE和免疫组化检测结果：HE染色检查经病理检查证实所有标本均为乳腺癌组织。HO-1蛋白重要表达在肿瘤细胞胞浆及胞膜（见图2a）。VEGF在肿瘤细胞浆及细胞核中均有表达(图2b)，CD34重要散在表达在肿瘤间质内的血管内皮细胞胞奖内(图2c)。
CD34图象分析结果显示：空白对照组MEA为293.90±137.24（140.62~518.69），与ZnPP解决组MEA为224.81±79.4266（65.5388~323.73）没有显著差异（p>0.05），而CoPP组明显高于前两组448.79±138.46（164.66~698.16）(p<0.05)
4 VEGFmRNA RT-PCR检测结果：各实验组肿瘤组织均有VEGFmRNA表达见图3。CoPP组VEGFmRNA与β-actin的RT-PCR结果OD比值(0.3046±0.0102)明显高于空白对照(0.1524±0.0046)及ZnPP组(0.1216±0.0043)（t=8.8491,P<0.001）。
５ HO-1、VEGF蛋白印迹杂交结果：HO-1蛋白印迹杂交结果见ZnPP解决组细胞HO-1表达最弱，光密度比值明显低于CoPP组和空白对照组（t=4.698,P<0.005）。同样VEGF与HO-1的结果相似（t=5.5428,P<0.005）。

表1 各组肿瘤组织HO-1,VEGF蛋白印迹杂交(积分光密度)结果()
分组 样本 HO-1 VEGF
空白对照 6 35.48±8.14 25.58±3.54
ZnPP组 6 20.98±6.60 19.67±6.69 CoPP组 6 55.64±10.10 39.32±7.43

6 HO-1的酶活性测定：HO-1酶活性测定结果空白对照组1.435±0.2326nmol胆红素/mg蛋白质/1h，低于CoPP组1.765±0.2828nmol胆红素/mg蛋白质/1h（t=3.7937,P<0.002），但高于ZnPP组1.105±0.1114nmol胆红素/mg蛋白质/1h（t=3.816 P<0.005）。

讨　　论
Yanagawa等[1]报道单因素分析HO-1低表达与头颈部肿瘤的未分化限度和淋巴结转移明显相关（P=0.04，P=0.01）。Caballero等[2]用免疫组化检测DAB诱导的肝脏癌前病变及肿瘤组织，发现HO-1在癌前病变及初期肿瘤表达较少，在肝细胞性肝癌中HO-1的表达与肿瘤的分化限度成反相关，认为减少HO-1与肿瘤癌变过程有关。Fang等[3]用聚乙烯-乙二酯-糖结合ZnPP[poly(ethylene glycol)-conjugated　ZnPP,　PEG-ZnPP]在体内实验有阻止HO-1活性及抗肿瘤作用；体外实验结果发现PEG-ZnPP诱发了氧化应激并导致SW480人结肠癌细胞凋亡。同时该作者报道ZnPP可提高肿瘤细胞对喜树碱、阿霉素等化疗药物的反映[4].Berberat PO等[5]在胰腺肿瘤细胞实验中分别评估HO-1对化疗、放疗的影响，发现用SiRNA技术减少HO-1的表达能明显增长胰腺肿瘤细胞对吉西他宾和放射治疗的敏感性，认为特异性克制HO-1的表达也许是胰腺肿瘤的一个新的治疗选择，并也许是化疗、放疗效果增敏剂。我们曾经报道通过ZnPP减少肿瘤组织内的HO-1mRNA、HO-1蛋白及HO-1酶活性，并发现减少HO-1表达以后肿瘤细胞的STAT-3和抗凋亡基因Bcl-XL蛋白的表达减少，而增长了凋亡蛋白酶CAS-3的表达，并也许由此增长了肿瘤细胞凋亡的发生，克制了肿瘤的生长[6]。　
对于HO-1对肿瘤血管生成的影响，目前为止研究报道不多，Sunamura M[7]等发现尽管增长体外细胞的HO-1表达没有显示出对细胞增殖发展的改变，在胰腺肿瘤裸鼠模型体内研究中发现，增长HO-1的表达使肿瘤细胞增殖加快，同时肿瘤的血管生成明显增长，并增长了肿瘤转移事件的发生。认为HO-1通过增长血管内皮细胞的生存而刺激肿瘤的血管生成。
本实验中,我们用CoPP解决SHZ-88鼠源性乳腺癌细胞后,发现细胞中HO-1表达有增长。说明在体外实验中可以增长细胞的HO-1表达。我们在该细胞种植形成的乳腺癌体内模型中，发现HO-1mRNA水平，蛋白表达水平以及HO-1酶活性水平都显示可以用CoPP和ZnPP增长或克制HO-1的表达水平和酶活性。同我们曾经报道的结果一致，ZnPP组肿瘤直径（7±1.06mm，n=7，）明显低于其余各组(t=3.5334 ,P<0.001 )；CoPP组（13±2.82 mm，n=13，）大于空白对照组（10±1.63mm，n=8） (t=3.6564, P<0.002)。为了解HO-1对肿瘤血管生成有无影响，我们检测了肿瘤组织中的VEGF的表达，同时用CD34标记肿瘤组织内的微小血管，并对微血管内皮细胞面积（MEA）其进行半定量分析，结果发现CoPP组VEGF蛋白表达水平（39.32±7.43）明显高于其余两组，而ZnPP组最低（19.67±6.69）。并且在微血管内皮细胞CD34染色，MEA定量检测得到同样的结论，CoPP组MEA448.79±138.46（164.66~698.16）明显高于其余两组，而ZnPP解决组224.81±79.4266（65.5388~323.73）最低(p<0.05)。说明HO-1也许通过增长血管生成因子VEGF的表达，促进了肿瘤的新生血管形成，从而加快了肿瘤的生长。
该结论对进一步研究通过克制HO-1在肿瘤组织内的表达以克制肿瘤内的血管生成，从而达成克制肿瘤生长的治疗目的提供了也许，但其作用机理尚不甚清楚，尚有待进一步进一步研究。
参考文献
[1] Yanagawa T, Omura K, Harada H, et al. Heme oxygenase-1 expression predicts cervical lymph node metastasis of tongue squamous cell carcinomas[J]. Oral Oncol, 2023, 40:21-27.
[2] Caballero F, Meiss R, G imenez A, et al. Immunohistochemical analysis of heme oxygenase-1 in preneoplastic and neoplastic lesions during chemical hepatocarcinogenesis[J]. Int J Exp Pathol,2023,85:213-222.
[3] Fang J, Sawa T, Akaike T, et al. In vivo antitumor activity of pegylated zinc protoporphyrin: targeted inhibition of heme oxygenase in solid tumor[J]. Cancer Res, 2023,63:3567-3574. 
[4] Fang J, Sawa T, Akaike T, et al. Enhancement of chemotherapeutic response of tumor cells by a heme oxygenase inhibitor, pegylated zinc protoporphyrin[J]. Int J Cancer, 2023,109:1-8.
[5] Berberat PO, Dambrauskas Z, Gulbinas A, et al.Inhibition of heme oxygenase-1 increases responsiveness of pancreatic cancer cells to anticancer treatment[J]. Clin Cancer Res, 2023,15,11(10):3790-8.
[6] 刘胜春，姚榛祥，孙正魁. ZnPP对种植性乳腺癌细胞凋亡影响的实验研究[J].中华实验外科杂志,2023，23（5）：525-527
[7] Sunamura M, Duda DG, Ghattas MH, et al. Heme oxygenase-1 accelerates tumor angiogenesis of human pancreatic cancer[J]. Angiogenesis, 2023;6(1):15-24.
ZnPP组
对照组
CoPP组

图1 SHZ-88鼠源性乳腺癌细胞经CoPP及ZnPP解决后HO-1的表达.　SABC×400

CD34
VEGF
HO-1

图2: HO-1、VEGF和CD34在种植性乳腺癌中的免疫组化染色结果 SABC×400

空白组　 ZnPP组　　CoPP组
500bp
400bp
300bp
200bp
100bp

VEGF
Beta-actin

图3 不同组移植乳腺肿瘤内VEGFmRNA表达结果

空白组ZnPP组CoPP组

VEGF
HO-1

Beta-actin
Beta-actin

　　　　　　图4 不同移植乳腺肿瘤内的HO-1和VEGF　Western Blot 检测结果。