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CaMK II在脊髓背角LTP中调节AMPA受体GluR1亚单位的磷酸化 作者：信文君， 许继田， 宫庆娟， 魏绪红， 张彤， 李永勇， 刘先国【摘要】 【目的】 研究钙/钙调素调依赖性蛋白激酶II在大鼠脊髓背角C纤维诱发电位长时程增强(LTP)中对-氨基羟甲基异恶唑丙酸(AMPA)受体GluR1亚单位磷酸化的影响，探讨长时程增强的分子机制。【方法】 利用电生理和Western blot 方法，检测脊髓背角LTP后30 min 和3 h AMPA受体GluR1亚单位Ser831和Ser845位点磷酸化水平，同时在强直刺激前，脊髓局部给予CaMKII特异性抑制剂KN-93，检测GluR1亚单位Ser831和Ser845磷酸化水平变化。【结果】 强直刺激后30 min、3 h，脊髓背角AMPA受体GluR1亚单位Ser831和Ser845磷酸化水平明显增加。 脊髓背角局部给予KN-93，阻断了LTP的诱导并且也阻止了GluR1亚单位Ser831和Ser845磷酸化水平的增加。【结论】 强直刺激可导致GluR1亚单位Ser831和Ser845激活且它的激活可能是通过CaMKII来实现的。【关键词】 钙调依赖性蛋白激酶; 长时程增强； GluR1； KN-93； 磷酸化作用； 脊髓背角 J SUN Yat-sen Univ(Med Sci), 2007, 28(3):241-245 长时程增强是突触传递效率的长时程增强，海马LTP被认为是学习和记忆的突触模型1，由于C纤维与脊髓背角浅层神经元形成突触联系传导伤害感受信息，因此电刺激C纤维或者是神经损伤引起的脊髓背角LTP被认为是痛记忆的一种形式，一些在海马LTP中起关键作用的细胞内信号转导途径，如蛋白激酶A、蛋白激酶C、钙调依赖性蛋白激酶II等，在脊髓背角LTP中也有作用4，5。由于CaMK II在中枢神经系统中分布广泛，且在与记忆有关的海马脑区密度非常高，因此CaMK II被认为是与LTP和记忆最为密切的激酶。CaMK II的磷酸化对于海马LTP是非常关键，它的激活可导致细胞内Ca2+ 浓度升高，且抑制剂可阻止LTP诱导。CaMKII的激活能够磷酸化AMPA受体，从而提高它的单通道电导性。 AMPA受体是GluR1GluR4 4个亚单位组成的多聚体，在海马LTP中介导快速的突触电流。在所有的AMPA受体亚单位中，GluR1对于成熟动物海马LTP的建立非常重要 。GluR1有两个主要的磷酸化位点，Ser831和Ser845，它们的磷酸化作用可改变AMPA受体的功能。体外研究已经证实，CaMK II可以使GluR1 Ser831发生磷酸化，而PKA可磷酸化Ser845位点10。 脊髓背角C纤维诱发电位LTP与海马LTP和中枢敏感化有相同的机制11。然而，在脊髓LTP中，目前还没有证据显示GluR1哪一个位点被激活，我们先前的研究已经发现CaMK II在脊髓LTP的诱导和维持起关键作用，但CaMK II是否也影响AMPA受体的磷酸化水平，这依然不太清楚。因此，本研究将检测 脊髓背角LTP期间， GluR1可能被激活的位点； 强直刺激后，脊髓局部应用CaMK II选择性抑制剂KN93是否抑制GluR1磷酸化水平的升高。 1 材料和方法 实验动物与试剂 体质量250280 g的SD雄性大鼠，由中山大学实验动物中心提供，分笼饲养。KN-93购于sigma公司，溶解于少量二甲亚枫，配制成1 mmol/L的储存液，后用ACSF稀释成工作浓度(100 mol)，DMSO的终浓度不超过。 手术准备及电生理记录 乌拉坦腹腔注射麻醉，行常规气管插管和颈静脉插管，在腰4腰6间行椎板切除术，暴露腰膨大。游离左侧坐骨神经，使用双极氯化银电极刺激坐骨神经。除用于记录的脊髓节段外，暴露的神经组织均用石蜡油覆盖。颈外动脉插管持续监测动脉血压 kPa(80100 mmHg)。用热反馈系统使大鼠肛温维持在 。 脊髓背角C纤维诱发电位的记录方法如文献所述12。用钨丝微电极进行细胞外记录，电极深度在脊髓表面下100500 ?滋m。用数/模转换器以10 kHz的速度处理和储存数据。以C纤维诱发电位的幅度作为参数。单方波刺激分离的左侧坐骨神经诱发脊髓背角电位，强直刺激诱导C纤维诱发电位LTP。坐骨神经的刺激点到脊髓背角的记录点约为11 cm。 Western blotting 方法如文献所述5，13，分离大鼠L4L6段脊髓，取刺激同侧脊髓背角，于pH 、15 mmol/L Tris buffer 的裂解液中匀浆，裂解液成份见文献，冰上超声。4 ， 13 000 g 离心15 min ，取上清。加样于SDS-PAGE凝胶上，200 V电泳45 min，后100 V、1 h转至PVDF膜上，室温封闭1 h，一抗孵育1 h，漂洗3次，用耦合辣根过氧化物酶的二抗孵育1 h，漂洗3次，ECL显色13 min，曝光。计算机灰度扫描，定量分析。 统计学处理 实验结果用SPSS 统计软件处理，所用数据用均数标准差表示，用非参数检验比较均数间差异。取?琢=。 2 结 果强直刺激激活脊髓背角GluR1亚单位 首先用Western blotting方法检查脊髓背角LTP后不同时间刺激同侧AMPA 受体GluR1亚单位蛋白总量及磷酸化的表达。结果显示GluR1亚单位磷酸化和蛋白总量的位置大约都是110 ku，且LTP后30 min和3 h，GluR1蛋白总量与对照组无显着差别，然而GluR1 Ser831 和 Ser845磷酸化水平与对照组相比明显增加，LTP后30 min和3 h，Ser831磷酸化水平分别是对照组的和倍；同样Ser845磷酸化水平分别增加和倍。 CaMK II抑制剂KN-93对AMPA受体GluR1磷酸化的影响 在强直刺激前30 min脊髓局部应用100 M KN-93，发现KN-93完全抑制了LTP的诱导。强直刺激后C纤维的反应幅度与基线无区别(Friedman ANOVA, P , n=6, 图4A, open circle)，而%的DMSO不影响LTP的诱导。 为了证明KN-93对脊髓背角LTP的影响是由于GluR1没有被激活所导致，在强直刺激后30 min，取脊髓样品进行Western blot检测。结果显示：与DMSO组相比，KN-93明显降低了GluR1 Ser831 和 Ser845的磷酸化水平，与只给予测试刺激的对照组无任何差别。相反，DMSO既不能阻断LTP的诱导，也不能降低GluR1的磷酸化水平。 3 讨 论 本研究用电生理和免疫印迹方法检测了(1)脊髓背角LTP期间，AMPA受体GluR1亚单位不同位点的磷酸化情况，(2) KN-93对GluR1亚单位磷酸化的影响。发现强直刺激30 min和3 h后，脊髓背角AMPA受体GluR1亚单位Ser831和Ser845磷酸化水平明显升高；脊髓局部应用CaMK II抑制剂KN-93抑制了LTP的诱导，且阻断AMPA受体GluR1亚单位磷酸化水平的升高。结果显示强直刺激激活GluR1亚单位，其磷酸化是通过CaMK II来调节的。 AMPA受体是离子型谷氨酸受体，介导快速兴奋性突触传递。海马中它是与CaMK II作用的关键蛋白之一14。大量的研究表明伤害性刺激可以激活背角浅层传入纤维的谷氨酸能突触和突触后神经元的AMPA受体12，15。脊髓局部应用AMPA受体阻断剂，NBQX，可显着抑制正常和炎症疼痛大鼠的C纤维诱发的背角神经元的反应16。基于所有这些证据，我们认为AMPA受体GluR1亚单位的磷酸化作用对于LTP的诱导和维持是非常关键的。 体外许多实验已经证明，GluR1的活性是通过Ser831 和 Ser845的磷酸化实现的17，它们可以被许多激酶调节，如CaMK II、PKA 和 PKC。在脑内，CaMK II需要激活30 min才能使AMPA受体磷酸化并且对LTP的诱导和维持发挥最大作用。我们先前的研究已经显示脊髓背角LTP 可使CaMK II的磷酸化至少维持3 h，但脊髓LTP中，GluR1的激活是否也需要CaMK II磷酸化需进一步证明。本研究中，强直刺激前30 min 脊髓局部加入CaMK II选择性抑制剂，KN-93，阻断了GluR1亚单位在Ser831和Ser845位点的磷酸化。脊髓LTP期间，CaMK II磷酸化GluR1 Ser831位点与海马的结果相一致。然而，我们不知道为什么KN-93能够阻断GluR1 Ser845位点的磷酸化，因为体外实验表明它是PKA的磷酸化作用位点。KN-93也许是通过间接的方式实现的。我们已经知道CaMK II能够使NMDA受体激活，促使细胞内Ca2+浓度升高18。KN-93阻断了Ca2+内流和Ca2+-钙调复合物的形成，从而可能导致腺苷酸环化酶和PKA的水平降低，以至阻断GluR1 Ser845位点的磷酸化。 总之，本研究不仅证明了脊髓LTP可使AMPA受体GluR1亚单位Ser831和Ser845发生磷酸化，而且它们的激活可能是被CaMK II所调节。 【参考文献】 BLISS T V, LOMO T. 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