多光谱方法结合理论计算探究...1与亚胺培南之间的相互作用_张椰莉.pdf

第 卷，第期 光谱学与光谱分析 ，年月 ，多光谱方法结合理论计算探究金属内酰胺酶 与亚胺培南之间的相互作用张椰莉，程建伟，董晓婷，边六交太原师范学院生物系，山西 晋中 西北大学生命科学学院，陕西 西安 太原师范学院地理科学学院，山西 晋中 摘要金属内酰胺酶（）可以水解几乎所有的内酰胺类抗生素，这是导致细菌感染治疗中产生耐药性的主要机制。迄今为止，由于缺乏临床批准的抑制剂，这已成为全球关注的问题。最近来自粘质沙雷氏菌的 被发现是一种新型的 亚类，它可以灭活几乎所有含内酰胺环的抗生素。为了明确 与内酰胺类抗生素的特异性分子识别和作用机制，采用内源性荧光光谱、同步荧光光谱、三维荧光光谱及分子对接方法对碳青霉烯类抗生素亚胺培南（）与金属内酰胺酶 之间的相互作用机制进行探究。猝灭光谱结果表明 可以使 内源性荧光猝灭，且猝灭机制为动态和静态组合猝灭，其中静态猝灭为主，结合常数为 （），表明两者之间具有很强的结合力；根据 方程得出结合过程中的热力学参数，说明两者的结合是由焓变和熵变共同驱动的，且氢键和范德华力为主要作用力；同步荧光结果中，随着 浓度的增加，最大发射波长均发生蓝移 和 ，表明 和 残基参与 与 的结合过程；三维荧光光谱中 加入后，的 和 强度显著降低，表明 与 作用之后的微环境和构象发生了改变，与同步荧光结果一致。分子对接结果中 的内酰胺环进入 的结合口袋，而侧链因空间位阻效应位于活性口袋的外部，表明 主要是识别 的核心结构，与其 侧链的作用较弱；与 参与作用的氨基酸残基包括 ，和 ，表明这些氨基酸残基与活性部位的两个锌离子是设计具有强亲和力的 抑制剂的关键因素；结合自由能也为负值，表明两者的结合是一个自发放热的过程，与荧光结果一致。该研究提供了对 与 的识别和结合的见解，可能有助于设计内酰胺酶新底物和开发对超级细菌具有抗性的新抗生素。关键词金属内酰胺酶；亚胺培南；荧光光谱；分子对接；相互作用中图分类号：文献标识码：（）收稿日期：，修订日期：基金项目：国家自然科学基金项目（），山西省基础研究计划项目（）资助作者简介：张椰莉，女，年生，太原师范学院生物系讲师 ：通讯作者 ：引言近年来，致病性“超级细菌”中金属内酰胺酶（，）的出现，已引起了人们极大的关注。它能够使绝大多数的内酰胺类抗生素失效，包括碳青霉烯抗生素，进而使细菌产生耐药性演变为“超级细菌”。因此，研究金属内酰胺酶与抗生素的作用机制是解决细菌耐药性的前提。依据序列相似性和锌结合模式，金属内酰胺酶分为三个子类，和，其中，是单锌酶，活性位点只需要个锌离子参与，而 和 是双锌酶，活性位点需要个锌离子维持。虽然序列彼此之间同源性有差异，但是它们几乎可以水解全部的内酰胺类抗生素，且目前临床上没有显著的抑制剂被报道，已逐渐威胁到全球人类的生命健康。金属内酰胺酶 作为 亚类的新成员，据报道从肠杆菌粘质沙雷氏菌（）中鉴定出来，其对头孢菌 素和碳 青 霉 烯类抗 生 素 均具 有 高 效 的 催 化 活性。锌离子活性位点与其他 成员一致，结合位点由 、和 组 成，结 合 位 点 、，和 组成，其中锌配位的 作为亲核试剂，促进催化水解反应的发生。等通过量子力学和分子动力学组合模拟了 与氨苄西林的水解过程得出内酰胺开环反应会生成保守的氮阴离子中间体，在 所 得 的 氮 阴 离 子 和 之 间 形 成 新 的 连 接。等解析 与水解的碳青霉烯类抗生素的复合物，得出水解机制，但是未进行水解前的物理识别过程，即结合过程中的分子识别和相互作用的研究。尽管 的晶体结构已被解析，但是与抗生素复合物的晶体结构还未获得。因此，通过了解 和底物抗生素之间的分子识别机制，可能对进一步研发 抑制剂具有重要意义。本研究选取亚胺培南为（，）碳青霉烯类抗生素的代表，联 合 使 用 光 谱 学 和 分 子 对 接 方 法，探 讨 了 与 之间的相互作用机制，也为未来新型抗生素药物的开发提供一些参考和启发。图 的活性口袋（）和亚胺培南结构式（）（）（）实验部分 试剂与仪器金属内酰胺酶（西北大学边六交教授实验室提供），亚胺培南（美国 公司），、和 均为分析纯，实验用水为均去离子水。荧光分光光度计（美国安捷伦公司），型 值测定仪（上海雷磁有限公司），分析天平（瑞士梅特勒托利多公司），型精细电子天平（美国 ：公司），型制冰机（河南天驰卓达有限公司），酶标仪（宝特）。方法 溶液配制缓冲液：配置 磷酸盐溶液（）和 溶液，室温保存。储备液：用缓冲液配制浓度为 的 储备液，保存备用。亚胺培南（）储备液：用缓冲液配制浓度为 的 储备液，分装保存备用。与 相互作用的猝灭荧光光谱测定将 储备液置于 石英比色皿中提前预冷，并添加不同浓度的 溶液，使 与 的最终浓度之比分别为，和。在激发波长 处测定不同温度 、和 下的猝灭荧光，参数设置如下：激发和发射狭缝宽度均为 ，扫描速度 ，扫描范围 ，电压 。以 缓冲液和不同浓度亚胺培南为空白对照，每个样品重复测量三次。与 相互作用的同步荧光光谱测定将 溶液（）置于 石英比色皿中提前预冷，并添加不同浓度的 溶液，使 与 的最终浓度之比分别为，和 ，加样总体积尽量小于 。分别在为 和 下进行同步荧光测定，扫描参数设置如上，扫描范围 。与 相互作用的三维荧光光谱测定分别测定 与 复合物的三维荧光光谱，与 终浓度比为，其中参数设置如下：激发和发射波长扫描范围分别为 和 ，记录波长间隔为，其余参数设置同上。与 之间的分子对接研究 的 晶 体 结 构（）是 从 蛋 白 质 数 据 库（：）获 得 的，的 结 构 来 自 于 数据库（：）。在分子对接之前，中水分子和杂原子通过 软件进行处理，结构通过 软件实现能量最小化和质子化。采用 程 序 展 开 对接，通过 半 柔 性 对 接 方 法 和 遗传算法预测 与 的相互作用信息。基于合理的结合位点和最小的结合自由能选择最佳的结合构象，并对其采用 和 软件进行可视化作图。结果与讨论 猝灭荧光光谱测定 等报道了，在 下，与 相互作用时 的为 ，为 ，（）为 ，表明在此温度下 对 的水解效率较低。因此，可通过降低温度来降低水解速光谱学与光谱分析第 卷率，从而延长分子识别时间（物理反应）和水解时间（化学反应）。基于此背景，本研究在 和 内完成荧光光谱的测定，且在实验过程中，过量，与 一直处于互作状态，可认为实际测定的光谱数据来自于 与 的复合物。因此，荧光光谱分析可用于分析 与 之间的相互作用。分子中含有个 、个 和个 ，这些氨基酸残基使得其产生很强的内源性荧光，在 处激发，最大发射峰出现在 ，而 无荧光发射，对实验不产生“内滤光效应”干扰。在模拟人体生理条件下，不同浓度 对 荧光光谱影响结果见图。随着 浓度不断增加，荧光强度呈现明显减弱趋势，但荧光发射峰位置和峰形没有明显变化，说明在 与 相互作用过程中，它们之间形成了非共价键而不是共价键。图不同浓度下 对 的猝灭光谱图 ，（，）（从上至下），（，）（），相互作用机制分析 荧光猝灭机制物质的荧光猝灭通常可以由动态猝灭、静态或动静态猝灭引起 。对 于 诱 导 的 荧 光 猝 灭 可 通 过 等式展开分析 （）式（）中，和分别表示不存在和存在 的情况下 的荧光发射强度；为动态猝灭速率常数；为在没有猝灭剂的情况下荧光基团的平均寿命，相对于生物大分子约 ；为 猝灭常数；为溶液中 的浓度。通过温度与激发态寿命之间的关系，可以区分动态或静态猝灭。对于动态猝灭，较高的温度将带来更快的扩散和更多的随机碰撞猝灭，因而荧光猝灭常数将随温度的升高而增加，而在静态猝灭中则相反 。从式（）中可看出，无论是动态还是静态猝灭，与 的关系是线性的。然而，对于动态和静态猝灭的组合，与 的关系是非线性，可用修正的 式（）来解释。（）（）（）（）在此，和代表猝灭过程中的动态和静态猝灭常数。对各种浓度 配制的溶液，分别测定 、和 下 的荧光发射光谱。从图可以看出，与 的关系是非线性的，表明 与 的荧光猝灭机制可能是由动态和静态猝灭相结合引起的，猝灭速率常数均远大于最大动态猝灭常数（），进一步证明了荧光猝灭过程主要是静态猝灭主导。图不同温度下 对 的 曲线 表不同温度下 对 的猝灭常数和速率常数测定 底物温度猝灭常数（）速率常数（）相关系数 结合常数在猝灭过程中，酶与配体（）的结合常数可通过式（）推导。（）（）（）式（）中，和 与式（）中的相同；为荧光比；为等于的解离常数，其中指结合常数；是指蛋白质浓度；是结合位点的数量，许多研究表明金属内酰胺酶与抗生素之间形成的复合物（）。此外，该方程还存在两个限制条件：添加的配体浓度约等于游离配体浓度，并且生成的复合物不产生荧光（）。根据式（）在三种不同的温度 、和 下，对与进行了非线性拟合，并分别获得了 与 结合的特征参第期张椰莉等：多光谱方法结合理论计算探究金属内酰胺酶 与亚胺培南之间的相互作用数。从表中可以看出，随着温度从 升高到 ，对于 与 的结合，值从 降低到 。说明温度显著影响 与 的结合。图不同温度下 与 相互作用的对的拟合曲线 热力学参数和结合力在蛋白质与配体的结合过程中，存在以下非共价相互作用：疏水相互作用，静电力，氢键和范德华力。根据 定律可知：（），主要的相互作用力是疏水相互作用；（），主要的相互作用力是静电相互作用；（），主要的相互作用力是氢键相互作用和范德华力，可通过式（）计算（）式（）中，为气体常数（），为温度，是相应温度的结合常数。因此，可以从截距和斜率得出、和 对的关系。从式（）可以进一步计算出自由能（）如表所示，所有和均为负，表明 与 的结合是自发的且放热的。为负，为负，表明它们之间的结合是由焓变和熵变共同驱动的，结合力主要为氢键相互作用和范德华力。表不同温度下 对 的结合常数及热力学参数测定 温度结合常数（）（）（）（）同步荧光分析同步荧光可以提供发色团附近分子环境的相关信息，通常用于探索蛋白质氨基酸残基微环境的变化 。当波长差为 和 时，所得光谱分别代表色氨酸和酪氨酸残基的光谱特征，而且每个氨基酸残基的最大发射波长的位置受其微环境的极性影响。最大发射波长向左移，即发生蓝移，表明分子微环境的疏水性增加；而向右移为红移表明微环境的疏水性降低。图为 下 与不同浓度的 作用时的同 步 荧光光谱。从图中可以看出，随着 浓度的增加，荧光强度都在降低，最大发射波长均发生蓝移 和 ，表明 中色氨酸和酪氨酸残基的微环境受 的影响，均发生变化，即 与 发生诱导契合效应。在 分子中，分别有个 和个 位于结合口袋附近，增加疏水性利于 的结合。图不同浓度 对 （）和 （）同步荧光光谱结果 ，（，）（从上至下），（）（），（，）（），光谱学与光谱分析第 卷 荧光光谱分析 荧光光谱常广泛应用于探索蛋白质的构象变化。图为 有无 存在下 的 荧光光谱 。其中，峰 表示瑞利散射峰（），峰 表示 和 残基的光谱信息，峰 代表二阶散射峰，主要显示多肽骨架的光谱信息。如图所示，与未加 图（）相比，加入 图（）后，的峰 从 移至 ，荧光强度从 降低到 ；峰 从 移至 ，荧光强度由 降至 ，这意味着 的微环境和构象均发生了变化，与同步荧光光谱的结果一致。图 与 作用前（）后（）三维荧光光谱图 ，（）（），与 的分子对接分析分子对接是预测结合位点和作用力的一种理论模拟技术，可获得蛋白与配体相互作用的详细信息 。通过分子对接直观的描述了 与 相互作用机制。图为 与 的分子对接最佳结合结果，从图（）可知，分子核心进入了活性口袋，侧链可能因空间位阻较大暴露于外侧，说明 主要与 的核心结构发生作用；从图（）中可以得出，的质子化会导致 配位键的丢失，而 羧酸盐的丢失基团下移成为 的一个新的配体，分子中 羟基氧参与 的配位键，另一个羧基氧分别与 和 形成氢键，羧基氧同时与 残基和桥接水相互作用，侧链原子与 形成氢键，氨基氢分别与 和 互相作用，这些非键作用力增加 复合物的稳定性，可见氢键为主要结合力，均可以促进 对 的识别，且进一步表明这些氨基酸残基与活性部位的两个锌离子是设计具有强亲和力的 抑制剂的关键因素。从结合模式中计算出 ，为负值，说明它们之间的结合是一个自发的放热过程，与前期荧光结果一致。但是数值上存在差异，可能是实验环境条件不同。同时在结合口袋附近也有疏图 与 结合的 图（）和二维图（）（）（）第期张椰莉等：多光谱方法结合理论计算探究金属内酰胺酶 与亚胺培南之间的相互作用水氨基酸残基 与 参与作用，使得其疏水性增加，有利于与 结合，这也与前期同步荧光结果一致。结论通过内源性荧光光谱、同步荧光光谱、三维荧光光谱及分子对接方法探究碳青霉烯类抗生素亚胺培南（）与金属内酰胺酶 之间的作用机理。猝灭光谱结果表明 可以使 内源荧光猝灭，且猝灭机制为动态和静态组合猝灭，其中静态猝灭为主；同步和三维荧光光谱表明中 与 作用之后的微环境和构象发生了改变。分子对接表明 的内酰胺环进入 的结合口袋，而侧链位于活性口袋的外部。结合是由焓变和熵变共同驱动的，与荧光结果一致。本研究提供了对 与 的识别和结合的见解，这可能有助于设计内酰胺酶新底物和开发对超级细菌具有抗性的新抗生素。，：，（）：，（）：，（）：，（沈秉正，宋金春，彭燕，等）（广东药学院学报），（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，：，：，：，：，（）：，：，（）：，（）：，：光谱学与光谱分析第 卷 ，（），（），；（），；，；，；，；，；（，；，）第期张椰莉等：多光谱方法结合理论计算探究金属内酰胺酶 与亚胺培南之间的相互作用