G型产气荚膜梭菌全菌灭活疫苗的研制及其免疫效力的评估.pdf

安徽科技学院学报,2 0 2 3,3 7(3):1 6-2 2 J o u r n a l o fA n h u iS c i e n c ea n dT e c h n o l o g yU n i v e r s i t y 收稿日期:2 0 2 2-1 0-1 9基金项目:广东省自然科学基金(2 0 2 1 B 1 5 1 5 1 2 0 0 0 6);河源市科技计划项目(2 0 2 1 0 0 8);云浮市科技计划项目(2 0 2 1 0 4 0 2 0 2,2 0 2 1 0 2 0 6 0 4,2 0 2 1 0 2 0 6 0 7);科技 创 新 战 略 专 项 资 金(高 水 平 农 科 院 建 设)(X T XM 2 0 2 2 0 2,2 0 2 1 1 0 T D,2 0 2 1 2 2 T D,R 2 0 2 0 P Y-J C 0 0 1,R 2 0 1 9 Y J-Y B 3 0 1 0,R 2 0 2 0 P Y-J G 0 1 3,R 2 0 2 0 Q D-0 4 8,R 2 0 2 1 P Y-QY 0 0 7);广东省现代农业产业技术体系创新团队建设专项(2 0 2 2 K J 1 1 9)。作者简介:刘少冰(1 9 9 8-),男,安徽宣城人,硕士研究生,主要从事鸡坏死性肠炎综合防控研究。通信作者:顾有方,教授,E-m a i l:y o u f a n g g u 1 6 3.c o m。G型产气荚膜梭菌全菌灭活疫苗的研制及其免疫效力的评估刘少冰1,2,方肆云3,戚南山2,廖申权2,魏光伟2,李 娟2,孙铭飞2,顾有方1*(1.安徽科技学院 动物科学学院,动物营养调控与健康安徽省重点实验室,安徽 凤阳 2 3 3 1 0 0;2.广东省农业科学院 动物卫生研究所,广东省畜禽疫病防治研究重点实验室,农业农村部禽流感等家禽重大疾病防控重点实验室,广东 广州 5 1 0 6 4 0;3.温氏食品集团股份有限公司,广东 新兴 5 2 7 4 0 0)摘 要:目的:以临床分离的G型产气荚膜梭菌(C l o s t r i d i u mp e r f r i n g e n st y p eG,G C P)G C P-D 2 5菌株为对象,研制G C P全菌灭活苗,并评估疫苗免疫效力。方法:利用甲醛灭活法处理G C P-D 2 5菌液,白油佐剂乳化后免疫1日龄雏鸡检测灭活效果;1 5 0只1日龄8 1 7肉鸡,随机分为5组(G1G5),即高剂量免疫组、中剂量免疫组、低剂量免疫组、攻菌对照组和空白对照组。G1G3组分别于1、8、1 5日龄通过皮下注射不同剂量的G C P-D 2 5乳化灭活疫苗进行免疫,G4G5组通过皮下注射P B S,其中G1G4组于2 62 9日龄每天灌服1次81 08C F U/m LG C P新鲜菌液,G5组为不攻菌对照组。分别于一免、二免和三免后第7天采集鸡血液并分离血清,采用E L I S A方法检测血清抗体及I L-2、I N F-水平,同时结合攻菌后鸡临床表现及肠道病变计分等指标评估疫苗免疫保护效果。结果:G C P-D 2 5全菌液能被0.5%甲醛完全灭活,灭活时间为3 6h。间接E L I S A测定抗原(全菌液)的最佳包被浓度为21 08C F U/m L,血清最佳稀释度为14 0 0。肉鸡免疫保护试验显示,攻菌对照组试验鸡的坏死性肠炎病变平均分显著 高于各免疫 组(P0.0 1)。三免后第7天,各免疫组试验鸡血清抗体呈阳性,高剂量与中剂量免疫组试验鸡I L-2与I F N-含量均显著高于空白对照组(P0.0 5)。结论:G C P-D 2 5全菌灭活疫苗免疫1日龄8 1 7肉鸡可诱导机体产生高水平免疫应答,能够在一定程度上预防鸡坏死性肠炎的发生。关键词:产气荚膜梭菌;坏死性肠炎;灭活疫苗;抗体水平;细胞因子中图分类号:S 8 5 2.6 1文献标志码:A文章编号:1 6 7 3-8 7 7 2(2 0 2 3)0 3-0 0 1 6-0 7开放科学(资源服务)标识码(O S I D):D O I:1 0.1 9 6 0 8/j.c n k i.1 6 7 3-8 7 7 2.2 0 2 3.0 0 5 0S t u d yo fw h o l e s t r a i n i n a c t i v a t e dC l o s t r i d i u mp e r f r i n g e n st y p eGv a c c i n ea n d i t s i mm u n e e f f i c a c yL I US h a o b i n g1,2,F ANGS i y u n3,Q IN a n s h a n2,L I AOS h e n q u a n2,WE IG u a n g w e i2,L I J u a n2,S UN M i n g f e i2,GUY o u f a n g1*(1.C o l l e g eo fA n i m a lS c i e n c e,A n h u iP r o v i n c eK e yL a b o r a t o r yo fA n i m a lN u t r i t i o n a lR e g u l a t i o na n dH e a l t h,A n h u i S c i e n c ea n dT e c h n o l o g yU n i v e r s i t y,F e n g y a n g2 3 3 1 0 0,C h i n a;2.I n s t i t u t eo fA n i m a lH e a l t h,G u a n g d o n gP r o v i n c eK e yL a b o r a t o r yo fA n i m a lD i s e a s eC o n t r o l a n dP r e v e n t i o n,K e yL a b o r a t o r yf o rA v i a nI n f l u e n z aa n dO t h e rP o u l t r yD i s e a s e s,M i n i s t r yo fA g r i c u l t u r ea n dR u r a lA r e a s,G u a n g d o n gA c a d e m yo fA g r i c u l t u r a lS c i e n c e s,G u a n g z h o u5 1 0 6 4 0,C h i n a;3.W e n sF o o d s t u f f sG r o u pC o.,L t d.,X i n x i n g5 2 7 4 0 0,C h i n a)A b s t r a c t:O b j e c t i v e:C l o s t r i d i u mp e r f r i n g e n st y p eG(G C P)i sab a c t e r i a lp a t h o g e n,w h i c hc a nc a u s en e c r o t i ce n t e r i t i s i nb r o i l e r s.G C Pi n a c t i v ew h o l eb a c t e r i a l v a c c i n ew a sp r e p a r e da n d i t s i mm u n ee f f i c a c yw a ss t u d i e d.M e t h o d s:T h eb a c t e r i a ls o l u t i o no fG C P-D 2 5w a si n a c t i v a t e dw i t h0.5%f o r m a l d e h y d e.O n e-d a y-o l dc h i c k s w e r ei mm u n i z e d w i t hi n a c t i v a t e dv a c c i n et od e t e c tt h ei n a c t i v a t i o ne f f e c t.T h ea n t i b o d y,I L-2 a n dI N F-w e r ed e t e c t e d b y E L I S A a t7 d a y sa f t e rt h ef i r s t,s e c o n da n dt h i r di mm u n i z a t i o n.T h e i mm u n ee f f e c to f t h ev a c c i n ew a se v a l u a t e db yt h e l e v e l so fs e r u ma n t i b o d i e s,I L-2a n dI N F-,c l i n i c a l s y m p t o m sa n d i n t e s t i n a l l e s i o ns c o r e sa f t e rc h a l l e n g e.R e s u l t s:T h ew h o l eb a c t e r i a ls o l u t i o no fG C P-D 2 5c o u l db ec o m p l e t e l yi n a c t i v a t e db y0.5%f o r m a l d e h y d ef o r3 6h.T h eo p t i m a lc o a t i n gc o n c e n t r a t i o no fw h o l eb a c t e r i a ls o l u t i o nb yi n d i r e c tE L I S A w a s21 08C F U/m L,a n dt h eo p t i m a l d i l u t i o no f s e r u m w a s14 0 0.T h er e s u l t so f i mm u n i z a t i o nt r i a li nv i v os h o w e dt h a t t h em e a nl e s i o ns c o r e so f n e c r o t i z i n ge n t e r i t i s i n t h e c h a l l e n g e c o n t r o l g r o u pw e r e s i g n i f i c a n t l yh i g h e r t h a n t h o s e i nt h eh i g h,m e d i u m,l o wd o s e i n a c t i v a t e dv a c c i n eg r o u p sa n dt h en e g a t i v ec o n t r o l g r o u p(P0.0 1).O nt h e7 t hd a ya f t e r t h e t h i r d i mm u n i z a t i o n,t h ea n t i b o d yo f t h ec h i c k e n s i nd i f f e r e n t i mm u n i z a t i o ng r o u p sw e r ea l l p o s i t i v ec o m p a r e dw i t ht h en e g a t i v ec o n t r o lg r o u p.T h e l e v e l so f I L-2a n dI N F-i nh i g hd o s eg r o u pa n dm i d d l ed o s eg r o u pw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e r t h a nt h o s e i nn e g a t i v ec o n t r o l g r o u p(P2.1确定阳性值。1.8 细胞因子水平检测使用I F N-和I L-2酶免试剂盒检测不同日龄试验鸡血清中I F N-和I L-2含量。方法如下:加入准备好的样品和标准品,3 7反应3 0m i n,洗板5次,加入酶标试剂,3 7反应3 0m i n,洗板5次,加入显色液A、B,3 7显色1 0m i n,加入终止液,1 5m i n内测定O D4 5 0n m值,最后计算血清中细胞因子的表达量。1.9 统计分析使用G r a p h p a dP r i s e软件进行单因素方差分析(o n ew a yANOVA),L S D法多重比较处理数据。P0.0 1表示差异极显著,P0.0 5表示差异不显著。2 结果2.1 产气荚膜梭菌灭活情况将培养后的G C P-D 2 5用0.5%甲醛脱毒3 6h,观察脱毒后的菌液在细菌培养皿上的生长情况以评价脱毒效果。与阳性对照相比,在细菌培养皿上未见脱毒菌液有产气荚膜梭菌的生长迹象,表明脱毒菌液已完全灭活(图1)。2.2 油佐剂疫苗的鉴定结果2.2.1 冷水表面试验结果 将疫苗数滴滴于冷水表面,油佐剂乳化的疫苗在水面不扩散,呈规则圆形(图2)。2.2.2 稳定性测定结果 离心后疫苗未出现分层,说明疫苗稳定性较好,疫苗乳化合格(图3)。2.2.3 无菌检验结果 疫苗接种于F T,经3 7厌氧培养2 4h后未见细菌生长,说明疫苗安全无菌(图4)。91第3 7卷第3期刘少冰,等:G型产气荚膜梭菌全菌灭活疫苗的研制及其免疫效力的评估图1 梭菌灭活效果F i g.1 E f f e c to f c l o s t r i d i u mi n a c t i v a t i o n图2 乳化疫苗冷水表面试验F i g.2 C o l dw a t e r s u r f a c e t e s to f t h ee m u l s i f i e dv a c c i n e图3 疫苗稳定性试验F i g.3 V a c c i n es t a b i l i t yt e s t i n g图4 无菌检验结果F i g.4 R e s u l t so f s t e r i l i t yt e s t注:阴性对照(左);疫苗接种培养基(中);阳性对照(右)。2.3 疫苗安全性评价取3只1日龄的健康小鸡,每只腿部肌肉注射0.5m L全菌灭活疫苗,连续观察7d,试验鸡精神状态正常,无不良反应,疫苗注射部位无局部肉芽肿和溃疡(图5)。解剖后,发现疫苗吸收良好。证明灭活疫苗安全性符合要求。图5 疫苗安全性评价试验F i g.5 V a c c i n es a f e t ye v a l u a t i o nt r i a l2.4 肠道病变计分结果评价肠道病变计分结果见表2。高、中、低剂量免疫组、攻菌对照组与空白对照组十二指肠病变平均分分别为1.3 10.2 1、1.5 90.3 6、2.1 90.3 6、2.8 60.3 1、1.1 20.3 2分。其中,攻菌对照组坏死性肠炎病变平均分最高,与高剂量免疫组、中剂量免疫组、低剂量免疫组、空白对照组相比差异极显著(P0.0 1),显示不同剂量灭活疫苗对坏死性肠炎均有一定保护效果。高剂量免疫组肠道病变评分显著高于中剂量免疫组(P0.0 5),而相较于低剂量免疫组而言差异极显著(P0.0 1),显示不同剂量灭活疫苗对坏死性肠炎的保护效果不同,其中高剂量灭活疫苗的保护效果最优。表2 十二指肠病变评分单因素方差分析结果T a b l e2 R e s u l t so fo n e-w a yANOVAo f i n t e s t i n a l l e s i o ns c o r e s组别 数量评分0+1+2+3+4+病变评分高剂量免疫组3 041 31 2101.3 10.2 1*中剂量免疫组3 011 31 0501.5 90.3 6*低剂量免疫组3 0151 5632.1 90.3 6*攻菌对照组3 002991 02.8 60.3 1空白对照组3 051 77101.1 20.3 2*注:*P0.0 5表示与攻菌对照组比较差异显著;*P0.0 1表示与攻菌对照组相比差异极显著。02 安徽科技学院学报 2 0 2 3年2.5 间接E L I S A最佳抗原包被浓度的确定从图6中可以看出,抗原(全菌液)的最佳包被浓度为21 08C F U/m L,血清最佳稀释度为14 0 0。2.6 血清抗体水平评价间接E L I S A检测血清抗体水平结果见图7,3次免疫后,除空白对照组外,各试验组血清抗体含量均明显上升,一免后7d与二免后7d,各试验组抗体水平较空白对照组无明显变化,3次免疫后7d,高、中、低剂量组鸡血清抗体水平升高,与空白对照组相比差异极显著(P0.0 1),不同免疫组与空白对照组的O D4 5 0n m比值均大于2.1。同时,不同免疫剂量组之间抗体水平也存在一定差异,三免后7d,全菌灭活疫苗高剂量组抗体水平高于低、中剂量组,其中低剂量组血清中抗体水平相对其他两组上升趋势最小。图6 间接E L I S A抗原包被最佳稀释度的确定F i g.6 D e t e r m i n a t i o no f t h eo p t i m a l d i l u t i o no f i n t e r a n t i g e nc o a t i n g图7 抗体检测结果F i g.7 A n t i b o d yd e t e c t i o nr e s u l t s2.7 血清中细胞因子水平评价血清I L-2和I N F-水平检测结果见图89。3次免疫后,除空白对照组与攻菌对照组外,各试验组鸡血清中I L-2和I F N-含量均明显上升,一免后7d与二免后7d,高剂量免疫组与中剂量免疫组I L-2含量较空白对照组高(P0.0 5),三免后7d高剂量免疫组I L-2含量较空白对照组高(P0.0 5),中剂量免疫组与低剂量免疫组I L-2含量较空白对照组均有明显上升,但差异不显著。从I F N-检测结果来看,一免后7d、二 免后7d与三 免后7d,高、中 剂量免疫组 鸡血清中I F N-的 表达量高于 空 白 对 照 组(P0.0 1),而低剂量免疫组鸡血清中I F N-的表达量在不同检测时间段对比空白对照组均有明显上升,但差异不显著。综上,全菌灭活疫苗高剂量与中剂量可以激发机体免疫应答,诱导相应细胞因子的产生。图8 I L-2检测结果F i g.8 I L-2d e t e c t i o nr e s u l t s图9 I F N-检测结果F i g.9 I F N-d e t e c t i o nr e s u l t s3 结论与讨论目前,对菌液灭活应用最广泛可靠的还是甲醛灭活,其灭活效果主要与甲醛的浓度、温度、时间有关。邢家恺等1 7对A型产气荚膜梭菌的灭活条件为3 7下0.5%甲醛灭活4 8h。刘泽文等1 8对C型产气荚膜梭菌的灭活条件为3 7下0.3%甲醛灭活1 9 2h。而本研究使用的灭活条件为3 7下0.5%甲醛灭活3 6h,取得了较好的灭活效果。经分析,灭活条件的不同可能是由于菌株的类型不同造成的。攻毒保护试验中通过病变评分发现,高、中、低免疫组和空白对照组的病变评分都极显著低于攻菌对照组(P0.0 1);同时不同免疫组之间也有着显著差异,高剂量免疫组肠道病变评分显著高于中剂量免疫组(P0.0 5),而相较于低剂量免疫组而言差异极显著(P0.0 1)。这一结果与M i s h r a等1 1的研究结果相似,M i s h r a等1 1用非毒性N e t B阳性菌株制备了口服活疫苗免疫肉鸡后,口服活疫苗组肉鸡肠道病变程度低于对照组,病变评分显著降低。12第3 7卷第3期刘少冰,等:G型产气荚膜梭菌全菌灭活疫苗的研制及其免疫效力的评估本研究对间接法E L I S A的抗原最佳包被浓度和血清的最佳稀释倍数进行了摸索,最终确定了抗原的最佳包被浓度21 08C F U/m L,血清最佳稀释度为14 0 0。E L I S A检测抗体变化规律结果显示,3次免疫后鸡体内可产生高水平的血清抗体,不同剂量免疫组的抗体水平相对于攻菌对照组的抗体水平均有显著差异(P0.0 5),同时全菌灭活疫苗可以诱导相应细胞因子的产生,与空白对照组相比,不同剂量的免疫组鸡血清中I L-2和I F N-含量均差异显著(P0.0 5)。其中高、中剂量免疫组鸡血清中I L-2和I F N-含量要高于低剂量免疫组。该结果与K e y b u r n等1 3用重组的N e t B毒素疫苗对种鸡进行皮下免疫接种,在子代鸡血清中检测到了较高水平抗N e t B的特异性抗体的结果相吻合;也与C r o u c h等1 2用制备的毒素类毒素疫苗,通过肌肉注射的方式免疫接种肉种鸡,在后代鸡血清中检测到了抗毒素抗体的结果相符合。综上,本研究制备的G型产气荚膜梭菌全菌灭活疫苗可以使机体产生相对应的抗体,并且激发机体免疫应答,诱导相应细胞因子的产生,有效地提高机体免疫力,预防鸡坏死性肠炎的发生。参考文献:1 J I AZ,L I U Y H,HWAN GC A,e ta l.E f f e c to fc o m b i n a t i o no fo x y r a s ea n ds o d i u mt h i o g l y c o l a t eo ng r o w t ho fC l o s t r i d i u mp e r f r i n g e n sf r o ms p o r e su n d e ra e r o b i c i n c u b a t i o nJ.F o o dM i c r o b i o l,2 0 2 0,8 9:1 0 3 4 1 3.2 R I CHA R DOK,G R AHO F E RA,NA THU E SH,e ta l.I m p r o v i n gv a c c i n a t i o ns c h e m e sa g a i n s tC l o s t r i d i u mp e r-f r i n g e n st y p eCe n t e r i t i s i np i g sJ.P o r c i n eH e a l t hM a n a g e,2 0 1 9,5:2 0.3 A CHE S ONP,B E L LV,G I B S ONJ,e t a l.E n f o r c e m e n t o f s c i e n c e-u s i n gaC l o s t r i d i u mp e r f r i n g e n so u t b r e a k i n v e s-t i g a t i o nt ot a k e l e g a l a c t i o nJ.JP u b l i cH e a l t h,2 0 1 6,3 8(3):5 1 1-5 1 5.4 D E-S A N T IM,S C HO C K E N-I T U R R I N ORP,C A S A G R A N D EMF,e t a l.N e c r o t i c e n t e r i t i s c a u s e db yC l o s t r i d i u mp e r-f r i n g e n si nb l u e a n dg o l dm a c a w s(A r aa r a r a u n a)J.JA v i a nM e dS u r g,2 0 2 0,3 4(1):6 5-6 9.5 刘水.穗花杉双黄酮对产气荚膜梭菌坏死性肠炎及气性坏疽的治疗作用机制D.长春:吉林大学,2 0 2 0.6 陈锁.枯草芽孢杆菌制剂对产气荚膜梭菌和球虫引起的肉鸡坏死性肠炎治疗效果研究D.泰安:山东农业大学,2 0 2 1.7 黄璐,杨成雄,刘生鹏.动物源性食品中抗生素残留的危害及检测方法J.广州化工,2 0 2 1,4 9(5):4 4-4 7.8 L OV L AN DA,KA L DHU S D A L M.S e v e r e l y i m p a i r e dp r o d u c t i o np e r f o r m a n c e i nb r o i l e r f l o c k sw i t hh i g hi n c i d e n c eo fC l o s t r i d i u mp e r f r i n g e n sa s s o c i a t e dh e p a t i t i sJ.A v i a nP a t h o l,2 0 0 1,3 0(1):7 3-8 1.9 郑晓丽.规模化鸡场健康鸡群产气荚膜梭菌的分离、鉴定及遗传多样性研究D.雅安:四川农业大学,2 0 0 9.1 0 孔芳玲,史宁花,张和平,等.宁夏牛“猝死症”三种酶活性的测定J.中国兽医科技,1 9 9 7,2 7(6):3 5-3 6.1 1 M I S HR AN,S MY THJA.O r a l v a c c i n a t i o no fb r o i l e rc h i c k e n sa g a i n s tn e c r o t i ce n t e r i t i su s i n gan o n-v i r u l e n tN e t Bp o s i t i v es t r a i no fC l o s t r i d i u mp e r f r i n g e n st y p eAJ.V a c c i n e,2 0 1 7,3 5(4 9):6 8 5 8-6 8 6 5.1 2 C R OU CH CF,W I THANA G EGSK,D E-HAA SV,e t a l.S a f e t ya n de f f i c a c yo f am a t e r n a l v a c c i n e f o r t h ep a s s i v ep r o t e c t i o no fb r o i l e rc h i c k sa g a i n s tn e c r o t i ce n t e r i t i sJ.A v i a nP a t h o l,2 0 1 0,3 9(6):4 8 9-4 9 7.1 3 K E Y B UR NAL,B OY C EJD,VA ZP,e ta l.N e t B,an e wt o x i nt h a ti sa s s o c i a t e dw i t ha v i a nn e c r o t i ce n t e r i t i sc a u s e db yC l o s t r i d i u mp e r f r i n g e n sJ.P L o SP a t h o g,2 0 0 8,4(2):e 2 6.1 4 J I ANGYL,MO H A,W I L L I N GHAMC,e t a l.P r o t e c t i o na g a i n s tn e c r o t i ce n t e r i t i s i nb r o i l e r c h i c k e n sb yr e g u l a-t e dd e l a y e d l y s i ss a l m o n e l l av a c c i n e sJ.A v i a nD i s,2 0 1 5,5 9(4):4 7 5-4 8 5.1 5 O TOO L ED,S T E A DMANL,R A I S B E C K M,e t a l.M y o s i t i s,l a m e n e s s,a n dr e c u m b e n c ya f t e ru s eo fw a t e r-i n-o i la d j u v a n t e dv a c c i n e s i nn e a r-t e r mb e e f c a t t l eJ.JV e tD i a g nI n v e s t,2 0 0 5,1 7(1):2 3-3 1.1 6 韩文榆,何昭阳,刘玉斌.病原细菌检验技术M.长春:吉林科学技术出版社,1 9 9 2.1 7 邢家恺,纪雪,孙洋,等.犬A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的制备及免疫学评价J.中国兽医学报,2 0 1 8,3 8(7):1 3 1 5-1 3 2 0.1 8 刘泽文,袁芳艳,刘威,等.仔猪大肠杆菌病、C型产气荚膜梭菌病二联灭活疫苗的研制与应用J.动物医学进展,2 0 1 8,3 9(6):2 4-2 8.(责任编辑:姜锦鹏)22 安徽科技学院学报 2 0 2 3年