基于UPLC-Q TOF-MSE技术的藤黄健骨丸指纹图谱建立及共有峰鉴定.pdf

CHINESEJOURNALOFAPPLIEDCHEMISTRY2024年3月437-444应用化学第41卷第3期D01I:10.19894/j.issn.1000-0518.230355基于UPLC-QTOF-MSE技术的藤黄健骨丸指纹图谱建立及共有峰鉴定谢东！胡健楠李念1杨桔黄青皮子凤郑飞冀戴雨霖越皓（长春中医药大学吉林省人参科学研究院，长春130 117）2（长春人民药业集团有限公司，长春130 0 33）摘要建立藤黄健骨丸高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，完善产品质量标准。采用WatersSymmetryC18（150 m m x 2.1m m，3.5m）色谱柱；流速为0.4mL/min；进样量为2 L；紫外检测波长为2 6 0 nm；在柱温30下以0.1%甲酸水（A)和0.1%甲酸乙腈（B）为流动相进行梯度洗脱。利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2 0 12 版本）建立藤黄健骨丸指纹图谱，并分析相似度。采用液质联用技术（UPLC-QTOF-MSE），根据化合物串联质谱信息结合对照品进行了共有峰结构鉴定。共确定了10 批藤黄健骨丸指纹图谱中2 0 个共有峰，相似度均在0.9 5以上。基于对照品和串联质谱信息指认了共有峰中13种成分的结构，并进行了峰归属。对10批藤黄健骨丸指纹图谱共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行了计算，结果显示各批次样品共有峰的相对保留时间和相对峰面积均比较稳定，表明它们所对应的各成分含量较为均一。采用该指纹图谱对中间体进行了相似度评价，发现中间体与成品相关性良好。该方法精密度、重复性和稳定性好，不仅可用于藤黄健骨丸成品的质量控制，还可对中间体进行检测，用于生产过程的控制。关键词藤黄健骨丸；高效液相色谱；指纹图谱；液质联用中图分类号：0 6 56文献标识码：A文章编号：10 0 0-0 518(2 0 2 4)0 3-0 437-0 8藤黄健骨丸是著名中医学家刘柏龄教授凭借大量的临床实践归纳总结出的中药方剂，该方是由熟地黄、鹿衔草、肉蓉、鸡血藤、骨碎补（烫）、淫羊藿和炒莱子7 味中药为原料，经粉碎、提取后以炼蜜为粘合剂制成的纯中药浓缩蜜丸制剂。方中7 味药，6 味人肾经，以补肾治本，治骨治标，标本兼治，现已广泛应用于临床2-3。研究表明,该方对骨关节炎、骨质疏松等骨病具有良好的治疗效果4-。然而，目前对藤黄健骨丸的质量标准研究报道较少，赵勇等6 采用薄层色谱法对方中熟地黄和淫羊藿药材进行了鉴别,利用高效液相色谱(HPLC)技术检测了骨碎补中柚皮苷以及淫羊藿中淫羊藿苷的含量,以提高其质量标准。此外多数相关研究也仅是对方中单个或几个化学成分建立含量测定方法，但检测指标偏少，均难以反映药品的整体质量7-10)。基于此，本研究采用HPLC法建立藤黄健骨丸的指纹图谱，结合液质联用技术对其共有峰的结构进行鉴定，并对其相似度进行评价，考察中间体和成品间的相关性，以期为藤黄健骨丸的质量控制提供理论研究基础。1实验部分1.1仪器和试剂U3000型高效液相色谱仪（HPLC，美国Thermo公司）；Acquity型超高效液相色谱（UPLC，美国Waters公司）；Q-TOFSYNAPT型高分辨质谱仪（HRMS，美国Waters公司）；ME204/02型电子天平（上海METTLERTOLED公司）；KS-2200DE型超声波清洗器（昆山洁力美超声仪器有限公司）。藤黄健骨丸10 批中间体（组方中药按制剂工艺制成的混合粉末）批号分别为：2 2 0 39、2 2 0 40、2 2 0 41、22042、2 30 0 3、2 30 0 4、2 30 0 5、2 30 0 6、2 30 0 7 和2 30 0 8，及其对应的10 批成品（组方中药按制剂工艺制成的2023-11-10收稿;2 0 2 4-0 3-0 1接受吉林省科技发展计划项目（No.20210401064YY）资助*E-mail:;438第41卷应用化学浓缩蜜丸）批号分别为：2 0 2 2 10 0 5、2 0 2 2 110 1、2 0 2 2 110 2、2 0 2 2 110 3、2 0 2 30 30 1、2 0 2 30 30 2、2 0 2 30 30 3、20230401、2 0 2 30 40 2 和2 0 2 30 40 3，均来源于长春人民药业集团有限公司，药材产地来源分别为：地黄（河南家种);鹿衔草(内蒙野生);骨碎补(湖北、重庆、贵州野生);肉蓉(新疆家种);淫羊藿（甘肃野生);鸡血藤（云南野生）；莱子（甘肃野生）。对照品松果菊苷（批号：N25GB168967）、淫羊藿苷（批号：T11A11B111118）、柚皮苷（批号：H24N9Z75896）、毛蕊花糖苷（批号：N19GB168679）、淫羊藿次苷（批号：A20GB158231)均购自于上海源叶生物科技有限公司，纯度均大于等于9 8%。甲醇（色谱纯，美国Tedia公司）；乙睛（色谱纯，美国Sigma公司）；甲酸（色谱纯，上海Aladdin公司）;Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）。1.2对照品溶液的制备精密称定淫羊藿苷、松果菊苷、淫羊藿次苷、柚皮苷和毛蕊花糖苷对照品各1.0 mg，加甲醇分别配置成浓度为0.1mg/mL的对照品溶液。1.3供试品溶液的制备精密称定藤黄健骨丸成品5g和中间体2.5g，分别置于50 mL锥形瓶中，再精密量取甲醇2 5mL加入使溶解，称定质量1，在功率为10 0 W，频率为40 kHz的条件下超声处理1h，放冷，称定质量2,用甲醇补足2 次称定的质量损失，摇匀，滤过，即得供试样品。1.4阴性样品溶液的制备按照处方工艺制备藤黄健骨丸中7 味药材相应的阴性样品，再分别按1.3节方法制备，即得。1.5色谱条件采用WatersSymmetryC18（150 mm2.1mm，3.5m）色谱柱；在柱温30 下以0.1%甲酸水（A）和0.1%甲酸乙腈（B）为流动相进行梯度洗脱（0 10 min，5%10%B；10 15m i n，10%15%B；15 30 m i n，15%25%B;3042 min,25%55%B;4252 min,55%80%B;5257 min,80%5%B;5762 min,5%B);流速为0.4mL/min；进样量为2 L；紫外检测波长为2 6 0 nm。1.6质谱条件以ESI为离子源，在MSE全扫描模式下对正/负离子进行分析；扫描时间为1.5s；扫描范围m/z502000；离子源温度正离子模式下为12 0，负离子模式下为110；脱溶剂气温度40 0；锥孔气和脱溶剂气的流速为50 和8 0 0 L/h；锥孔电压为40 V；毛细管电压正离子模式设置为3.0 kV，负离子模式设置为2.5kV；碰撞能量为2 5 45V；采用甲酸钠对质谱仪进行校正，使用亮氨酸脑啡肽（正离子模式下m/z556.2771，负离子模式下m/z554.2615)对质量数进行实时校正2)2结果与讨论2.1检测波长的选择通过查阅文献13-17 确定各对照品常见紫外检测波长，松果菊苷、毛蕊花糖苷的检测波长分别为330和334nm，淫羊藿苷的检测波长为2 7 0 nm，柚皮苷的检测波长为2 8 3nm，淫羊藿次苷的检测波长为2 6 5nm。结合文献13-17 并考察藤黄健骨丸紫外检测波长，结果在2 6 0 nm波长下指纹图谱中各共有峰吸收较好，信号较强，故选择其为最适检测波长2.2藤黄健骨丸指纹图谱的建立2.2.1仪器精密度试验取藤黄健骨丸（成品）样品连续进样测定6 次，以5号色谱峰（松果菊苷）作为参照峰，计算各共有峰的相对峰面积和相对保留时间18 。结果见辅助材料表S1和S2,各共有峰的相对峰面积的RSD值均小于1.86%，相对保留时间的RSD值均小于1.52%，表明该仪器精密度良好，满足分析质量要求2.2.2重复性试验取6 份藤黄健骨丸（成品）样品依次进样测定，以5号色谱峰（松果菊苷）为参照峰，计算各共有峰的相对峰面积和相对保留时间18 。结果见辅助材料表S3和S4,各共有峰的相对峰面积的RSD值均小于1.32%，相对保留时间的RSD值均小于1.0 5%，表明该方法重复性良好。439谢东等：基于F-MSE技术的藤黄健骨丸指纹图谱建立及共有峰鉴定第3 期2.2.3稳定性实验取藤黄健骨丸（成品）样品在0、2、4、8、12、16、2 0 和2 4h分别进样测定，以5号色谱峰（松果菊苷）为参照峰，计算各共有峰的相对峰面积和相对保留时间18 。结果见辅助材料表S5和S6,各共有峰的相对峰面积的RSD值均小于1.41%，相对保留时间的RSD值均小于1.2 2%，说明样品在2 4h内稳定性良好。2.2.4指纹图谱的建立及共有峰指认取10 批藤黄健骨丸（成品）样品，依次进样测定并记录色谱图，利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2 0 12 版本）对供试品溶液的色谱图（X1-X10)进行分析，选择X1作为参照图谱，采用中位数法，时间窗宽度设置为0.1,再进行多点校正以及Mark峰的匹配，最终获得10 批成品的指纹图谱（图1），并自动生成对照指纹图谱R(图2 A谱线a)19。因5号峰峰面积大，分离度好，保留时间及峰面积稳定，因此以5号峰为参照峰，共标定出2 0 个共有峰，共有峰面积占总峰面积9 0%以上。700512160017138910111415161819204R(20)X10(20)400X9(20)X8(20)17(20)16120Y200X5(20)X4(20)X3(20)X2(20)儿人X1(20)051015202530354045505562Time/min图110批藤黄健骨丸指纹图谱Fig.1Fingerprints of 10 batches of Tenghuang Jiangu Wan对共有峰进行结构鉴定，共指认了13种成分。通过对比指纹图谱（图2 谱线a）与对照品保留时间（图2 谱线b-f)指认出其中5个峰：峰5为松果菊苷；峰7 为毛蕊花糖苷；峰8 为柚皮苷；峰12 为淫羊藿苷；峰19 为淫羊藿次苷。通过串联质谱共有峰分析指认出另外8 种：峰1为3,5-二甲氧基-4-羟基苯基-D-葡萄糖苷；峰2 为新北美圣草苷；峰3为双藿苷A；峰9 为柚皮素；峰10 为3,6-二芥子酰基蔗糖；1200f900ed600C3006121710！!13人人4人6人89人人14.151618200a051015202530354045505560Time/min图2对照指纹图谱（a）和对照品HPLC色谱图（b.松果菊苷；c.毛蕊花糖苷；d.柚皮苷；e.淫羊藿苷；f.淫羊藿次苷I）Fig.2 Reference fingerprints(a)and HPLC chromatograms of reference standards(b.Echinacoside;c.Acteoside;d.Naringin;e.Icarin;f.Icariside II)440应用化学第41卷峰11为朝藿定B；峰13为鼠李糖基淫羊藿次苷I；峰17 为淫羊藿次昔1。这些化合物的串联质谱信息如表1所示，以峰19 的质谱裂解途径为例，简要说明它们的质谱指认过程。峰19 在负离子模式下观察到准分子离子峰m/z513.1760,其主要发生糖基和常见中性小分子的裂解，碎片离子集中在m/z367.1164、352.0 9 12 和32 4.0 9 6 6 处。mlz367.1164的离子对应M-H-Rha-，是由一分子鼠李糖基的丢失产生。ml/z352.0912和m/z324.0966的离子为中性分子的丢失，分别对应M-H-Rha-CH,-和M-H-Rha-CH,一CO-。通过在质谱中与对照品的保留时间及裂解途径进行比对，峰19 被鉴定为羊藿次苷，其可能的裂解途径如图3所示。表113种共有峰的质谱鉴定Table 1Identification of 13 common peaks by mass spectrometryPeaksRetentionObservedMass error/Major product ionsSelected ionCompoundAttribution(No.)time/min(m/z)(mgL)(m/z）)14.13M-H-331.103 81.0179.056 0Koaburasidea25.95M-H-595.166.5-0.7459.113 7,235.024 5Neoeriocitrinb39.12M+H825.2789-2.8663.2299,517.1704,355.1180Diphylloside AC518.37M-H-785.2506-0.4623.218 8,461.1660,179.034 7Echinacosided722.14M-H-623.197 6-0.9461.164 9,315.104 8,179.0355Acteosided,e823.61M-H-579.171 2-1.2271.060 7,151.003 3Naringinb924.14M+H+273.075 90.6153.0181,119.0492Naringeninb1027.06M-H-753.22480.2223.060 4,205.0503,190.02663,6-Disinapoyl sucrosef1128.23M+HCOO-853.2767-0.6645.2182,366.1104,351.0870Epimedin BC1234.51M+HCOO-721.234.3-0.8513.1759,367.1175,351.0866IcarinC1334.81M-H-659.2335-1.6367.1165,351.0869,323.09202-0-Rhamnosylicariside IIC1740.36M-H-529.170 6-1.8367.1177,352.0929Icariside IC1941.39M-H-513.176 0-1.2367.116 4,352.0912,324.0966Icariside IICNote:a.Spatholobus;b.Rhizoma Drynariae;c.Epimedium brevicornum;d.Desertliving Cistanche;e.Radix Rehmanniae Praeparata;f.Radish Seed.A 6.0104352.0945367.11624.01042.0104324.0920C513.1726-H-H200250300350400450500550600OHHO-Rha.OH-CHm/=HOHOOHOHBOHOOH310OHOHOOHO367.1164Chemicalformula:Co,H,OiaChemicalformula:C,Hi,O,Chemicalformula:CaH,.O.Exactmass:513.1760Exactmass:352.0912Exactmass:367.11642104-CO324.0966-H352.0912513.1760OH1104HOOHOHChemicalformula:Ci,H.O,200250300350400450500550600Exactmass:324.0966m/=图3对照品（A）和样品中（B)淫羊藿次昔I的二级质谱图及其可能的裂解途径（C)Fig.3MS/MS spectrum of icariside I in reference standard(A)and sample(B),and its possible cleavage pathway(C)2.3共有峰归属对制备的藤黄健骨丸7 味药材阴性样品溶液进样测定并记录色谱图，利用“中药色谱指纹图谱相似441谢东等：基于UPLC-QTOF-MSE技术的藤黄健骨丸指纹图谱建立及共有峰鉴定第3期度评价系统（2 0 12 版本）”对色谱图进行分析，结果见图4。比对共有峰发现峰1来源于药材鸡血藤G，峰2、8 和9 来源于药材骨碎补D，峰3、6、11、12、13、14、15、16、17 和19 来源于药材淫羊藿F峰4、2 0 来源于药材熟地黄B，峰5、7 来源于药材肉蓉E，峰10 来源于药材莱子H，峰18 来源于药材鹿衔草C。fCb12174891011126713141516/181920人人a051015202530354045505562Time/min图4指纹图谱阴性对照Fig.4Negative controls of fingerprintsNote:a.The test solution;b.Negative sample solution of Radix Rehmanniae Praeparata;c.Negative sample solution of Pyrola;d.Negative sample solution of Rhizoma Drynariae;e.Negative sample solution of Desertliving Cistanche;f.Negative samplesolution of Epimedium brevicornum;g.Negative sample solution of Spatholobus;h.Negative sample solution of Radish Seed2.4共有峰相对保留时间和相对峰面积计算设置参照峰（5号色谱峰）的保留时间和峰面积为1.0 0，分别计算10 批藤黄健骨丸指纹图谱中其他19个共有峰相对参照峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见辅助材料表S7和S8。表中结果可以看出，10 批藤黄健骨丸指纹图谱中各共有峰相对保留时间的RSD值均不超过0.33%，相对峰面积的RSD值均小于4.6 2%，表明各批次样品的共有峰出峰时间和峰面积均比较稳定，提示它们所代表的各成分含量差异较小，样品质量稳定、可靠。2.5指纹图谱相似度评价取藤黄健骨丸10 批中间体和10 批成品的供试品溶液进行色谱分析并记录色谱图，导人“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2 0 12 版本）”选择X1作为参照图谱，采用中位数法，时间窗宽度设置为0.1，再进行多点校正以及Mark峰的匹配，建立10 批成品的指纹图谱，并自动生成对照指纹图谱R。再以生成的对照指纹图谱R为参照图谱，对10 批中间体色谱图同法建立中间体-成品指纹图谱。分别计算它们的相似度，结果见表2 和3。10 批藤黄健骨丸（成品）的指纹图谱相似度均在0.9 5以上，表明各批样品之表210批成品指纹图谱相似度计算结果Table 2Fingerprint similarity calculation results of 10 batches finished productsBatch No.X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10RX11.0000.9980.9970.9980.9590.9820.9800.9590.9790.9670.991X20.9981.0001.0000.9990.9680.9870.9860.9660.9840.9730.995X30.9971.0001.0000.9990.9700.9870.9870.9670.9840.9730.995X40.9980.9990.9991.0000.9640.9840.9830.9620.9800.9690.992X50.9590.9680.9700.9641.0000.9940.9940.9960.9930.9940.988X60.9820.9870.9870.9840.9941.0000.9990.9920.9980.9950.998X70.9800.9860.9870.9830.9940.9991.0000.9920.9970.9950.997X80.9590.9660.9670.9620.9960.9920.9921.0000.9960.9980.987X90.9790.9840.9840.9800.9930.9980.9970.9961.0000.9980.997X100.9670.9730.9730.9690.9940.9950.9950.9980.9981.0000.991R0.9910.9950.9950.9920.9880.9980.9970.9870.9970.9911.000442第41卷应用化学间质量均一、稳定，制剂工艺稳定。中间体-成品指纹图谱的相似度在0.9 54 1.0 0 0 范围内，说明藤黄健骨丸由中间体加蜜制备成品丸剂的工艺过程中，化学成分的损失较少，主要成分均在中间体及成品中体现，表明中间体与成品间相关性较好，该制剂工艺稳定表3中间体-成品指纹图谱相似度计算结果Table3Calculated similarity results of intermediate-control fingerprintBatch No.RZ1Z2Z3Z4Z5Z6Z7Z8Z9Z10R1.0000.9750.9810.9850.9810.9950.9980.9980.9950.9980.997ZI0.9751.0000.9950.9970.9970.9560.9810.9740.9540.9800.968Z20.9810.9951.0000.9990.9990.9670.9880.9830.9610.9840.971Z30.9850.9970.9991.0000.9990.9720.9900.9860.9670.9870.976Z40.9810.9970.9990.9991.0000.9650.9870.9810.9610.9840.972Z50.9950.9560.9670.9720.9651.0000.9930.9940.9950.9900.991Z60.9980.9810.9880.9900.9870.9931.0000.9970.9910.9970.993Z70.9980.9740.9830.9860.9810.9940.9971.0000.9910.9950.993Z80.9950.9540.9610.9670.9610.9950.9910.9911.0000.9940.997Z90.9980.9800.9840.9870.9840.9900.9970.9950.9941.0000.998Z100.9970.9680.9710.9760.9720.9910.9930.9930.9970.9981.0003结论建立了藤黄健骨丸的HPLC指纹图谱，确定了2 0 个共有峰，并参照阴性样品对峰进行了归属。通过对照品保留时间结合串联质谱分析对13种成分（3,5-二甲氧基-4-羟基苯基-D-葡萄糖苷、新北美圣草苷、双藿苷A、松果菊苷、毛蕊花糖苷、柚皮苷、柚皮素、3,6-二芥子酰基蔗糖、朝藿定B、淫羊藿苷、鼠李糖基淫羊藿次苷、淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷）的色谱峰进行了指认，并推断了淫羊藿次苷的质谱裂解途径。计算了10 批藤黄健骨丸指纹图谱共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明各批次样品共有峰相对保留时间和相对峰面积的差值均较小，所对应的各成分含量保持稳定。对建立的指纹图谱进行了相似度评价，发现10 批成品的相似度较好，均在0.9 5以上，表明该制剂质量稳定，所建立的指纹图谱能对其质量进行整体控制，且藤黄健骨丸中间体与成品之间也具有良好的相关性。综上，本研究建立的指纹图谱可对藤黄健骨丸的内在质量进行整体性评价，为其质量标准提升提供科学依据。辅助材料（S厂指纹图谱相关数据表格从木利网站（en/）下载辅助材料（SupportingInformation）指纹图谱相关数据表格】可以从本刊网站（http:/ W J,WANG Y C,DUAN Y,et al.Effect of Tenghuang Jiangu Wan in the treatment of postmenopausalosteoporosis model rats by regulating BMP-2/Smad signaling pathwayJ.Jilin J Tradit Chin Med,2023,43(12):1459-1464.2 刘爱国，樊芹英，郑浩，等藤黄健骨胶囊联合经皮椎体成形术治疗骨质疏松性椎体压缩骨折疗效分析J中医药临床杂志，2 0 2 0，32（6）：1132-1135.LIU A G,FAN Q Y,ZHENG H,et al.Therapeutic effect of Tenghuang Jiangu capsule combined with percutaneousvertebroplasty on osteoporotic vertebral compression fractureJ.Clin J Tradit Chin Med,2020,32(6):1132-1135.3】司文腾，陈宾，周宇。藤黄健骨胶囊联合玻璃酸钠治疗膝骨关节炎的临床研究J现代药物与临床，2 0 2 0，35(3)：525-528.SI W T,CHEN B,ZHOU Y.Clinical study on Tenghuang Jiangu capsules combined with sodium hyaluronate intreatment of knee osteoarthritisJ.Drugs Clinic,2020,35(3):525-528.4杨文博，乔莉，刘红喜，等藤黄健骨胶囊在骨质疏松性椎体压缩骨折经皮椎体成形术中的应用J中华中医药学刊,2 0 2 1，39(10)：2 15-2 18.443谢东等：基于UPITOF-MS技术的藤黄健骨丸指纹图谱建立及共有峰鉴定第3期YANG W B,QIAO L,LIU H X,et al.Application of Tenghuang Jiangu capsules combined with PVP for osteoporoticvertebral compression fractureJ.Chin Archi Tradit Chin Med,2021,39(10):215-218.5符仲秋，王维学，丰景斌藤黄健骨胶囊对大鼠膝骨关节炎的影响J中国临床药理学杂志，2 0 2 1，37（15)：1996-1998.FU Z Q,WANG W X,FENG J B.Effect of Tenghuang Jiangu capsules on knee osteoarthritis in rats J.Chin J ClinPharmacol,2021,37(15):1996-1998.6赵勇，王艳，郑金凤，等藤黄健骨丸质量标准研究J.中国药师，2 0 13，16(1)：7 6-8 0.ZHAO Y,WANG Y,ZHENG J F,et al.Study on the quality standard for Tenghuang Jiangu pills JJ.Chin Pharm,2013,16(1):76-80.7】赵子剑.HPLC测定藤黄健骨胶囊中淫羊藿苷的含量J.光明中医，2 0 0 9，2 4(4：6 46-6 47.ZHAO ZJ.Determination of icrain in Tenghuang Jiangu capsules by HPLCJ.Guangming Tradit Chin Med,2009,24(4):646-647.8于曼娜，张青.高效液相色谱法测定藤黄健骨胶囊中淫羊藿苷的含量J.海峡药学，2 0 0 6，18（4：9 8-10 0.YU M N,ZHANG Q.Determination of icarin in Tenghuang Jiangu capsules by high performance liquid chromatography JJ.Strait 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Qing,PIZi-Feng,ZHENG Fei,DAI Yu-Lin,YUE Hao(Jilin Ginseng Acadmg,Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China)2(Changchun People Pharmaceutical Group Co.,Ltd.,Changchun 130033,China)AbstractTo establish the high performance liquid chromatographic(HPLC)fingerprint of TenghuangJiangu Wan(THJGW)and improve its quality standard,a Waters Symmetry C18 column(150 mmx2.1 mm,3.5 m)was used and a gradient elution with 0.1%formic acid in w