制草乌肝毒性效应的代谢通路分析.pdf

云 南 中 医 中 药 杂 志实验研究基金项目:蒙药安全性评价创新团队项目()中央支持地方建设专项资金交叉学科建设项目()自治区高校创新团队项目()内蒙古民族大学博士启动基金项目()科技领军人才和创新团队支持计划创新团队培育项目()第一作者简介:姜艳丽()女在读硕士研究生研究方向:药理及毒理学研究通信作者:白梅荣 :制草乌肝毒性效应的代谢通路分析姜艳丽 图布新 乌日汉 胡伊力格其 刘锦文 韩晓静 阿都沁夫 白梅荣(内蒙古民族大学 内蒙古 通辽 内蒙古医科大学 内蒙古 呼和浩特)摘要:目的 基于代谢组学技术检测制草乌对大鼠肝功能指标及肝组织病理影响从而探究代谢通路分析 方法 以制草乌为示例药物以大鼠为研究对象将大鼠按体重随机分成 组 根据预试验结果设定正常组、制草乌高剂量组、中剂量组、低剂量组 除正常组外其余各给药组灌胃相应的药物溶液 次/连续灌胃 末次给药后收集血清样本检测各组的血清生化指标及采用 非靶向代谢组学技术对血清内源性代谢产物变化进行分析 结果 血清生化指标结果显示与正常组比较制草乌高剂量组 含量显著升高有统计学意义()肝组织病理检测显示正常组肝小叶结构清晰肝细胞索和肝血窦大致呈放射状排列肝细胞圆润、饱满肝板排列规则、整齐 制草乌高剂量组肝细胞广泛水肿、空泡化、丧失结构完整性制草乌中和低剂量组未见明显异常从血清中共筛选出 个内源性差异代谢物其中上调 个、下调 个多数涉及烟酸和多种氨基酸代谢 结论 明确制草乌具有一定的肝毒性肝毒性机制主要与烟酰胺()和 甲基烟酰胺()代谢有关关键词:制草乌肝脏毒性血清代谢通路机制分析中图分类号:文献标志码:文章编号:()(.)【】:.:.:(.).年第 卷第 期云 南 中 医 中 药 杂 志 .:()().【】草乌为毛茛科植物北乌头 的干燥块根 异名为毕哈、曼钦、哈拉、泵那格、哈日泵阿、哈日浩热苏 味辛性温效轻有大毒 功能与主治为杀黏燥协日乌素止痛 主治瘟疫黏痧症急性刺痛黏刺痛黏奇哈痈疖丹毒白喉炭疽瘿瘤黏性脖颈僵直陶赖赫如虎关节疼痛及相讧热肺感冒喉感冒等症 制草乌作为大毒蒙药不合理应用将会对肝脏有毒性影响 肝脏担负着人体代谢、解毒、合成等重要生理功能 不仅是体内药物代谢和排泄的重要场所也是药物毒性反应的易感靶器官 由药物所致急慢性肝功能衰竭呈逐年增高已成为严重制约临床安全用药和药物研发的又一大荆棘 以此不合理应用含有毒味的制草乌亦有一定的肝毒性 血清丙氨酸氨基转移酶()天门冬氨酸氨基转移酶()和碱性磷酸酶()是临床常用的诊断指标其参考区间主要用于帮助临床医生判断就诊者肝功能是否正常 目前尚未见制草乌肝毒性与内源性代谢物相关的研究报道 因此本研究以大鼠为研究对象以制草乌为示例药物探讨制草乌产生肝毒性时从肝功能指标及肝组织病理影响且出现的内源性代谢产物变化规律而探究通路分析为寻求防治制草乌肝毒性的相应靶点及为制草乌临床指导合理应用提供有力的实验依据 实验材料 动物 雄性大鼠 级体重为 由辽宁长生生物技术股份有限公司提供(辽)饲养条件:室温维持 光照 自由饮水、摄食 药品与试剂 制草乌由内蒙古民族大学附属医院蒙药制剂室提供经专家(内蒙古民族大学蒙医药学院药用植物鉴定教研室包桂花教授)鉴定为正品纯化水(屈臣氏集团有限公司)谷丙转氨酶()、谷草转氨酶()、磷酸酶()试剂盒均购自罗氏诊断产品(上海)有限公司 仪器 型移液器(德国 公司)质谱仪 (公司)型台式高速冷冻离心机(公司)型粉碎研磨仪(上海万柏生物科技有限公司)罗氏全自动生化分析仪(上海罗氏诊断产品有限公司)型恒温水浴锅(上海爱郎仪器有限公司)生物显微镜(公司)色谱(岛津 公司)实验方法 草乌溶液的制备取鉴定为正品的制草乌用粉碎研磨仪适量进行粉碎过 目筛用纯化水配制成不同浓度的制草乌给药溶液 给药剂量设置 把临床等效量设为中剂量进行了研究 制草乌高剂量组为临床等效量的 倍量即 /制草乌中剂量组为临床等效量 即 /制草乌低剂量组为临床等效量的/倍量即 /动物分组及取材 动物分组:取 大鼠 只按体重随机分为正常组、制草乌高剂量组、制草乌中剂量组、制草乌低剂量组每组 只 自实验开始给药组给予相应的药物溶液灌胃每日 次连续 正常组灌胃等量生理盐水 取材:末次给药后麻醉动物用采血管从腹主动脉取血使用离心机以/离心 后移液枪分离血清到离心管取部分肝脏组织固定于 甲醛溶液后将血清和其余肝脏部分置于 保存 随后使用 罗氏全自动生化分析仪(上海罗氏诊断产品有限公司)测肝生化指标及生物显微镜检测病理切片分析其肝脏内源性代谢产物 代谢物提取 置 解冻上述分组的血清样本分别取 加入 甲醇震荡提取于 下离心 取上清液过 有机滤膜进样 用 检测分别称取上述分组的肝脏样品 于 管中加入 甲醇使用玻璃研磨器研磨至匀浆 年第 卷第 期云 南 中 医 中 药 杂 志离心()取上清液过 有机滤膜进样 用 检测 检测色谱条件:采用 色谱柱()流动相:乙腈:甲酸水溶液流速 /柱温 进样量 洗脱梯度:质谱参数条件:采用电喷雾电离()正离子和负离子模式进行检测 源条件如下:离子源:离子源:界面加热温度:(正离子)和 (负离子)离子喷雾电压浮动()(正离子)和 (负离子)气帘气压力():质量扫描范围:产物离子扫描范围:产物离子扫描累积时间 扫描累积时间 二级质谱采用 ()获得并采用 模式碰撞能量:去簇电压():数据处理应用 进行统计分析各组生化指标用()表示 组间比较分别采用 检验、秩和检验、单因素方差分析法以 为差异有统计学意义利用 软件将获得的原始数据转换成 格式再导入 软件进行峰信息的提取 使用 数据库进行比对 分析各组样本采用多维分析即 和 法筛选 (或 作为差异代谢物 再使用 分析代谢通路 结果 多元统计分析 血清生化指标检测结果与正常组比较从单个 组 别 观 察 制 草 乌 高 剂 量 组 显 著 升 高()制草乌中和低剂量组、含量无显著差异 正常时血清中的 含量较低但相应细胞受损时细胞膜通透性增加胞浆内的 释放入血故其血清浓度可升高 肝细胞内 的浓度比血清高 倍 只要有 的肝细胞坏死便可使血中酶活性增高 倍因此转氨酶(尤其是)是急性肝细胞损害的敏感标志 在肝脏细胞和线粒体受到损害后两者均会渗透到血液内造成血清、水平明显上升 肝功能受损时、往往会升高 当 明显升高/的值大于 时提示有肝实质的预后不良 结果见表 提示制草乌超过临床等效量 倍时具有一定的肝毒性表 肝毒性血清生化指标的影响()组别(/)(/)(/)正常组 制草乌高剂量组 制草乌中剂量组 制草乌低剂量组 注:与正常组比较 肝组织病理检测肝组织病理检测显示正常组肝小叶结构清晰肝细胞索和肝血窦大致呈放射状排列肝细胞圆润、饱满肝板排列规则、整齐 制草乌高剂量组肝细胞广泛水肿、空泡化、丧失结构完整性制草乌中和低剂量组未见明显异常 见图 图 肝组织病理切片图()结果及 聚类结果分析 是依据主要新变量归类各组数据去除重异常和离群样本可观察样品的聚集、离散程度 如图 所示与正常组比较制草乌高剂量组的大鼠血清代谢物呈完全分离利用 软件进行聚类分析以热图的聚类结果分析组间差异使用颜色梯度使不同分组间的差异实现可视化不同颜色的区域代表不同的聚类分组颜色深浅梯度表示代谢物水平 如图 所 年第 卷第 期云 南 中 医 中 药 杂 志示与正常组比较制草乌高剂量组的血清代谢物相对丰度有明显差异其余组的代谢模式相似或者由相近的代谢物聚成类差异较小以上表明制草乌高剂量组可使大鼠血清代谢物产生一定变化图 血清代谢物 图图 血清代谢物热图 结果及单变量结果分析 通过参数检验进行 模型验证具有良好的解释度和预测度(参数 和 均大于 )如图 所示与正常组比较制草乌高剂量组大鼠血清代谢物能完全分离 表明制草乌高剂量组大鼠血清代谢物谱有显著差异其可能引起的毒性较为明显在单 变 量 分 析 中 采 用 倍 数 检 验 得 到 选用(倍数检验)作为横坐标并对各组数据进行 检验选用 (检验)作为纵坐标得到火山图 火山图分析显示标红的点为在倍数检验中大于 并且 检验中小于 的物质即制草乌中具有显著差异的代谢物 如图 所示与正常组比较制草乌高剂量组血清中显著差异代谢物较多 表明肝毒性可使制草乌高剂量组产生显著差异代谢物变化图 血清 得分图图 血清火山图 差异代谢物的筛选为寻找潜在差异代谢物以 中 和 (或 )的标准筛选用 年第 卷第 期云 南 中 医 中 药 杂 志 数据库进行检索分析 血清差异代谢物的筛选 制草乌高剂量组血清样本中筛出 个差异代谢物 与正常组比较制草乌高剂量组 甲基 羟乙基噻唑、氨基戊酸、羟丁酸、异麦芽酮糖、瓜氨酸、甲芬那酸、蛋氨酸亚砜、烟酰胺、正亮氨酸、亚精胺、特非那定、氧化三甲胺、酪氨酸、异亮氨酸、葡萄糖明显增加()核黄素、(羟基苯基)、羟基苯乳酸、芴酮、反式棕榈酸、咖啡酰胆碱、氨基异丁酸、谷氨酰胺、反丁烯二酸、谷氨酰胺、果糖、()赖氨酸、乙酰神经氨酸、亮氨酸、高脯氨酸、吡哆胺、正缬氨酸、癸二酸、十八碳烯酸明显下降见表表 肝毒性血清差异代谢物的鉴定(和 )序号/代谢物/变化趋势()核黄素 (羟基苯基)羟基苯乳酸 甲基 羟乙基噻唑 氨基戊酸 芴酮 反式棕榈酸 咖啡酰胆碱 异亮氨酸 氨基异丁酸 果糖 反丁烯二酸 葡萄糖 谷氨酰胺 谷氨酰胺 羟丁酸 异麦芽酮糖 序号/代谢物/变化趋势 ()赖氨酸 瓜氨酸 亮氨酸 正缬氨酸 高脯氨酸 甲芬那酸 蛋氨酸亚砜 乙酰神经氨酸 烟酰胺 正亮氨酸 吡哆胺 癸二酸 亚精胺 特非那定 十八碳烯酸 氧化三甲胺 酪氨酸 通路富集分析 将上述筛选出的差异代谢物导入 分析其代谢通路 血清差异代谢物涉及 转运蛋白()、精氨酸和脯氨酸代谢()、癌症的中心碳代谢()、烟酸和烟酰胺代谢()、谷胱甘肽代谢()、苯丙氨酸代谢()、信号通路()、代谢途径()、能突触()、丙氨酸代谢()等通路见图 发现血清代谢物均与 转运蛋白相关性最强其次为精氨酸和脯氨酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢、癌症的中心碳代谢 讨论制草乌产生肝毒性时从检测血清生化指标、肝组织病理检测、结果、聚类结果分析、结果及单变量出现的变化规律表明制草乌高剂量组具有一定的肝毒性从而探究的通路试验分析结果表明制草乌肝脏毒性机制主要与烟酰胺()与 甲基烟酰胺()代谢有关 小结代谢组学是一种可提供毒性评价和机理研究方法 它可通过对内源性代谢物进行动态分析灵敏的监测药物引起的异常代谢变化同时阐明药物毒性作用机理 因此代谢组学快速、高效的检测技术对促进毒理学的研究阐明肝毒性潜在标志物及安全用药提供有力依据烟酸()是机体必需的一种维生素在体内转化为烟酰胺()作为脱氢酶辅酶和辅酶的组成成分在氧化还原过程中起传递氢的作用 对维持体内脂质代谢、葡萄糖酵解、蛋白质、碳水化合物、氨基酸代谢等发挥着重要作用 本研究发现给予制草乌后大鼠血清内烟酸和烟酰胺代谢均发生 年第 卷第 期云 南 中 医 中 药 杂 志 图 血清代谢通路图紊乱如 甲基烟酰胺含量增加 甲基烟酰胺()是烟酰胺的主要代谢物具有抗血栓形成和抗炎作用 烟酰胺()转化为 甲基烟酰胺()和 甲基转移酶()其表达上调与肝硬化密切相关草乌作为含有大毒的蒙药不合理应用将会对作为人体的重要器官的肝脏有着毒性作用 采用 非靶向代谢组学技术对肝脏组织内源性代谢产物进行检测分析及观察肝组织病理切片结果显示血清中制草乌高剂量组 异常升高制草乌高剂量组肝细胞广泛水肿、空泡化、丧失结构完整性制草乌中剂量组部分肝细胞水肿制草乌低剂量组未见明显异常 引起此现象的主要与肝脏组织中的烟酸()有关结果表明制草乌对肝脏有着毒性作用主要与烟酸()有关 最终发现临床剂量高会出现肝脏广泛的损害临床等效剂量与低剂量目前尚未发现一定的肝损伤 本实验结果为下一步制草乌肝毒性进行其更加深入的研究奠定了基础参考文献:奥乌力吉布和巴特尔 传统蒙药与方剂.呼和浩特:内蒙古科学技术出版社:王跃武常福厚 蒙药草乌的毒理学研究进展.中国毒理学会中药与天然药物毒理专业委员会第二次(年)学术交流会:焦云涛高菁任彬等 中草药肝毒性、肾毒性及对策.世界中医药():黄妍王甜甜杜小霞等 国家行业标准、参考区间的验证试验.标记免疫分析与临床():王庆春 血清、联合血脂检测对诊断脂肪肝的临床价 值 分 析 .现 代 诊 断 与 治 疗 ():张金梅 肝硬化患者血清中、比值与 相关性的临床研究/中华医学会消化内镜学分会()香港消化内镜学会()第十届国际治疗内镜及消化病学术会议专题报告及论文汇编 出版者不详:刘瑞媛叶华谢婷等 代谢组学及其在药物毒性评价中的应用.生命的化学():刘士杰怀文辉范士杰等 烟酸及胆碱对围产期奶牛营养代谢的调控.中国饲料():陈静江应安 烟酸对非酒精性脂肪性肝病大鼠模型脂质代谢的影响.临床肝胆病杂志():()().():(收稿日期:)年第 卷第 期