痰液中细菌生物被膜镜检在慢性支气管扩张治疗中的价值分析.pdf

医药前沿 2024年3月 第14卷第8期 论著 1痰液中细菌生物被膜镜检在慢性支气管扩张治疗中的价值分析李继刚（徐州市铜山区人民医院检验科 江苏 徐州 221000）【摘要】目的：分析细菌生物被膜（BF）镜检在慢性支气管扩张治疗中的价值。方法：选取 2021 年 1 月2022 年12 月徐州市铜山区人民医院收治的 240 例慢性支气管扩张患者为研究对象，留取合格痰液标本，同时制备痰液涂片，革兰染色后检查 BF，将 BF 阳性的标本进行细菌培养，根据培养和鉴定结果，挑选出铜绿假单胞菌阳性患者，并按照入院先后顺序，将其分为 A 组（未干预组，n=20）与 B 组（干预组，n=106）。统计 BF 阳性率，比较两组住院时间差异。结果：240 例慢性支气管扩张患者的痰液中，检出 BF 168 例，BF 检出率为 70%。对 168 例 BF 阳性者进行痰液培养，培养出铜绿假单胞菌 126 例（75.00%），肺炎克雷伯菌 22 例（13.10%），鲍曼不动杆菌 20 例（11.90%）。B 组住院时间短于 A 组，差异有统计学意义（P 0.05）。结论：慢性支气管扩张多与 BF 有关，尤其是铜绿假单胞菌 BF；痰液细菌 BF 镜检对临床治疗有着重要指导意义。发现细菌 BF 后，及时报告，并对临床治疗进行指导性干预，能缩短患者住院时间。【关键词】慢性支气管扩张；生物被膜；镜检；治疗指导【中图分类号】R562.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2024）08-0001-05Value analysis of the examination of bacterial biofilms in the treatment of chronic bronchiectasisLI JigangDepartment of Laboratory,Tongshan District Peoples Hospital of Xuzhou City,Xuzhou,Jiangsu 221000,China【Abstract】Objective Analysis of the value of bacterial biofilm(BF)microscopy in the treatment of chronic bronchiectasis.Methods 240 patients with chronic bronchiectasis admitted to Tongshan District Peoples Hospital in Xuzhou City from January 2021 to December 2022 were selected as the research subjects,and qualified sputum samples were collected.Gram stained smears were prepared and the microscopic was used to examine BF.The BF-positive samples were cultured for bacteria.Pseudomonas aeruginosa positive patients were selected and divided into two groups according to the order of admission:A(no intervention group,n=20)and B(intervention group,n=106).The positive rate of BF was calculated of the difference in hospitalization time between the two groups was compared.Results Among 240 patients with chronic bronchiectasis,168 cases of BF were detected in the sputum,with the positive rate of 70%.Sputum culture was conducted on 168 BF positive individuals,and 126 cases(75.00%)of Pseudomonas aeruginosa,22 cases(13.10%)of Klebsiella pneumoniae,and 20 cases(11.90%)of Acinetobacter baumannii were cultured.The hospitalization time of group B was shorter than that of group A,and the difference was statistically significant(P 0.05).Conclusions Especially pseudomonas aeruginosa BF,is a risk factor for bronchiectasis.The examination of BF is very important,and timely reporting of the discovery of BF and guiding intervention for clinical treatment can shorten the hospitalization stay of the patients.【Key words】Chronic bronchiectasis;Biofilm;Microscopic examination;Treatment guidance慢性支气管扩张是老年患者呼吸系统常见的化脓性炎症，几乎 50%的重度慢性阻塞性肺疾病患者会合并慢性支气管扩张1-2，其病理基础为支气管黏膜上皮组织被不可逆地破坏，黏膜发生水肿，易发生反复感染，且难以根治。在我国，铜绿假单胞菌检出率最高，为 13.5%73.5%；其次是鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌3-4。细菌感染难以根治的主要原因是生物被膜导致的多重耐药。细菌生物被膜（bacterial biofilm,BF）是细菌通过自身分泌的胞外聚合物黏附在物体接触面上而形成含有多细胞的三维结构群体，常存在于气管或支气管壁、气管插管5、体内植入物6和囊性感染灶中，其中 97%是水分，另外还有少量的蛋白质、核酸、多糖、肽聚糖和磷脂。BF 的形成属于在恶劣环境下细菌的自我保护，形成机制比较复杂，有细菌自身的因素7，也有免疫因素8。BF 对多种抗生素都有抵抗力，可保护膜内细菌不被破坏，很多慢性、难治性呼吸道感染均与此有关，若能在痰液中及时发现BF，对于临床及时选择合适的治疗方案有重要意义，但目前国内外尚未见相关报道。基于此，本研究就慢性支气管扩张患者痰液中 BF 的检查方法和意义进行阐述和分析，现报道如下。1 资料与方法1.1 一般资料选取 2021 年 1 月2022 年 12 月徐州市铜山区人民医院收治的 240 例慢性支气管扩张患者作为研究对象，2 医药前沿 2024年3月 第14卷第8期 论著其中男155例，女85例；年龄6088岁，中位年龄75岁。纳入标准：（1）既往支气管扩张史；（2）胸部CT 上支气管管壁增厚，呈戒指样、管束样或蜂窝状；（3）咳脓痰或血痰。排除标准：（1）合并肿瘤、肾病、肝病或其他影响抗生素代谢疾病的患者；（2）因过敏或胃肠道反应无法使用大环内酯或抗菌肽的患者；（3）出院后又再次入院的患者。1.2 方法（1）试剂、仪器和耗材：试剂采用珠海贝索生物公司生产的快速革兰染液，仪器为珠海迪尔生物科技有限公司生产的 DL-96II 型细菌鉴定仪，并使用科玛嘉 90 mm直径血平板进行培养。（2）操作流程：用革兰染色法检查痰液中 BF，统计 BF 检出率。将检出 BF 的痰液接种于 90 mm 直径血平板和巧克力平板，在 35 37 环境中培养 48 h，挑取疑似致病菌，采用 DL-96E/DL-96NE鉴定板和 DL-96 型鉴定仪鉴定细菌种类。挑选出鉴定结果为铜绿假单胞菌的患者 126 例，根据入院时间，将患者分为 A、B 组。A 组 20 例：2021 年 1 月 1 日6 月30 日入院，痰液中检出 BF，由于 BF 不属于常规检验项目，因此未报告 BF 检查结果，也未对临床治疗进行指导性干预。B组106例：2021年7月2022年12月入院，均报告检出 BF，并对临床进行指导性干预。干预手段包括：及时将 BF 检查结果报告给患者主管医生和护士；普及 BF 相关知识；建议临床医生及时使用大环内酯类、抗菌肽等抗生素抑制 BF，使用与否由临床医生根据患者具体情况自主决定。B 组的干预手段和临床医生的用药方案均获得了患者的知情同意和本院伦理委员会批准。1.3 观察指标（1）统计 BF 镜检及菌种鉴定结果；（2）比较 A、B 两组患者的住院天数。1.4 统计学方法使用 SPSS 26.0 统计软件进行数据处理。符合正态分布的计量资料采用（x s）表示，采用 t 检验；计数资料用频数和百分率n（%）表示，采用2检验。P0.05表示差异有统计学意义。2 结果2.1 BF 镜检及菌种鉴定结果240 例支气管扩张患者中，痰液中检出细菌 BF 168 例（70.00%），其中铜绿假单胞菌 126 例（75.00%），肺炎克雷伯菌 22 例（13.10%），鲍曼不动杆菌 20 例（11.90%）。产 BF 细菌菌体周围被革兰阴性菌的黏蛋白包裹，黏蛋白的量因细菌种类而异。产BF铜绿假单胞菌菌体细长，菌体周围黏蛋白的量比较多，有时在镜下可呈片状，见图 1。产 BF 肺炎克雷伯菌菌体周围黏蛋白明显比铜绿假单胞菌少，但镜下依稀可见，细菌菌体粗短，两极染色，见图 2。产 BF 鲍曼不动杆菌菌体周围黏蛋白比肺炎克雷伯菌略多，但明显比铜绿假单胞菌少，见图 3。产 BF 细菌经过体外培养后，BF 均消失，菌体变小，以铜绿假单胞菌变化最明显，见图 4。（a）（c）（e）（b）（d）（f）注：（a）（c）（e）（f）铜绿假单胞菌 BF 呈片状；（b）（d）铜绿假单胞菌 BF 呈条索状。图 1 产 BF 铜绿假单胞菌（痰液，革兰染色，1 000）（a）（b）注：（a）（b）为不同标本来源的产 BF 肺炎克雷伯菌，菌体周围 BF 较薄且染色浅。图 2 产 BF 肺炎克雷伯菌（痰液，革兰染色，1 000）医药前沿 2024年3月 第14卷第8期 论著 3（a）（b）注：（a）（b）为不同标本来源的产BF鲍曼不动杆菌，菌体周围BF较薄。图 3 产 BF 鲍曼不动杆菌（痰液，革兰染色，1 000）（c）（a）（d）（b）注：体外培养后菌体周围 BF 消失；（a）（b）铜绿假单胞菌；（c）肺炎克雷伯菌；（d）鲍曼不动杆菌。图 4 产 BF 细菌经体外培养后的形态（痰液，革兰染色，1 000）2.2 A、B 两组患者住院时间比较A、B 两组皆为铜绿假单胞菌感染。在临床治疗期间，A 组 20 例患者未经过指导性干预，平均住院天数为13.5 d；B 组 106 例患者经过详尽的指导性干预，提醒临床医师及时使用大环内酯类抗生素或抗菌肽，平均住院天数为 7.6 d。B 组住院时间短于 A 组，差异有统计学意义（P 0.05），见表 1。表 1 A、B 两组患者住院时间比较（x s，d）组别例数住院时间A 组（未干预组）2013.544.45B 组（干预组）1067.642.38t8.648P 0.0013 讨论BF 的形成速度和形态因菌种不同而异，在临床上，铜绿假单胞菌比其他常见菌（如肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌以及大肠埃希菌等）更易形成 BF。该菌 BF 的形成是一个群体效应，与多个因素及基因密切相关9-10。有研究证实，信号分子 AI-2 能通过密度感应系统，促进铜绿假单胞菌生物被膜形成11。BF 内含有大量的细菌代谢物、白细胞分解产物、宿主抗细菌抗体和补体等，甚至还含有细菌分解产生的抗生素水解酶，如-内酰胺酶、金属酶等，能够水解膜外抗生素。BF 作为毒力因子的成员之一，在慢性感染中扮演着重要角色。BF 中的细菌代谢产物能引起宿主组织发生变态反应，变态反应产物沉积于 BF 和病灶部位，造成膜的厚度进一步增加和病灶组织囊性纤维化病变。如弥漫性肺支气管肺炎中，BF 内黏液性细菌产生的藻酸盐可引起持续的抗原抗体反应，而抗原抗体和补体的复合物沉积于肺部组织会引起病理性改变。近年来，随着医学界对某些环境中常见细菌所致的一些慢性和顽固性疾病的深入了解，发现 BF 是导致这些细菌性疾病难以根治的主要原因12。以 BF 形式存在的细菌不同于浮游细菌，其对抗生素、恶劣环境及宿主免疫防御机制有很强的抵抗性，BF 内的细菌在生理、代谢、对底物的降解或利用和对环境的抵抗能力等方面都具有独特的性质。BF 能保护膜内菌体免受免疫系统的攻击和破坏，导致膜内细菌难以清除。BF 的物理屏障作用使抗生素难以渗透到膜内，即使膜外抗生素浓度很高，但膜内的浓度可能远低于最小抑制浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)。单个 BF 可由一种或多种微生物形成，某一种细菌在凋亡后，其耐药基因可以被其他细菌吞噬而整合到自身基因组中，形成获得性耐药13。细菌BF 常见于慢性支气管炎、慢性支气管扩张及插管患者，主要病原菌是铜绿假单胞菌14-15、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌及流感嗜血杆菌等，其中铜绿假单胞菌最多。这些细菌常携带质粒、缺陷靶基因、金属酶基因，极易产生耐药，BF 的存在使细菌耐药性进一步增强。铜绿假单胞菌 BF 比较厚，抗生素难以渗透，因此在慢性感染中最常见。BF 的上述特性导致抗生素难以发挥作用，慢性感染反复发作，这给临床治疗带来了极大的挑战。目前关于抑制或破坏铜绿假单胞菌 BF 的研究较多，为临床治疗铜绿假单胞菌慢性难治性感染提供了一些新思路。临床实践发现，使用相应的干扰药物可破坏或抑制细菌 BF，最常用的方法是将敏感抗生素与大环内酯类抗生素联合使用。亚 MIC 浓度的大环内酯类抗生素对 BF 的形成有很强的抑制作用，对成熟膜也有较强的破坏作用。在所4 医药前沿 2024年3月 第14卷第8期 论著有的大环内酯类药物中，阿奇霉素作用最强，克拉霉素和罗红霉素次之16-17。除大环内酯类外，抗菌肽也是一种比较有前途的抗 BF 药物。现有的研究18-19显示，抗菌肽在抑制铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌 BF 形成方面作用显著，在破坏已经形成的 BF 方面也有很强的效果。国外一项研究表明，在气管导管上培养出多重耐药铜绿假单胞菌，使用噬菌体显著降低了其 BF的存活率20。最近的研究表明，芪归银方能够有效增强左氧氟沙星的抗菌作用，抑制铜绿假单胞菌 BF 形成21。国内赵玉婷等22通过转录组学策略分析了川银花对耐药铜绿假单胞菌 BF 的影响，认为川银花能抑制该种细菌 BF 的形成。临床实践显示，联合使用一些亚抑菌浓度的抗生素，也能抑制该菌 BF 的形成。在 1/2 MIC 浓度时，联合使用左氧氟沙星+亚胺培南，或左氧氟沙星+氨曲南；在体外试验中对铜绿假单胞菌 BF 的抑制指数大于 70%，显著高于单独使用这些抗生素23。细菌 BF 的培养需要肉汤和多孔固体附着物，在固体的血琼脂培养基上不易形成。国内李少滨等24在研究中草药提取物对铜绿假单胞菌 BF 的影响时，采用的是 LB液体培养基，在培养孔底部可以观察到 BF。但是，体内形成的 BF 的内含有宿主抗细菌形成的免疫复合物以及来自呼吸道分泌物的黏蛋白，体外培养体系中不具备这些成分。因此，体外培养形成的生物被膜对抗生素的隔离能力与体内或标本中原有的 BF 可能不同。痰液标本中的细菌经过血琼脂培养基培养，原有的 BF 消失，药敏试验结果不能反映抗生素的临床疗效，即使在体外药敏试验敏感，MIC 值远小于耐药折点，在临床治疗时仍有可能达不到抗菌效果。体外药敏试验结果仅反映在无BF 保护的情况下抗生素的抑菌或杀菌效果，与临床治疗效果无直接关系。通过染色方法，使用显微镜在痰液标本中检查到细菌 BF，使用合适的药物，破坏细菌 BF，或抑制细菌 BF 形成，使细菌暴露于敏感抗生素中，对提高临床疗效有着非常重要的意义。在临床体液标本中检出完整的 BF 比较困难，但是从BF 脱落的产膜细菌经革兰染色后，在镜下呈现出与其他细菌不同的特点。产膜细菌的周围被革兰阴性黏蛋白包绕，多为革兰阴性杆菌，个别情况下也可能混有革兰阳性球菌25。有人在研究铜绿假单胞菌 BF 与呼吸道反复感染的关系时，采用 1%复红染色法观察 BF，取得了较好的效果26，也可以采用结晶紫染色观察27。本研究采用了革兰染色法检查 BF。在油镜下，痰液中的 BF 呈红色。铜绿假单胞菌 BF 较厚，染色深，呈条索状，易聚集成片，膜内细菌细长，菌体为红色；肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌 BF 较薄，染色浅，膜内细菌呈球杆状。本研究结果为细菌学检验人员在痰液检验中识别细菌 BF提供了参考依据。本研究结果显示，70%的支气管扩张患者痰液中检出了细菌 BF，75%的 BF 阳性痰液可以培养出铜绿假单胞菌，其余为肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌。这些结果提示，反复感染的支气管扩张可能与细菌 BF，特别是铜绿假单胞菌 BF 有密切关系。由于铜绿假单胞菌 BF 较厚，呈条索状，膜内菌体细长，可以根据这些典型特征初步判为疑似铜绿假单胞菌，BF 阳性。临床医生可以根据初步判断结果选择合适的治疗方案，如左氧氟沙星+大环内酯、舒普深+大环内酯、左氧氟沙星+亚胺培南等，也可以联用中药制剂抑制 BF，如芪归银方或川银花等。但由于临床医生对 BF 了解不充分，需要细菌检验人员及时有效地提供指导或建议。本研究通过比较两组患者的住院时间，发现在检验人员发现产 BF 细菌，根据 BF特点，初步报告细菌种类，及时对临床治疗进行指导性干预，能够缩短患者住院时间。本研究尚存在一些不足。如，单个 BF 内有可能有多种细菌存在，也可能只有某一种细菌，如何确证显微镜下 BF 内的细菌与培养出的细菌是同一种细菌，还需要更多的研究。综上所述，慢性支气管扩张与 BF 密切相关，特别是铜绿假单胞菌 BF。BF 的产生导致抗生素难以作用于菌体，可采用大环内酯类抗生素或抗菌肽可以破坏或抑制细菌 BF，增加 BF 对抗生素的通透性，或使用芪归银方或川银花等中药也可以抑制 BF 的形成，增加抗生素的疗效。检查痰液中的细菌 BF，对慢性呼吸道感染的治疗有重要意义。在显微镜下观察到 BF 后，根据被膜和膜内细菌的形态以及染色特点可做出初步诊断，并及时与临床沟通，必要时向临床医师普及生物被膜相关知识，对于临床医师调整治疗策略，提高疗效，缩短住院时间，有着重要的意义。【参考文献】1 LIN J L,XU J F,QU J M.Bronchiectasis in China J.Ann Am Thorac Soc,2016,13(5):609-616.2 WANG N,QU J M,XU J 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