金银花对金黄色葡萄球菌体外抑菌作用研究.pdf

本文引文格式:易雪丽,陈晓颖,韦家柱,等.金银花对金黄色葡萄球菌体外抑菌作用研究J.右江民族医学院学报,2 0 2 4,4 6(1):4 8-5 1.【论著与临床报道】金银花对金黄色葡萄球菌体外抑菌作用研究易雪丽,陈晓颖,韦家柱,陈启威,庞艳芳(右江民族医学院附属医院检验科,广西 百色 5 3 3 0 0 0)摘 要:目的 比较金银花对甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(M S S A)和甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MR S A)体外抑菌活性差异。方法 收集3 0株M S S A和3 0株MR S A菌,使用头孢西丁筛选试验和m e c A基因检测对菌株进行验证,使用琼脂打孔法检测金银花对两类金黄色葡萄球菌的抑菌活性并比较差异,使用琼脂稀释法检测金银花对两类金黄色葡萄球菌的M I C并计算出M I C5 0。结果 金银花对M S S A和MR S A均有体外抑菌活性且M I C5 0均为3.1 2 5m g/m L。结论 金银花对M S S A和MR S A均有较好的体外抑菌活性,在临床治疗金黄色葡萄球菌感染方面有很大的应用前景。关键词:金银花;金黄色葡萄球菌;甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌;甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌中图分类号:R 2 8 5 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 1-5 8 1 7(2 0 2 4)0 1-0 0 4 8-0 4d o i:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 1-5 8 1 7.2 0 2 4.0 1.0 0 9S t u d yo na n t i b a c t e r i a l e f f e c t o fL o n i c e r aJ a p o n i c aT h u n bo nS t a p h y l o c o c c u s a u r e u s i nv i t r oY iX u e l i,C h e nX i a o y i n g,W e i J i a z h u,C h e n gQ i w e i,P a n gY a n f a n g(D e p a r t m e n t o fC l i n i c a lL a b o r a t o r i e s,T h eA f f i l i a t e dH o s p i t a l o fY o u j i a n gM e d i c a lU n i v e r s i t yf o rN a t i o n a l i t i e s,B a i s e5 3 3 0 0 0,G u a n g x i,C h i n a)A b s t r a c t:O b j e c t i v e T oc o m p a r et h ed i f f e r e n c eo fa n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo fL o n i c e r aJ a p o n i c aT h u n ba-g a i n s tM e t h i c i l l i n-s e n s i t i v eS t a p h y l o c o c c u sa u r e u s(M S S A)a n d M e t h i c i l l i n-r e s i s t a n tS t a p h y l o c o c c u sa u r e u s(MR S A)i nv i t r o.M e t h o d s T h i r t ys t r a i n so fM S S Aa n dMR S A w e r ec o l l e c t e da n di d e n t i f i e db yC e f o x i t i ns c r e e n i n gt e s t a n dm e c Ag e n ed e t e c t i o n,r e s p e c t i v e l y.T h e a g a rp u n c hm e t h o dw a su s e d t od e t e c t t h e a n t i b a c t e-r i a l a c t i v i t yo fL o n i c e r aJ a p o n i c aT h u n ba g a i n s t t w ot y p e so fS t a p h y l o c o c c u s a u r e u sa n dc o m p a r e dt h e i rd i f f e r-e n c e s.A g a rd i l u t i o n m e t h o dw a su s e dt od e t e c tt h e M I Co fL o n i c e r aJ a p o n i c aT h u n ba g a i n s tt w ot y p e so fS t a p h y l o c o c c u s a u r e u s,a n d t h eM I C5 0w a s c a l c u l a t e d.R e s u l t s L o n i c e r a J a p o n i c aT h u n bh a di n v i t r oa n t i b a c-t e r i a l a c t i v i t ya g a i n s tb o t h M S S Aa n dMR S A w i t h M I C5 0o f3.1 2 5m g/m L.C o n c l u s i o n L o n i c e r aJ a p o n i c aT h u n bh a sag o o da n t i b a c t e r i a l a c t i v i t ya g a i n s tb o t hM S S Aa n dMR S Ai n v i t r o,a n dh a sg r e a t a p p l i c a t i o np r o s-p e c t i nt h ec l i n i c a l t r e a t m e n to fS t a p h y l o c o c c u s a u r e u si n f e c t i o n.K e yw o r d s:L o n i c e r aJ a p o n i c aT h u n b;S t a p h y l o c o c c u sa u r e u s;M e t h i c i l l i n-s e n s i t i v eS t a p h y l o c o c c u sa u-r e u s;M e t h i c i l l i n-r e s i s t a n tS t a p h y l o c o c c u s a u r e u s 金黄色葡萄球菌为革兰阳性球菌,多引起化脓性感染,严重者可以引起败血症,危及患者生命,是社区获得性和院内感染常见的一种重要致病菌。根据金黄色葡萄球菌对甲氧西林耐药性的不同,将其分为甲氧西林 敏 感 金 黄 色 葡 萄 球 菌(M e t h i c i l l i n-s u s c e p t i b l eS t a p h y l o c o c c u s a u r e u s,M S S A)及甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(M e t h i c i l l i n-r e s i s t a n tS t a p h y l o c o c c u s a u-r e u s,MR S A)。MR S A最 常 见 的 耐 药 机 制 为 携 带m e c A基因,该基因编码的青霉素结合蛋白(P B P 2 a)出现结构改变1。除了具有抗MR S A活性的头孢菌素84第4 6卷 第1期 右江民族医学院学报 V o l.4 6N o.12 0 2 4年2月 J o u r n a l o fY o u j i a n gM e d i c a lU n i v e r s i t yf o rN a t i o n a l i t i e s F e b.2 0 2 4基金项目:百色市本级科学研究与技术开发计划项目(百科2 0 2 1 1 8 0 8)第一作者:易雪丽,副主任技师,研究方向:临床微生物检验,E-m a i l:4 6 7 1 6 1 5 5q q.c o m外,临床常用的其他的-内酰胺类药物与之亲合力降低,从而导致MR S A对该类药物均产生耐药性,因此临床需要根据M S S A和MR S A耐药性的不同选择不同的抗生素进行治疗。金银花是忍冬科忍冬属植物忍冬的花蕾,在中国、韩国、日本和印度等国家都有分布,我国主要以河南、河北和山东为主产地2。我国从古代以来一直都将其应用于食用及药用领域,为药食同源植物。古人在三千多年前就已经开始用它防治疾病,东晋时期葛洪最先将其收录于 肘后备急放。该味药性寒味甘,有清热解毒、抑菌、抗病毒、抗肿瘤及增强免疫力等功能。目前已经制备成银翘解毒片、银黄片、银黄注射液和金银花藤粉等药品应用于临床治疗。然而目前其药用功效尚未得到完全开发,众多研究者仍然不断的探索其在临床领域的新应用。虽然目前有很多金银花抗金黄色葡萄球菌活性的相关研究,但是少有研究报道探讨金银花对M S S A及MR S A抑菌活性是否有差异。因此本研究主要目的为探讨金银花对两种金黄色葡萄球菌的抑菌活性是否存在差异,以明确使用金银花治疗由金黄色葡萄球菌引起的感染时是否需要区分M S S A及MR S A,并为后续进一步明确金银花抑菌机制提供研究基础。1 材料和方法1.1 主要仪器及试剂 金银花醇提取物购买自广西卓一生物技术有限公司;药敏纸片、M u e l l e r-H i n t o n(MH)琼脂购自英国O X O I D公司;血琼脂平板购自郑州安图生物工程股份有限公司;T E缓冲液购自索莱宝生物科技有限公司;溶葡萄菌素购自生工生物工程有限公司;D NA M a r k e rD L1 0 0 0、P r e m i xT a qTM(E xT a qTMV e r s i o n2.0p l u sd y e)购自宝生物工程(大连)有限公司;V I T E K M S质谱仪购自法国生物梅里埃公司;P C R仪及电泳及凝胶成像设备购自美国伯乐公司。1.2 菌株来源 从右江民族医学院附属医院2 0 2 0年1月至2 0 2 0年6月临床分离的金黄色葡萄球菌中分别筛选出3 0株M S S A和3 0株MR S A进行试验。所有菌株均使用V I T E K M S质谱仪对其进行鉴定,分离菌株于-8 0冰箱中保存。1.3 方法1.3.1 头孢西丁纸片法筛选MR S A菌株 将分离的金黄色葡萄球菌菌株从-8 0冰箱中复苏,在血琼脂上培养1 61 8h后,挑取12个菌落制备成0.5麦氏单位浓度菌悬液,均匀涂布于MH琼脂,静置5m i n后贴一片3 0g头孢西丁纸片,3 5 空气环境孵育1 61 8h后使用游标卡尺测量抑菌圈直径大小。结果判读参照C L S IM 1 0 0,2 1mm为MR S A菌株,2 2mm为M S S A菌株。1.3.2 m e c A基因检测 将分离的金黄色葡萄球菌菌株在血琼脂上培养1 61 8h后,挑取12个菌落于T E缓冲液中制备成0.5麦氏单位浓度菌悬液,加入4L溶葡萄菌素,3 7孵育3 0m i n,1 0 0煮沸2 0m i n;-3 0放置1 0m i n;1 20 0 0r/m i n离心5m i n,吸取上清液为D NA模板备用。参照文献3合成m e c A基因特异性引物对提取的菌株D NA进行扩增。引物序列如下:上游引物:5 -AAAAT C GAT G G T AAAG-G T T G G C-3;下 游 引 物:5 -AG T T C T G C AG T A C-C G GAT T T G C-3。采用5 0L的反应体系进行P C R扩增,扩增条件:9 8变性1 0s,5 3退火3 0s,7 2延伸3 0s。P C R产物经1%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像仪成像后在约5 3 3b p位置处出现条带者为阳性结果。阳性扩增产物送至广州艾基生物有限公司测序,测序结果通过美国国立生物技术信息中心网站(h t-t p s:/www.n c b i.n l m.n i h.g o v/)进行b l a s t n在线比对分析。1.3.3 金银花对金黄色葡萄球菌抑菌作用初筛试验 参照文献5使用琼脂打孔法进行初筛试验,将6 0株金黄色葡萄球菌在血琼脂上培养1 61 8h后,挑取12个菌落制备成0.5麦氏单位浓度菌悬液,均匀涂布于MH琼脂上。使用打孔器在琼脂上打一个6mm的孔,每孔加入1 0 0L金银花药液(2 0 0m g/m L)。5空气环境孵育1 61 8h后使用游标卡尺测量抑菌圈直径大小并比较两组间的差异。1.3.4 测定金银花对金黄色葡萄球菌的M I C 使用琼脂稀释法检测金黄色葡萄球菌对金银花的M I C,将不同浓度的金银花药液加入融化并冷却至5 0 左右的MH琼脂,制备成终浓度为2 0 0m g/m L、1 0 0m g/m L、5 0m g/m L、2 5m g/m L、1 2.5m g/m L、6.2 5m g/m L、3.1 2 5m g/m L、1.5 6 3m g/m L的药敏MH琼脂,将金黄色葡萄球菌配置成0.5麦氏单位浓度的菌悬液,再将该菌悬液11 0稀释后接种于不同浓度的药敏琼脂平板表面,每点接种菌量约为1 0 4C F U/m L。3 5空气环境孵育1 62 0h后观察结果,读取抑制细菌 生 长 的 最 低 药 物 浓 度 为M I C并 计 算 两 组 的M I C5 0。1.4 统计学方法 结果采用S P S S2 0.0软件进行统计学分析,组间比较采用t检验,P0.0 5),见表1。表1 金银花对M S S A和MR S A抑菌活性比较的结果组别n抑菌圈直径/mmtPM S S A组3 01 2.0 51.8 80.2 5 20.8 0 2MR S A组3 01 1.9 51.1 0 注:表内计量资料数据以(xs)表示。2.4 测定金银花对金黄色葡萄球菌的M I C 金银花对MR S A和M S S A的M I C5 0均为3.1 2 5m g/m L,见表2。表2 金银花对M S S A和MR S A的M I CM S S A组(n=3 0)菌株编号M I C/(m gm L-1)MR S A组(n=3 0)菌株编号M I C/(m gm L-1)0 4 2 1 0 3 33.1 2 50 4 2 0 0 2 63.1 2 50 4 2 4 0 1 33.1 2 50 4 2 0 0 2 23.1 2 50 4 2 6 0 0 63.1 2 50 4 1 8 0 7 33.1 2 50 4 2 6 0 0 33.1 2 50 4 1 8 0 7 13.1 2 50 4 2 7 0 0 71.5 6 31 2 2 7 0 7 53.1 2 50 4 2 7 0 5 71.5 6 30 2 0 1 0 4 71.5 6 30 5 0 1 0 7 31.5 6 31 2 3 1 0 6 23.1 2 50 5 0 2 0 7 13.1 2 51 2 2 5 0 5 51.5 6 30 5 0 3 0 7 43.1 2 50 1 0 5 0 6 81.5 6 3表2(续)金银花对M S S A和MR S A的M I CM S S A组(n=3 0)菌株编号M I C/(m gm L-1)MR S A组(n=3 0)菌株编号M I C/(m gm L-1)0 5 1 8 0 7 63.1 2 51 2 2 2 0 5 11.5 6 30 5 1 9 0 0 13.1 2 51 2 2 5 0 2 91.5 6 30 5 1 9 1 0 91.5 6 30 1 2 8 0 4 73.1 2 50 5 2 1 0 4 21.5 6 30 1 1 1 0 8 53.1 2 50 5 2 2 0 3 21.5 6 30 1 2 9 0 7 33.1 2 50 5 2 2 0 7 11.5 6 31 2 1 7 1 1 63.1 2 50 5 2 3 0 9 53.1 2 50 1 2 9 0 7 93.1 2 50 5 2 4 0 3 13.1 2 51 2 1 8 0 6 13.1 2 50 5 2 5 0 9 93.1 2 51 2 1 7 0 9 83.1 2 50 6 0 7 0 0 71.5 6 30 1 0 7 1 2 21.5 6 30 6 0 7 0 7 11.5 6 31 2 3 1 0 0 93.1 2 50 6 0 8 0 0 83.1 2 51 2 1 8 0 5 33.1 2 50 6 0 9 0 0 63.1 2 51 2 2 7 0 4 03.1 2 50 6 1 0 0 3 23.1 2 50 1 1 5 0 4 83.1 2 50 6 1 0 0 5 03.1 2 51 2 1 4 0 2 33.1 2 50 6 1 0 1 1 83.1 2 50 1 1 6 0 1 61.5 6 30 6 1 1 0 6 01.5 6 31 2 2 2 0 2 03.1 2 50 6 1 1 1 0 53.1 2 51 2 2 2 0 4 83.1 2 50 6 1 7 0 7 21.5 6 30 1 1 4 0 4 33.1 2 50 6 1 7 0 9 43.1 2 50 1 3 1 0 5 03.1 2 50 6 2 0 0 6 53.1 2 50 1 2 9 0 8 13.1 2 53 讨论金黄色葡萄球菌可产生血浆凝固酶、肠毒素、杀白细胞素、表皮剥脱毒素和休克综合征毒素等多种毒力因子,是社区获得性感染和院内感染常见的一种重要致病菌,可引起人或动物多系统的化脓性感染5。根据对甲氧西林耐药性的不同,选择的治疗药物也不同。一般M S S A可选择克林霉素、第一代或者第二代头孢菌素进行治疗,而MR S A常使用万古霉素、利奈唑胺或达托霉素等更高级别的抗菌药物进行治疗。然而随着抗生素的广泛应用,临床分离的各类多重耐药菌数量逐年增加。1 9 6 1年英国学者首次报道MR S A的出现后,世界各地相继报道发现了MR S A菌株6。由于MR S A菌株对绝大部分-内酰胺类药物具有耐药性,因此给临床治疗带来了极大的困难,所以迫切的需要开发更多能应用于MR S A临床治疗的新药物。我国中草药资源丰富,数千年来一直被广泛应用于治疗各类疾病。中草药治疗感染性疾病的不良反应较小,不易引起细菌耐药,价格相对于目前常使用的各类抗生素更便宜,且研究已经证实部分中草药与抗生素联合应用能更有效快速地治疗各类感染,因此近年来众多学者致力于从各类中草药中筛选新型抑菌药物并研究其作用机制7。王杰等8检测了蒲公英、金银花、甘草、决明子、胖大海、香橼和川贝母等7种中药水052 0 2 4年 右江民族医学院学报 第1期提物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性,结果显示金银花对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好。朱晓萍等9检测了黄连、黄芩、五倍子和金银花等1 7种中草药对金黄色葡萄球菌的抑菌活性,结果也显示金银花的抑菌活性最佳。本研究结果显示金银花对检测的两类金黄色葡萄球菌均有较好的抑菌活性,与梁晓谊和吕归红两个团队的报道相符合1 0-1 1。但是大部分研究在检测金银花对金黄色 葡萄球菌抑 菌效果的时 候没有区分M S S A及MR S A,因此尚未明确临床治疗中,金银花对M S S A及MR S A是否具有相同的抑菌活性。本研究在检测金银花对金黄色葡萄球菌抑菌活性的同时还比较了其对M S S A和MR S A抑菌活性的差异,结果显示对两类金黄色葡萄球菌的抑菌活性没有差异,在使用金银花治疗由金黄色葡萄球菌引起的各类感染时不需要区分M S S A及MR S A。同时金银花除了应用于临床治疗之外,还被制成金银花茶及金银花露等饮品,属于药食同源的植物1 2。鉴于其对人体的副作用极小,且不易产生耐药性,因此在治疗由多重耐药的MR S A引起的感染中有极大的应用前景。虽然本研究与众多报道均显示金银花对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性,但是其抑菌机制尚未完全明确。金银花主要成分包括有机酸类、黄酮类、挥发油类、多糖、环烯醚萜类和三萜皂苷类等化合物1 3。这些化合物可以通过破坏细菌的细胞壁和细胞膜、降低细菌黏附、抑制生物膜形成、清除细菌内毒素、降低毒力因子和促进 细胞凋亡等 多种机制实 现其抑菌活性1 4-1 5。本研究显示金银花对于携带了m e c A基因的MR S A与未携带该基因的M S S A的体外抑菌活性无差异,由 此 可 推 断 金 银 花 抑 菌 活 性 的 作 用 位 点 与m e c A基因编码的P B P 2 a蛋白可能无关,后续本组课题将继续深入探寻金银花的抑菌作用机制。参考文献:1 陈虹宇,祖莹,罗庆礼,等.9 5例住院患儿耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分离株的分子流行病学特征及药物敏感性J.右江民族医学院学报,2 0 2 1,4 3(4):4 9 7-5 0 2.2 刘艳萍,王云,贾哲,等.基于G C-M S和多元统计方法分析不同产地金银花挥发性成分的差异J.中国中药杂志,2 0 2 2,4 7(2 0):5 5 0 8-5 5 1 9.3 赵焕强,邹玉涵,金姝,等.t s t和p v l基因阳性金黄色葡萄球菌流行情 况及 分 子特 征J.中 国感 染 与化 疗杂 志,2 0 1 6,1 6(3):3 5 3-3 5 8.4 谷晓雨,李会,张佩,等.蒲公英、金银花水提剂及颗粒剂对4种致病菌的抑菌作用J.临床合理用药,2 0 2 3,1 6(1):5-8.5 R A GHUR AM V,A L E X AN D E RA M,L OO H Q,e ta l.S p e c i e s-w i d ep h y l o g e n o m i c so f t h eS t a p h y l o c o c c u sa u r e u sA g ro p e r o nr e v e a l e dc o n v e r g e n te v o l u t i o no ff r a m e s h i f tm u t a t i o n sJ.M i c r o b i o lS p e c t r,2 0 2 2,1 0(1):e 0 1 3 3 4 2 1.6 E R I K S E N K R.“C e l b e n i n”-r e s i s t a n ts t a p h y l o c o c c iJ.U g e s k r i f tL a e g e r,1 9 6 1,1 2 3:3 8 4-3 8 6.7 高磊,童浩文,梁跃辉,等.基于铜绿假单胞菌群体感应系统的潜在抗菌中草药筛选研究J.天然产物研究与开发,2 0 2 2,3 4(5):7 7 2-7 7 9,7 6 0.8 王杰,乐靖雯,马诗雅,等.7种药食同源水提物对金黄色葡萄球菌的抑制作用J.现代食品,2 0 2 3,2 9(5):1 9 7-1 9 9,2 1 9.9 朱晓萍,庄智威,叶泽铭,等.黄连等中草药对常见病原菌体外抑菌效果的研究J.饲料研究,2 0 2 1,4 4(7):9 8-1 0 1.1 0 梁晓谊,黄玉环.9味中药对儿童呼吸道多重耐药菌的体外药敏试验结果分析J.黑龙江医药,2 0 2 2,3 5(1):2 3-2 6.1 1 吕归红,陈宇.金银花枝叶提取液体外抑菌活性与体内抗炎作 用研 究J.浙 江中 医 杂志,2 0 2 1,5 6(8):6 2 0-6 2 1.1 2 MAA,Z OUF M,Z HAN GR W,e ta l.T h ee f f e c t sa n du n d e r l y i n g m e c h a n i s m so f m e d i c i n ea n df o o dh o m o l o-g o u s f l o w e r so nt h ep r e v e n t i o na n dt r e a t m e n to fr e l a t e dd i s e a s e sJ.JF o o dB i o c h e m,2 0 2 2,4 6(1 2):e 1 4 4 3 0.1 3 时玉昌,沈申,陈亚运,等.不同干燥方法对金银花多元功效成分和感官品质的影响J.生物加工过程,2 0 2 1,1 9(1):6 6-7 3.1 4 任涛,庞玉莲,薛诗夏,等.3种金银花提取物抗细菌内毒素的作用研究J.现代农业科技,2 0 2 2(1 8):1 5 0-1 5 4.1 5 WAN GSG,YAOJY,Z HOU B,e ta l.B a c t e r i o s t a t i ce f f e c to f q u e r c e t i na s a na n t i b i o t i c a l t e r n a t i v e i nv i v oa n di t sa n t i b a c t e r i a lm e c h a n i s mi nv i t r oJ.JF o o dP r o t,2 0 1 8,8 1(1):6 8-7 8.收稿日期:2 0 2 3-1 0-2 2;修回日期:2 0 2 3-1 2-0 2152 0 2 4年 右江民族医学院学报 第1期