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-9-16BT-9-16BT基基因工程因工程-概概论论概概 论论2 要要 求求 1 1、掌握掌握基因工程的概念基因工程的概念 2 2、掌握掌握基因工程的基本过程基因工程的基本过程 3 3、熟悉熟悉工具酶和载体类型及应用工具酶和载体类型及应用 4 4、熟悉熟悉原核、真核细胞转染、表原核、真核细胞转染、表 达的基本方法和类型。达的基本方法和类型。5 5、熟悉熟悉基因工程产生的基础和过程基因工程产生的基础和过程 (科研思维与方法）。科研思维与方法）。6.6.设计一个基因克隆的程序设计一个基因克隆的程序。3参考书参考书n楚雍烈，楚雍烈，现代生物技术（西安交通大学讲义）现代生物技术（西安交通大学讲义）nGene cloning,T.A.Brown.Gene cloning,T.A.Brown.n基因工程原理，吴乃虎编著，科学出版社基因工程原理，吴乃虎编著，科学出版社n基因工程概论，张惠展编著，华东理工大学出版社基因工程概论，张惠展编著，华东理工大学出版社n分子克隆实验指南，分子克隆实验指南，J.Sambtook,EF Frish,T J.Sambtook,EF Frish,T Maniatis,Maniatis,金冬雁，黎孟枫等译，科学出版社。金冬雁，黎孟枫等译，科学出版社。4 生物技术的核心内容生物技术的核心内容 n基因工程基因工程 （Gene engineering）nDNA重组（重组（recombinant DNA technology）n基因操作（基因操作（gene manipulation）n基因克隆（基因克隆（gene cloning）n分子克隆（分子克隆（molecular cloning）nDNA克隆（克隆（DNA cloning）n基因修饰（基因修饰（gene modification）5n基因工程的概念基因工程的概念n基因工程的意义基因工程的意义n基因工程的发展史基因工程的发展史n理论上的六大发现理论上的六大发现n技术上的六大进展技术上的六大进展n发展过程中的重大事件发展过程中的重大事件n基本步骤基本步骤:两个水平，六个阶段两个水平，六个阶段 内容提要内容提要6 一、基因工程的概念一、基因工程的概念 定义：定义：人们按照人们按照预定设计预定设计，在，在体外体外对对不同来源不同来源DNADNA分子分子进行人工切割、连接、插入载体进行人工切割、连接、插入载体DNADNA分子，使遗传物分子，使遗传物质质重新组合、改造重新组合、改造，经经转移转移、导入到原先不含有重导入到原先不含有重组体的组体的受体细胞受体细胞，使之持续稳定繁殖、目的基因扩使之持续稳定繁殖、目的基因扩增、表达，获得人类所需的增、表达，获得人类所需的产品产品的工程。的工程。7With Restriction enzymesWith Restriction enzymeswith DNA ligase enzyme(Genetic transformation)8基因工程的基本内涵基因工程的基本内涵 基因工程是指将一种生物体（供体）的基因基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的并表达出新产物或新性状的DNADNA体外操作程序，也体外操作程序，也称为分子克隆技术。称为分子克隆技术。因此，因此，供体、受体、载体供体、受体、载体是重组是重组DNADNA技术的三技术的三大基本元件。大基本元件。体外重建、基因转移体外重建、基因转移和和外源表达外源表达是是重组重组DNADNA技术的三大环节。技术的三大环节。9 基因工程的基本特征基因工程的基本特征n 基因工程有两个重要的特征：基因工程有两个重要的特征：一是可把来自一是可把来自任何任何生物的生物的基因基因重组重组和和转转移移到与其毫无关系的到与其毫无关系的任何任何其他受体细胞中，其他受体细胞中，因此可以实现按照人们的愿望，改造生物的因此可以实现按照人们的愿望，改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状；遗传特性，创造出生物的新性状；二是某一段二是某一段DNADNA可在受体细胞内进行可在受体细胞内进行基因基因复制复制和和表达表达，为准备大量纯化的为准备大量纯化的DNADNA片段提供片段提供了可能，拓宽了分子生物学的研究领域。了可能，拓宽了分子生物学的研究领域。10 基因工程的目的基因工程的目的 （1 1）获得目的基因，）获得目的基因，DNADNA的提取、纯化和的提取、纯化和 DNA DNA分子的克隆，分子的克隆，建立文库建立文库。（2 2）制备活性多肽产品：激素、细胞因）制备活性多肽产品：激素、细胞因 子、多肽药物疫苗等，子、多肽药物疫苗等，诊断和防治诊断和防治 疾病疾病。（3 3）研究）研究基因结构、功能基因结构、功能等等11二、基因工程的重大意义二、基因工程的重大意义（1 1）重组）重组DNADNA技术填平了生物种属间技术填平了生物种属间 不可逾越的鸿沟。不可逾越的鸿沟。跨越天然物种屏障，将原核和真核生物、跨越天然物种屏障，将原核和真核生物、植物和动物，造福人类，在过去人们难以植物和动物，造福人类，在过去人们难以置信的事情，现在已成为现实。置信的事情，现在已成为现实。12 （2 2）重组）重组DNADNA技术缩短了进化时间。技术缩短了进化时间。遗传和变异是一对矛盾，遗传赋予生遗传和变异是一对矛盾，遗传赋予生物种的稳定，变异赋予生物种的进化。在物种的稳定，变异赋予生物种的进化。在漫漫历史长河中，自然变异的进化时间是漫漫历史长河中，自然变异的进化时间是千万年，常规育种亦要几年；而重组千万年，常规育种亦要几年；而重组DNADNA技技术将进化时间大大缩短至几年。基因操作术将进化时间大大缩短至几年。基因操作用于育种，将缩短进化时间，在解决全世用于育种，将缩短进化时间，在解决全世界人民温饱问题上将发挥重要作用。界人民温饱问题上将发挥重要作用。13（3 3）重组）重组DNADNA技术使人类能对生物技术使人类能对生物 进行定向改造进行定向改造 重组重组DNADNA技术标志着人类控制和改造生物的技术标志着人类控制和改造生物的历史已进入一个新纪元。以重组历史已进入一个新纪元。以重组DNADNA技术培育技术培育出抗真菌蔬菜为例，几丁质是真菌细胞的组分出抗真菌蔬菜为例，几丁质是真菌细胞的组分之一，几丁质酶能水解几丁质，美国科学家将之一，几丁质酶能水解几丁质，美国科学家将几丁质酶基因导入西红柿、土豆、莴苣和甜菜几丁质酶基因导入西红柿、土豆、莴苣和甜菜中，正准备大田试验，这一技术将对蔬菜抗真中，正准备大田试验，这一技术将对蔬菜抗真菌感染具有重要意义。菌感染具有重要意义。14（4 4）利用重组）利用重组DNADNA技术可以在体外大技术可以在体外大量扩增、纯化人们感兴趣的基因，研量扩增、纯化人们感兴趣的基因，研究其结构、功能及调控机制，从而拓究其结构、功能及调控机制，从而拓宽了分子生物学的研究领域。宽了分子生物学的研究领域。15（5 5）医学上应用更为广泛，涉及各领域）医学上应用更为广泛，涉及各领域 正常人类生命活动的分子机制；正常人类生命活动的分子机制；人类各种疾病发生的分子机理；人类各种疾病发生的分子机理；人类各种疾病如遗传性疾病、肿瘤、人类各种疾病如遗传性疾病、肿瘤、肥胖、心血管疾病、传染病等病因肥胖、心血管疾病、传染病等病因 的查明、诊断、治疗和预防。的查明、诊断、治疗和预防。药物的研发和生产；药物的研发和生产；疾病模型的建立；疾病模型的建立；人类的营养、健康、长寿和保健人类的营养、健康、长寿和保健（亚健康）（亚健康）1617 本课程的地位：本课程的地位：现代科技革命现代科技革命高新技术高新技术生物技术生物技术基因工程基因工程基因克隆基因克隆18基因工程不是发现，而是创造。基因工程不是发现，而是创造。19改变传统农业概念 让植物生产人体蛋白质让植物生产人体蛋白质 生产促性腺绒毛激素的矮牵牛生产促性腺绒毛激素的矮牵牛20发光的水稻21 只只 有有 想想 不不 到到 的的 没没 有有 办办 不不 到到 的的基因重组基因重组22 第一节第一节 基因工程的基因工程的发生与发展发生与发展23 一、基因工程诞生的理论基础一、基因工程诞生的理论基础 2020世纪中期分子遗传学理论的重大进展世纪中期分子遗传学理论的重大进展 六大发现六大发现：1 1确定了生物确定了生物遗传的物质基础遗传的物质基础是是DNADNA 肺炎链球菌光滑型和粗糙型的转化试验肺炎链球菌光滑型和粗糙型的转化试验 噬菌体噬菌体DNADNA转化实验转化实验 24 19441944年，美年，美国微生物学家国微生物学家AveryAvery证明基证明基因就是因就是DNADNA分分子，提出子，提出 DNA DNA是遗传信息的是遗传信息的载体。载体。252 2DNADNA分子分子双螺双螺旋结构旋结构模型模型和和半保留复制半保留复制 DNADNA碱基配碱基配对规律和对规律和X X衍射衍射研究研究 DNA DNA双螺旋双螺旋结构模型。结构模型。2627 3 3生物遗传的生物遗传的“中心法则中心法则”解决了遗传解决了遗传信息的流向和遗传性状的相互关系，揭示信息的流向和遗传性状的相互关系，揭示了生命遗传信息传递基本规律。了生命遗传信息传递基本规律。自我复制，遗传信息由亲代传给子代；自我复制，遗传信息由亲代传给子代；通过转录，遗传信息传给通过转录，遗传信息传给RNARNA；通过翻译，信息传给蛋白质和酶；通过翻译，信息传给蛋白质和酶；基因型决定生物的表型。基因型决定生物的表型。DNA RNA protein28ReplicationReplication TranscriptionReverse Transcription Translation中心法则（the central dogma）2930 4 4“操纵子操纵子”学说揭示了基因表学说揭示了基因表达达 和调控的概念。和调控的概念。基因组结构基因组结构 基因分布基因分布 基因表达基因表达 基因调控的原理基因调控的原理 酶诱导的本质酶诱导的本质 31 5 5破译了全部生物破译了全部生物遗传密码遗传密码，确定了它在生物界的通用确定了它在生物界的通用 性，人类更加具体地了解性，人类更加具体地了解 遗传信息表达规律。遗传信息表达规律。32遗遗传传密密码码表表目 录33mRNA分分子子上上从从5 至至3 的的方方向向,每每3个个核核苷苷酸酸构构建建一一个个密密码码子子，编编码码某某一一特特定定氨氨基基酸酸或或作作为为蛋蛋白白质质合合成成的的起起始始、终终止止信信号号，称称为为三三联联体体密密码码(triplet codon)，也也称称遗遗传传密密码码子子(genetic codon)。解决了信息语言的对应关系。解决了信息语言的对应关系。34n终止密码：翻译终止的密码，不代表任翻译终止的密码，不代表任何氨基酸。有何氨基酸。有3 3个：个：UAAUAA、UAGUAG、UGAUGA 代表氨基酸的密码：64 64 3=3=6161n起始密码：AUGAUG 在在mRNAmRNA起始部位时为起始密码。否，为起始部位时为起始密码。否，为MetMet密码。密码。密码:43=64 35 1)通用性通用性 遗传密码具有的特点遗传密码具有的特点n从原核生物到人类都使用同一套遗传密从原核生物到人类都使用同一套遗传密码。码。n已发现少数例外，如动物细胞的线粒体、已发现少数例外，如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体。植物细胞的叶绿体。2)方向性方向性n n mRNA分子上由起始密码分子上由起始密码AUG开始，从开始，从5 3 方向阅读密码子，直至终止密码。方向阅读密码子，直至终止密码。n n决定蛋白质分子从决定蛋白质分子从N端端C端的排列顺序。端的排列顺序。363)连续性连续性l l三三联联体体密密码码连连续续性性表表现现为为中中间间无无标标点点，连续阅读。连续阅读。l l mRNA开开放放阅阅读读框框架架内内发发生生一一个个或或两两个个碱碱基基插插入入或或缺缺失失，可可引引起起移移码码突突变变(frameshift mutation)。374)简并性简并性目 录l l即有多个密码子特异地破译同一个氨基即有多个密码子特异地破译同一个氨基酸酸l l遗传密码中，除色氨酸和甲硫氨酸仅对遗传密码中，除色氨酸和甲硫氨酸仅对应一个密码子外，其余氨基酸均有一个应一个密码子外，其余氨基酸均有一个以上密码子为其编码。以上密码子为其编码。385)摆动性摆动性 tRNA上反密码子的上反密码子的第第1位位碱基与碱基与mRNA密码子的密码子的第第3位位碱基配对时，可以在一定碱基配对时，可以在一定范围内变动，即范围内变动，即并不严格遵循碱基配对并不严格遵循碱基配对规律，这一现象称为规律，这一现象称为摆动性摆动性。39 6 6、生物进化，基因突变、生物进化，基因突变、获得的性状可以获得的性状可以遗传到遗传到 后代。后代。40 分子遗传学理论上的六大进展解决了分子遗传学理论上的六大进展解决了n 生命现象的遗传物质基础（均是核酸）生命现象的遗传物质基础（均是核酸）n 结构模型（同类构件、双螺旋）结构模型（同类构件、双螺旋）n 复制方式（相似的机制）复制方式（相似的机制）n 遗传信息流动方向（共同的中心法则）遗传信息流动方向（共同的中心法则）n 遗传密码（共用一套相同的密码）遗传密码（共用一套相同的密码）n 表达和调控的机理（类同的方法）表达和调控的机理（类同的方法）n 基因突变机理、意义（变异与进化）基因突变机理、意义（变异与进化）为基因工程技术的诞生典定了理论基础为基因工程技术的诞生典定了理论基础。理论上的可行性。理论上的可行性。41二、分子遗传学新方法是基因工程的二、分子遗传学新方法是基因工程的 技术基础技术基础（六大技术六大技术）n首当其冲的是要解决：首当其冲的是要解决：如何自如地得到目的基因；如何自如地得到目的基因；如何在体外改造基因，得到重组体；如何在体外改造基因，得到重组体；如何在体外转移重组基因；如何在体外转移重组基因；n直到直到2020世纪世纪7070年代中期，相继出现了年代中期，相继出现了 几项关键性技术，梦想成真。几项关键性技术，梦想成真。421 1工具酶的发现工具酶的发现：DNADNA分子的切割和连接技术分子的切割和连接技术n19701970年年SmithSmith发现了第一个发现了第一个型限制性核酸内切酶型限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease，RE)Hinf对对DNADNA分分 子有特异地切割作用。子有特异地切割作用。（手术刀剪）（手术刀剪）n同年同年KhoranaKhorana又发现了又发现了T4DNAT4DNA连接酶（连接酶（LigaseLigase），），能将能将DNADNA片段连接在一起。片段连接在一起。（缝纫机、浆糊）（缝纫机、浆糊）nDNADNA、RNARNA聚合酶和反转录酶等合成酶聚合酶和反转录酶等合成酶。（复印机）（复印机）n构成了一个研究构成了一个研究DNA、RNA分子的分子的工具酶箱工具酶箱。43 2 2、DNADNA片段片段载体系统载体系统的构建的构建 目的基因、目的基因、DNADNA片段不能复制，也易破坏。片段不能复制，也易破坏。必须连到具有复制能力的必须连到具有复制能力的DNADNA分子上。分子上。载体（载体（vector)vector)是能携带外源是能携带外源DNADNA、能自、能自我复制的小我复制的小DNADNA分子。分子。最早发现的是：质粒、噬菌体和病毒。最早发现的是：质粒、噬菌体和病毒。443 3、大肠杆菌、大肠杆菌受体细胞系统受体细胞系统建立建立 体外获得的含目的基因或体外获得的含目的基因或DNADNA片段的片段的重组体，虽具有自我复制的本能，但没重组体，虽具有自我复制的本能，但没有原料、酶系统和生命活力。必须将其有原料、酶系统和生命活力。必须将其安全转移到宿主细胞才能进行增殖，赋安全转移到宿主细胞才能进行增殖，赋予其予其“生命生命”。454 4、大肠杆菌、大肠杆菌DNADNA转化体系转化体系建立建立 19701970年发现氯化钙处理过的细胞易年发现氯化钙处理过的细胞易于吸收接纳外源于吸收接纳外源DNADNA；1972 1972年年Cohen CCohen C报道，质粒报道，质粒DNADNA也能也能被大肠杆菌吸收。被大肠杆菌吸收。而后发现经过改造的质粒、噬菌体而后发现经过改造的质粒、噬菌体和病毒都可以携带目的和病毒都可以携带目的DNADNA片段和基因，片段和基因，经过转化大肠杆菌，建立该基因的无经过转化大肠杆菌，建立该基因的无性繁殖系。性繁殖系。46 5、DNA分析、鉴定分析、鉴定技术技术 酶切分析技术（核酸酶切分析技术（核酸分辨分辨仪）仪）核酸分子杂交技术（核酸核酸分子杂交技术（核酸探测探测仪）仪）序列分析（密码序列分析（密码复读复读机）机）生物信息学（生物信息学（密码密码破译破译机）机）47 6 6、DNADNA分离、纯化及鉴定分离、纯化及鉴定技术技术 凝胶电泳：凝胶电泳：Agarose,PAGE gelAgarose,PAGE gel 离心技术离心技术 层析技术层析技术 印迹技术印迹技术:Southern blot:Southern blot .48 技术上的技术上的可行性可行性 六大技术方法的建立六大技术方法的建立 实际上的实际上的可操作性可操作性 材料、实验条件、时空条件、材料、实验条件、时空条件、经济条件和政策。经济条件和政策。基础方面的基本条件（基础方面的基本条件（可能性可能性+可行性可行性+可操作性可操作性）具备，尚需人的科学）具备，尚需人的科学创新思维创新思维+艰苦的实践艰苦的实践。才能得到创新的发明、发现才能得到创新的发明、发现 和成果。和成果。49 19701970年，年，MIT MIT 的科学家率先提出在的科学家率先提出在体外把不同来源的遗传物质进行重组的体外把不同来源的遗传物质进行重组的设想，但遭到反对，不予支持。没能进设想，但遭到反对，不予支持。没能进行试验。行试验。1972 1972年，年，Boyer Boyer等在发现限制性核等在发现限制性核酸内切酶酸内切酶EcoR I EcoR I 的基础上，开始了实验。的基础上，开始了实验。50 1972 1972年年BergBerg等人使用等人使用EcoRIEcoRI在体外对在体外对猴病毒猴病毒SV40SV40的的DNADNA和和噬菌体噬菌体的的DNADNA分别分别酶消化，再用酶消化，再用T T4 4DNADNA连接酶将两种片段连连接酶将两种片段连接起来，得到接起来，得到SV40SV40和和 DNA DNA的重组杂种的重组杂种DNADNA分子分子，率先完成了世界上第一次成功率先完成了世界上第一次成功的的DNADNA体外体外不同物种之间不同物种之间的的DNADNA重组实验重组实验（片段重组）。（片段重组）。基因工程的大胆尝试基因工程的大胆尝试51基因工程的诞生基因工程的诞生1980年年Nobel化学奖化学奖19721972年斯坦福大学的年斯坦福大学的Paul BergPaul Berg小组完成小组完成了首次体外重组实验。了首次体外重组实验。Berg的开创性实验的开创性实验52 1973 1973 年年 Cohen Cohen 成功地进行了另一个成功地进行了另一个体外体外DNADNA重组实验。重组实验。分别把编码卡那霉素和四环素抗性基因的两分别把编码卡那霉素和四环素抗性基因的两种质粒酶切、连接，再将这种重组的种质粒酶切、连接，再将这种重组的DNADNA分子转分子转化大肠杆菌，某些转化菌落具有既抗卡那霉素又化大肠杆菌，某些转化菌落具有既抗卡那霉素又抗四环素的双重抗体特性。抗四环素的双重抗体特性。他的工作是世界上第一次成功的他的工作是世界上第一次成功的基因克隆基因克隆实实验，并有基因表达及新的表型验，并有基因表达及新的表型。标志着基因工程标志着基因工程的诞生。的诞生。53pSC101pRpR6-56-5抗四环素抗四环素抗卡那霉素抗卡那霉素EcoRI抗卡那霉抗卡那霉素基因素基因DNADNADNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶重组重组重组重组DNADNADNADNA分子分子分子分子54培养平皿培养平皿四环素平板四环素平板四环素平板四环素平板卡那霉素基因卡那霉素基因卡那霉素基因卡那霉素基因四环素四环素四环素四环素 卡那霉素基因卡那霉素基因卡那霉素基因卡那霉素基因大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌55 后来又把非洲爪蟾核糖体基因片段同后来又把非洲爪蟾核糖体基因片段同pSC101pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的菌体内成功转录出相应的mRNAmRNA。这是第。这是第一次成功的基因表达实验。一次成功的基因表达实验。56 19741974年，年，首次实现异源间基因重组。首次实现异源间基因重组。把小鼠的生长激素抑素基因在大把小鼠的生长激素抑素基因在大肠杆菌中表达。肠杆菌中表达。57 1976年，年，世界上第一个基因公司在美国世界上第一个基因公司在美国成立，成立，“Genetech”“Genetech”注册登记，意味着注册登记，意味着基因工程的实际应用已跨入商业运作的基因工程的实际应用已跨入商业运作的门槛。门槛。生物工程从此进入产业化。生物工程从此进入产业化。58 1978 1978年年，人类的第一个基因被克隆。人类的第一个基因被克隆。人生长激素抑素基因被重组到大肠人生长激素抑素基因被重组到大肠杆菌的质粒杆菌的质粒DNADNA中中 。1978-1979 1978-1979胰岛素基因在大肠杆菌中胰岛素基因在大肠杆菌中表达。表达。59 19821982年年 1 1、把大白鼠的生长激素基因克隆、转移到、把大白鼠的生长激素基因克隆、转移到小鼠的受精卵内，小鼠的受精卵内，第一个转基因超级鼠诞生。第一个转基因超级鼠诞生。2 2、人胰岛素基因的、人胰岛素基因的cDNA cDNA 被克隆、成功表被克隆、成功表达和开始成为商品上市。达和开始成为商品上市。基因产品有效益、开始新兴产业。基因产品有效益、开始新兴产业。60三、基因工程的基本步骤三、基因工程的基本步骤 两个水平，六个阶段两个水平，六个阶段61基因工程包括分子和细胞两个水平操作基因工程包括分子和细胞两个水平操作n分子水平操作指的是基因重组、克隆和分子水平操作指的是基因重组、克隆和表达的设计与重组体构建（即重组表达的设计与重组体构建（即重组DNADNA技技术）；术）；n细胞水平操作则指转化、筛选和培养工细胞水平操作则指转化、筛选和培养工程菌或细胞以及表达产物的分离纯化过程菌或细胞以及表达产物的分离纯化过程。程。62 1 1分子水平操作阶段：分子水平操作阶段：获得含目的基因的重组体分子（亦称重组子）。获得含目的基因的重组体分子（亦称重组子）。本阶段的操作有三个主要环节：本阶段的操作有三个主要环节：（1 1）分分离：提取、分离含目的基因的离：提取、分离含目的基因的DNADNA分子和分子和载体载体DNADNA分子，在分离提取过程中，注意质、量，分子，在分离提取过程中，注意质、量，减少损伤。减少损伤。（2 2）切切割：选择合适的割：选择合适的RERE工具酶，分别对外源工具酶，分别对外源目的目的DNADNA分子和载体分子和载体DNADNA分子进行酶解切割。分子进行酶解切割。（3 3）连连接：用接：用DNADNA连接酶，将目的基因与载体在连接酶，将目的基因与载体在体外连接为一个重组体外连接为一个重组DNADNA分子，并进行鉴定。分子，并进行鉴定。63 分离：分离：目的基因的获取目的基因的获取需要克隆的需要克隆的DNADNA片段：片段：化学合成法化学合成法 cDNAcDNA文库文库基因组基因组DNADNA文库文库聚合酶链式反应聚合酶链式反应64载体载体DNADNA的选择的选择 功能功能：为目的基因提供进入受体细胞的为目的基因提供进入受体细胞的为目的基因提供进入受体细胞的为目的基因提供进入受体细胞的转移转移转移转移能力。能力。能力。能力。为目的基因提供在受体细胞中为目的基因提供在受体细胞中为目的基因提供在受体细胞中为目的基因提供在受体细胞中复制复制复制复制或或或或整合整合整合整合能力。能力。能力。能力。为目的基因提供在受体细胞中的为目的基因提供在受体细胞中的为目的基因提供在受体细胞中的为目的基因提供在受体细胞中的表达表达表达表达能力。能力。能力。能力。65限制性内切限制性内切酶酶切酶酶切切割：切割：内切酶内切酶连接酶连接酶连接：连接：DNADNADNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶66 2.2.细胞水平操作阶段：细胞水平操作阶段：把含目的基因的重组体导入受体细菌或受体细把含目的基因的重组体导入受体细菌或受体细 胞，赋予其胞，赋予其“生命生命”让其表达，获得产品。让其表达，获得产品。本阶段的操作也有三个主要环节。本阶段的操作也有三个主要环节。（1 1）转转移：利用移：利用DNADNA转移技术，把构建的重组体导转移技术，把构建的重组体导入到受体菌或受体细胞中，获得工程菌或工程细胞入到受体菌或受体细胞中，获得工程菌或工程细胞。（2 2）筛筛选：利用核酸杂交，酶切分析、选：利用核酸杂交，酶切分析、PCRPCR和表型和表型特征等技术，筛选出已克隆化的工程菌特征等技术，筛选出已克隆化的工程菌/细胞。细胞。（3 3）表表达：大量培养含重组体的工程菌达：大量培养含重组体的工程菌/细胞，诱细胞，诱导其表达，并对表达产物进行鉴定，提取和纯化。导其表达，并对表达产物进行鉴定，提取和纯化。67重组体的转化重组体的转化受体细胞受体细胞转移：转移：含氨苄平板含氨苄平板含氨苄平板含氨苄平板重组重组重组重组质粒质粒质粒质粒感受态感受态感受态感受态重组体重组体68含氨苄平板含氨苄平板含氨苄平板含氨苄平板连接连接目的基因目的基因目的基因目的基因基因载体基因载体基因载体基因载体连接酶连接酶连接酶连接酶转化转化重组体克隆的筛选与鉴定重组体克隆的筛选与鉴定筛选：筛选：宿主细胞宿主细胞宿主细胞宿主细胞69外源基因在宿主细胞中的表达外源基因在宿主细胞中的表达重组子目的基因的mRNA表达蛋白质大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌（E.coli E.coli）工程细胞工程细胞工程细胞工程细胞表达：表达：目的基因表达产物的检测目的基因表达产物的检测70 重组重组DNADNA操作一般步骤操作一般步骤：（1 1）分分离离：提取和获得目的基因：提取和获得目的基因 和载体和载体DNADNA；（2 2）切切割割：分别对目的基因和载体：分别对目的基因和载体DNADNA 酶切酶切；（3 3）连连接接：目的基因与载体连接，：目的基因与载体连接，形成新的重组形成新的重组 DNA DNA分子；分子；（4 4）转转化化：用重组：用重组DNADNA分子转化受体分子转化受体 细胞；细胞；（5 5）筛筛选选：能在受体细胞中复制和遗：能在受体细胞中复制和遗 传；对转化子筛选和鉴定传；对转化子筛选和鉴定；（6 6）表表达：达：对获得外源基因的细胞或生对获得外源基因的细胞或生 物体通过培养，获得所需的物体通过培养，获得所需的 遗传性状或表达出所需要的遗传性状或表达出所需要的 产物。产物。71基因载体基因载体目的基因目的基因 质粒质粒质粒质粒 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体 病毒病毒病毒病毒 PCR cDNA PCR cDNA PCR cDNA PCR cDNA 人工合成人工合成人工合成人工合成 基因文库基因文库基因文库基因文库限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶有切口的载体有切口的载体有切口的载体有切口的载体有切口的目的基因有切口的目的基因有切口的目的基因有切口的目的基因DNADNADNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶 重组体重组体 转化转化转化转化 转染转染转染转染 体外包装体外包装体外包装体外包装带重组体的宿主细胞带重组体的宿主细胞带重组体的宿主细胞带重组体的宿主细胞 表型筛选表型筛选表型筛选表型筛选 电泳法电泳法电泳法电泳法 核酸杂交核酸杂交核酸杂交核酸杂交 免疫学方法免疫学方法免疫学方法免疫学方法目的基因的表达72 图图2-1 基因工程技术流程图基因工程技术流程图 73基因工程表达依据的基本原理基因工程表达依据的基本原理提高外源基因的剂量提高外源基因的剂量 分子遗传学原理分子遗传学原理筛选修饰重组基因表达的转录调控元件，如：筛选修饰重组基因表达的转录调控元件，如：启动子、增强子、操作子、终止子、启动子、增强子、操作子、终止子、上游调控序列等上游调控序列等分子生物学原理分子生物学原理修饰构建蛋白质生物合成的翻译调控元件，如：修饰构建蛋白质生物合成的翻译调控元件，如：SD序列、序列、mRNA非编码区、密码子等非编码区、密码子等 分子生物学原理分子生物学原理 基因工程菌（基因工程菌（微型生物反应器微型生物反应器）增殖及稳定生产）增殖及稳定生产 生化工程学原理生化工程学原理 74基因工程的支撑技术基因工程的支撑技术核酸凝胶电泳技术核酸凝胶电泳技术核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术细菌转化转染技术细菌转化转染技术DNADNA序列分析技术序列分析技术寡核苷酸合成技术寡核苷酸合成技术基因定点突变技术基因定点突变技术聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）技术）技术75n运输工具：运输工具：n细菌质粒细菌质粒n病毒病毒nDNADNA操作技术操作技术n纯化纯化DNADNAn剪切剪切DNADNA分子分子n分析分析DNADNA片段大小片段大小n连接连接DNADNA分子分子n受体细胞的制备受体细胞的制备n将将DNADNA转入受体细胞并扩增转入受体细胞并扩增n重组子的筛选和鉴定重组子的筛选和鉴定n目的基因的表达目的基因的表达76Thank You for Thank You for Your Attention!Your Attention!谢谢 谢谢77