露水草中β-蜕皮甾酮提取工艺优化及其体外抗氧化能力研究.pdf

年 月云南化工 第 卷第 期 ，：露水草中 蜕皮甾酮提取工艺优化及其体外抗氧化能力研究张彦昕，柴贝贝，石玉节，李海利 （郑州赛科药业科技有限公司，河南郑州 ；河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南郑州 ）摘要：为探究露水草 蜕皮甾酮的最佳提取工艺，分别考察提取方式和提取温度对 蜕皮甾酮含量的影响；使用高效液相色谱法检测含量，利用 和 方法评价最佳提取工艺得到 蜕皮甾酮的抗氧化能力。使用温浸提取和加热回流两种提取方式，分别考察了 、下溶剂为水的提取物中 蜕皮甾酮的含量；选择最佳提取工艺进行提取，进行方法学考察；利用 和 体外自由基清除实验测定其抗氧化活性。结果表明，以水为溶剂，加热回流的提取方式得到的 蜕皮甾酮的含量最高；在该液相条件下，露水草样品可快速检出并且峰型良好，分离度高。通过自由基清除实验表明其具有体外抗氧化能力并呈一定浓度依赖型。关键词：露水草；蜕皮甾酮；高效液相色谱；方法学验证；抗氧化中图分类号：文献标识码：文章编号：（），（，；，）：，：；露水草（）又名珍珠露水草，一般指蛛丝毛蓝耳草，为鸭趾草科（）多年生宿根性草本，主要分布于印度、越南等东南亚地区。我国主要分布于大陆南部及台湾等地，生长于海拔 以下的溪边、山谷湿地或者湿润岩石上。露水草通常每年八月下旬至十月下旬采收（洗净，鲜用或晒干），以全草入药，味甘、性平，可用于治疗风湿痹痛、虚热不退、咽喉肿痛、蛇虫咬伤等。蜕皮甾酮（）又称 羟基蜕皮甾酮（）、露水草素，是露水草中主要活性物质之一，用于防治害虫及提高虾蟹产量。现代药理研究表明，蜕皮甾酮可以上调 的合成速率，促进核酸和蛋白质的合成 ；治疗风湿、关节炎 ；调节糖代谢、促进脂类代谢 ；免疫调节 ；影响中枢神经系统 ；促进分化人体表皮细胞，合成人体中胶原蛋白 ；心血管保护作用；等等 。因此 蜕皮甾酮广泛用于水产业、化妆品和医药行业，主要剂型有针剂、膏剂、片剂等。近几年，学者或工业上对露水草的研究主要集中在生物活性及药理作用。本实验结合工业生产条件，优化提取工艺，利用 测定最优工艺露水草提取物中 蜕皮甾酮的含量，研究其体外抗氧化能力，为露水草的生产和开发利用提供参考。试剂与仪器露水草（云南），经河南牧业经济学院付运星鉴定为鸭趾草科露水草干燥根茎。蜕皮甾酮标准品（北京普天同创生物科技有限公司）、屈臣氏蒸馏水、乙醇（分析纯）、甲醇、乙腈（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）。电子天平（），油浴磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限公司），旋转蒸发仪（巩义市予 年 月云南化工 第 卷第 期 ，华仪器有限公司），恒温水浴锅（上海树立仪器仪表有限公司 ），高效液相色谱仪（安捷伦 美国），时间分辨荧光酶标仪（）。试剂盒和 试剂盒，均采购于南京建成生物工程研究所。研究方法 样品前处理取适量干燥露水草根，为适应生产型企业的提取方式，只剪碎露水草根，备用。提取工艺研究 温浸提取参考传统工厂生产提取露水草的工艺，本研究选择 、温浸提取，料液比 ，共提取两次，次，提取时用保鲜膜封住瓶口，考察温度对 蜕皮甾酮的提取影响。提取续滤液合并浓缩，加入 乙醇进行醇沉 ，取醇沉上清液真空浓缩至干，得到干燥提取物，避光保存。加热回流提取回流提取通过加热和冷却来分离有效成分，可以大大增加提取率。本研究分别考察了 、回流提取，料液比 ，共提取两次，次。提取续滤液合并浓缩，加入 乙醇进行醇沉 ，取醇沉上清液真空浓缩至干，得到干燥提取物，避光保存。高效液相检测 标准对照品溶液配制精密称定 蜕皮甾酮 于 棕色容量瓶，甲醇定容刻度，得质量浓度为 的标准储备液。供试品溶液配制精密称定各个样品的干燥提取物至 棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到样品溶液，每个样品检测三次。为方便记录，对样品进行编号，如表 所示。表 提取物样品及编号编号样品 温浸，提取 温浸，提取 温浸，提取 回流，提取 回流，提取 回流，提取 仪器色谱条件色谱柱：（，）；色谱条件：（甲醇）（乙腈）（水），等度洗脱 ，柱温 ，波长 ，流速 ，进样量 。体外抗氧化研究）法检测露水草提取物的抗氧化能力。根据待测样品及标准品的数量，配制适当的 储备液。同时用无水乙醇配置不同质量浓度的 样品溶液和 标准溶液（终质量浓度分别为 、）。每个样品分别设置 个复孔，并在空白对照孔、标准曲线孔和样品孔中分别加入 无水乙醇溶液、不同质量浓度的 标准溶液和样品溶液，随后在每孔加入 储备液，室温静置孵育 后，测定其在 处的吸光度。自由基清除率 （）。其中，样品及标准品的吸光度值记为；空白对照孔的吸光度值记为。）法检测露水草提取物的抗氧化能力。溶液和氧化剂溶液体积比 配制适量的 工作母液，避光放置 后，使用 乙醇将其稀释成 工作液，同时配置不同浓度的样品溶液和 标准溶液（终质量浓度分别为 、）。每个样品设置 个复孔，空白对照孔、标准曲线孔和样品孔中分别加入 乙醇溶液、不同质量浓度的 标准溶液和样品溶液。每孔加入适量 工作液，室温静置孵育 ，测定其在 处的吸光度。自由基清除率 （）。其中，样品及标准品的吸光度值记为；空白对照孔的吸光度值记为。研究结果 提取方式的选择根据峰面积，计算不同提取方式下 蜕皮甾酮的含量。由表 可知，选择加热回流提取的含量高于温浸提取的。表 各样品出峰时间、峰面积及 蜕皮甾酮含量样品保留时间 保留峰面积 （蜕皮甾酮）提取温度的选择根据峰面积，计算不同提取温度下 蜕皮甾酮 年 月云南化工 第 卷第 期 ，的含量。由表 可知，温度提取时有效物质含量最高。高效液相色谱方法学验证结果）专属性考察结果。取对照品溶液、样品，按上述方法制备供试品溶液、阴性对照品溶液。按照 色谱条件下进样，每针进样三次，记录色谱图（图 ）。由图 可知，阴性对照品色谱在对照品出峰位置上无干扰峰，即本实验条件下对测定干扰较小，系统误差较小。（）阴性对照色谱图（）对照品色谱图（）样品色谱图图 专属性考察结果图）精密度考察结果。取 样品，按上述方法制备供试品溶液。在 色谱条件下，连续进样 次，记录并分析色谱峰，如表 所示。由表 可知，每次进样色谱峰相对保留时间的 均小于 ，相对峰面积的 均小于 ，表明仪器的精密度良好。表 精密度测定结果样品峰面积 平均峰面积 ）重复性考察结果。取 样品，按上述方法制备供试品溶液 份。在 色谱条件下进样，记录并分析色谱峰，如表 所示。由表 看出，每次进样色谱峰相对保留时间的 均小于 ，相对峰面积的 均小于 ，表明该方法的重复性良好。表 重复性测定结果样品峰面积 平均峰面积 ）稳定性考察结果。取 样品，按上述方法制备供试品溶液。在 项色谱条件下，在制备后分别于 、时进样，记录分析色谱峰，如表 所示。由表 看出，每次进样色谱峰相对保留时间的 均小于 ，相对峰面积的 均小于 ，表明样品的稳定性良好。表 稳定性测定结果样品峰面积 平均峰面积 ）线性考察结果。取标准储备液精密稀释至质量浓度为 、的标准溶液，吸取上述质量浓度标准溶液与 的标准溶液各 进样，每个质量浓度重复进样三次，结果见图 。图 蜕皮甾酮标准曲线 年 月云南化工 第 卷第 期 ，）加标回收率考察结果。精密称取已知含量的 样品 份（每份 ），再分别精密加入对照品溶液，标准品含量为样品含量的 、，超声混匀，滤过。按 色谱条件测定，每份进样 次，结果见表 。表 加标回收率测定结果加标样品峰面积 平均峰面积 体外抗氧化结果如图 所示，露水草提取物对于 自由基的清除能力随着质量浓度升高而增加，当样品质量浓度达到 以上时，抗氧化能力趋于稳定，此时对 自由基的清除率达到 ；同样，抗氧化能力检测结果显示，露水草提取物对 的自由基也表现出较好的清除能力，为 左右。（）自由基清除结果图（）自由基清除结果图注：橙色代表 ，蓝色代表露水草提取物样品图 及 清除自由基结果 结论露水草在各行业中应用广泛，但对其提取工艺研究的不多。为结合工业化生产与利用，本研究在单因素实验基础上，考察了露水草中 蜕皮甾酮的最优提取方式。在以水为溶剂，加热回流提取条件下，蜕皮甾酮的质量分数可达到 左右。在本实验建立完整的液相检测条件下，标准曲线相关系数达到 ，精密度、重复性、稳定性、加标回收率的 均小于 。通过体外抗氧化实验得出，露水草提取物可以有效清除自由基，为露水草以后的应用提供参考。参考文献：，（）：邱胡华，聂瑞麟 植物蜕皮激素的开发和利用 资源科学，（）：陈秋，夏永鹏，邱宗荫 蜕皮甾酮对胰岛素抵抗细胞模型胰岛素敏感性和糖代谢的影响 中国药理学通报，（）：朱江燕，黄健华，时敏，等 昆虫海藻糖代谢及其影响因素的研究进展 应用昆虫学报，（）：，（）：严才平，陈路，邓长弓，等 蜕皮甾酮促进小鼠前成骨细胞体外增殖及诱导成骨分化 中国组织工程研究，（）：梁卓菲，梁小飞，吴国庆，等 蝇子草属植物化学成分及药理作用研究进展 中草药，（）：赵立敏，王琦，张勇 蜕皮甾酮应用于心血管疾病的研究进展 世界中医药，（）：杨奋有，张俊权，赵忠，等 蜕皮激素对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用的实验研究 中药药理与临床，（）：收稿日期：基金项目：河南省科技攻关项目（）；郑州市高端外国专家技术合作项目（）。作者简介：张彦昕（），女，河南新乡人，硕士，从事中药分析与药理学研究。通讯作者：李海利（），男，河南郑州人，博士，副研究员，从事动物疫病防控研究和细菌耐药研究。：