京尼平苷对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞增殖及血管生成的影响及机制研究.pdf

欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁氉氉氉氉引文格式：苏杰，杨馥宇，李猛，蒋利生 京尼平苷对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞增殖及血管生成的影响及机制研究 眼科新进展，（）：【实验研究】京尼平苷对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞增殖及血管生成的影响及机制研究苏杰杨馥宇李猛蒋利生欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁氉氉氉氉作者简介：苏杰（：），女，年 月出生，河北人，硕士，副主任医师。研究方向：白 内 障、眼 底 病。：通信 作 者：蒋 利 生（：），男，年 月出生，河北人，副主任医师。研究方向：眼底病。：收稿日期：修回日期：本文编辑：付中静基金项目：河北省教育厅高等学校科 学 技 术 研 究 项 目（编 号：）；河北省医学科学研究课题计划（编号：）作者单位：河北省唐山市，华北理工大学附属医院眼科（苏杰，杨馥宇，李猛）；河北省唐山市，滦州市人民医院眼科（蒋利生）【摘要】目的研究京尼平苷（）对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞（）增殖、迁移及血管形成能力的影响，并探讨其作用机制。方法采用不同浓度（、）干预 ，检测 对 细胞增殖活性的影响。将 分为对照组，高糖（）组，低、中、高浓度（、）组，贝伐珠单抗（，）组和 高浓度 （）组。检测细胞增殖活性；划痕实验检测细胞迁移能力；体外成管实验检测细胞成管能力；检测细胞中血管内皮生长因子 （）、可溶性 受体 （）、基质金属蛋白酶 （）和基质金属蛋白酶 （）等蛋白表达水平。结果与 比较，、对 增殖活性的影响差异均无统计学意义（均为 ）。与对照组比较，高糖组 增殖活性和迁移能力均显著增强（均为 ），细胞环形管状结构增多，、和 蛋白表达水平均升高（均为 ），蛋白表达水平降低（）。与高糖组比较，各浓度组和 组细胞增殖活性和迁移能力均减弱（均为 ），细胞环状结构减少，、和 蛋白表达水平均显著降低（均为 ），蛋白表达水平均升高（）。与 高浓度组比较，高浓度 组细胞增殖活性显著减弱（），细胞环状结构减少，、和 蛋白表达水平均显著降低（均为 ），蛋白表达水平显著升高（）。结论 可抑制高糖诱导的 增殖、迁移与血管形成，其作用机制可能与调控 轴平衡有关。【关键词】京尼平苷；视网膜血管内皮细胞；血管内皮生长因子；可溶性 受体 ；血管形成【中图分类号】糖尿病视网膜病变（）是一种与长期糖尿病相关的微血管疾病，大约 的糖尿病患者会受到 影响 。发病机制复杂，包括氧化应激、炎症反应、新生血管等多种因素 。在 最后阶段，血管内皮生长因子（）异常产生并释放，导致新生血管形成，而视网膜新生血管是导致视网膜脱离、玻璃体积血和视力下降的主要原因 。目前，抗 药物成为了 治疗的一线选择，如贝伐珠单抗（）。然而，在哺乳动物体内存在一种内源性 抑制剂，即可溶性 受体 （），其能够与 结合，抑制 分子功能，但正常生理条件下，与 处于动态平衡状态，起到相互制约的作用。有研究表明 ，过表达 可显著抑制视网膜血管生成。因此，内源性 分子轴可能成为治疗 的关键靶点。京尼平苷（）是一类环烯醚苷类化合物，具有抗肿瘤、抗糖尿病、抗心肌功能障碍等多种药理活性 。在 体外和体内模型中均发挥着抑制氧化应激和炎症反应的作用，可减轻视网膜细胞和视网膜屏障的损伤 。具有抑制 表达作用，从而阻止血管生成 。因此，本研究推测 可能通过调控内源性 分子轴对 患者血管新生产生抑制作用。本研究拟通过高糖条件培养人视网膜血管内皮细胞（）模拟体外高糖模型，研究 对 增殖和血管形成能力的影响，并探讨其作用机制，旨在为 治疗研究提供新的实验依据。材料与方法 细胞与主要试剂 购自武汉普诺赛生命科技有限公司。（）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；、胎牛血清均购自美国 公司；试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；购自美国 公司；基质胶购自美国 公司；兔抗人 多克隆抗体、兔抗人基质金属蛋白酶 （）多克隆抗体、兔抗人基质金属蛋白酶 （）多克隆抗体、兔抗人 多克隆抗体均购自英国 公司；兔抗人 多克隆抗体购自美国 公司。检测 增殖活性（）取对数生长期 ，以每孔 个眼 科新进展 年 月第 卷第 期 ：细胞的密度接种于 孔板中，待细胞生长至约 融合度时，采用不同浓度（、）处理 。（）取对数生长期 ，以每孔 个细胞的密度接种于 孔板中，待细胞生长至约 融合度时，加入含 葡萄糖的 诱导 ，同时分别加入不同浓度（、）或 ，培养 。培养结束前 ，每孔加入 溶液，孵育 。酶标仪检测 处吸光度，计算细胞增殖活性。细胞分组处理将对数生长期的 分为：对照组，高糖组，低、中、高浓度组，组和 高浓度 组。除对照组采用含 葡萄糖的 进行培养外，其他组均采用含 葡萄糖的 培养。低、中、高浓度分别为、，组、高浓度 组中 浓度均为 ，高浓度 组中的 浓度为 。划痕实验检测 迁移能力实验前于 孔板背后，每隔 划一道横线，横穿过孔。取对数生长期 接种于该 孔板，每孔加 个细胞，培养过夜。用无菌枪头垂直于孔板背后横线进行划痕，洗去划落的细胞，按照 中分组加药干预后培养 ，显微镜下观察划痕处细胞迁移情况。计算划痕愈合率（）（划痕面积 划痕面积）划痕面积 。体外成管实验检测 成管能力取对数生长期 ，按照 中分组加药处理 。提前取 基质胶铺设于 孔板中，每孔 ，静置 备用。收集加药处理后的各组细胞，制备单细胞悬液，向 孔板中加入细胞悬液，每孔 ，培养 。显微镜下观察随机视野中细胞成管情况。检测 中 、和 蛋白表达水平取对数生长期 ，按照 中分组加药处理 。取所有组细胞沉淀，裂解提取总蛋白，法进行蛋白定量。电泳后，湿转法将蛋白转至 膜上，脱脂奶粉室温封闭 。加入一抗（稀释比 ，稀释比 ，稀释比 ，稀释比 ，稀释比 ），孵育过夜。加入 标记的二抗（稀释比 ），室温孵育。加入化学发光试剂，于暗室中显影曝光，分析蛋白条带灰度值，目的蛋白相对表达量 目的蛋白灰度值 灰度值。统计学方法采用 软件进行统计学分析，计量资料采用 珋 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 检验。检验水准：。结果 对高糖诱导下 增殖活性的影响 检测结果显示，与 比较，、对 增殖活性的影响差异均无统计学意义（均为 ）（图 ）。与对照组比较，高糖组 增殖活性差异有统计学意义（）。与高糖组比较，低、中、高浓度组 增殖活性差异均有统计学意义（均为 ）（图 ）。提示 可以抑制高糖条件下 增殖活性。：检测不同浓度 干预后的 增殖活性。：检测不同浓度 干预后高糖条件下 增殖活性；：对照组；：高糖组；：低浓度组；：中浓度组；：高浓度组。与对照组比较，；与高糖组比较，。图 对 增殖活性的影响 对高糖诱导下 迁移及血管形成能力的影响划痕实验结果显示，对照组、高糖组、低浓度组、中浓度组和 高浓度组细胞划痕愈合率分别为（）、（）、（）、（）、（）。与对照组比较，高糖组 迁移能力增强，划痕愈合率差异有统计学意义（）。与高糖组比较，低、中、高浓度组 细胞迁移能力减弱，划痕愈合率差异均有统计学意义（均为 ），呈 浓度依赖性（图 ）。细胞成管实验结果显示，与对照组比较，高糖组 环行管状结构增多。与高糖组比较，低、中、高浓度组 环行管状结构逐渐减少（图 ）。对高糖诱导下 中 轴相关蛋白表达的影响 检测结果显示，与对照组比较，高糖组 中 、和 蛋白表达水平均升高，差异均有统计学意义（均为 ），而 蛋白表达水平降低，差异有统计学意义（）。与高糖组比较，低、中、高浓度组 中 、和 蛋白表达水平逐渐降低，差异均有统计学意义（均为 ），而 蛋白表达水平逐渐升高（均为 ），呈浓度依赖性（图 ）。：眼 科新进展 年 月第 卷第 期 图 对高糖条件下 迁移能力的影响图 对高糖条件下 血管形成能力的影响：对照组；：高糖组；：低浓度组；：中浓度组；：高浓度组。与对照组比较，；与高糖组比较，。图 对高糖诱导下 中 轴相关蛋白表达的影响 通过调控 轴抑制高糖诱导的 增殖和血管生成 检测结果显示，高糖组、高浓度组、组和 高浓度 组 增殖活性分别为（）、（）、（）、（）。与高糖组比较，高浓度组和 组 增殖活性均降低（均为 ）；与 高浓度组比较，高浓度 组 增殖活性降低（）。与高糖组比较，高浓度组和 组 中 、和 蛋白表达水平均显著降低，蛋白表达水平均增加，差异均有统计学意义（均为 ）；与 高浓度组比较，高浓度 组 中 、和 蛋白表达水平进一步降低，蛋白表达水平进一步升高，差异均有统计学意义（均为 ，图 ）。与高糖组比较，高浓度组和 组 环形管状结构均减少；与 高浓度组比较，高浓度 组 中几乎没有环形管状结构的细胞簇（图 ）。：高糖组；：高浓度组；：组；：高浓度 组。与高糖组比较，；与 高浓度组比较，。图 检测各组细胞中 轴相关蛋白表达水平图 体外成管实验检测各组细胞成管能力 讨论视网膜是一种由视杆和视锥感光感受器细胞组眼 科新进展 年 月第 卷第 期 ：成的多层网络，与双极细胞和神经节细胞结合，通过将从光中获得的信息编码为神经脉冲来实现视觉 。视网膜由广泛的血管系统提供氧气和营养，当机体出现高血糖水平时，会增加血 视网膜屏障的通透性，导致血液渗漏至视网膜中，且高血糖也会阻塞视网膜毛细血管，阻碍营养物质的输送，造成视网膜的进一步损伤 。发病过程中，主要表现有视网膜血管通透性增加，毛细血管闭塞，视网膜缺血、缺氧，血管生成因子释放和新生血管形成等 。视网膜血管内皮细胞被认为是糖尿病诱导血管损伤的主要细胞靶点，高血糖通过不同的机制致使视网膜内皮细胞迁移、增殖等生物学行为加强，引起微血管功能障碍或最终导致新生血管生成 。与上述研究结果相似，在本研究中，高糖诱导下的 增殖活性、迁移能力和血管形成能力增强。大量研究 显示，多种天然产物可抑制 增殖、迁移和血管生成，在治疗 方面具有很大的潜在价值。具有抗炎、抗血管生成等药理作用，研究发现，可抑制血管内皮细胞的生物学功能、基底膜形成、血管通透性，减轻 诱导的血管生成 。本研究采用 干预高糖诱导后的细胞，发现细胞增殖活性、迁移能力和血管形成能力减弱，且高浓度 的抑制作用更明显，提示 对高糖诱导的 增殖、迁移和血管形成具有抑制作用，与上述研究结果一致。糖尿病环境刺激多种 的分泌，和 在 早期可能通过破坏线粒体促进视网膜毛细血管细胞凋亡，在 晚期，诱导新生血管形成，因此，具有成为 治疗靶标的潜在价值 。与 之间存在作用关系，能诱导 表达以促进视网膜新生血管形成 。有很多亚型，是 最重要的致病因子之一 。在 中表达上调，被确定为 发病机制的关键驱动因素。是一种可溶性的 拮抗剂，与 之间的动态平衡状态对维持血管生长平衡具有重要作用 。可抑制细胞增殖、侵袭、迁移和血管形成，抑制 轴的表达 。是一种完全人源化的免疫球蛋白 分子，是 特异性抗体，可与 亚型结合并抑制其表达，阻断 对新生血管形成和血管通透性增加的诱导作用，可用于治疗 ，。本研究采用 作为 抑制剂与 联合使用，探讨 是否通过调控 表达而发挥作用，结果显示，与 均对高糖诱导的 增殖和血管形成产生抑制作用，下调 、和 蛋白表达，上调 表达水平，且 与 联合作用效果更显著，提示 可能与 的作用机制相似，对 轴平衡具有调控作用。结论 可通过调控 轴平衡，对高糖诱导的 增殖、迁移与血管形成发挥抑制作用，本研究结果提示，对 治疗具有一定的药用价值，值得深入研究与应用，且 轴可能是 在 治疗中的一个有前途的靶点。参考文献 ，（），（）：，（），：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：崔锡铭，王霜，许顺江，张睿，谢冰，催冬生，等 白藜芦醇对高糖环境下人视网膜血管内皮细胞增殖的影响及分子机制 山东大学学报（医学版），（）：，（），（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，：孔慧，崔彦 糖尿病视网膜病变中视网膜内皮细胞功能障碍的研究进展 眼科新进展，（）：眼 科新进展 年 月第 卷第 期 ，（）：陈前波，席晓婷，马嘉，赵剑锋，王雪维，蔡斌，等 通过 分子轴促进视网膜血管内皮细胞增殖及迁移和血管生成 国际眼科杂志，（）：，（）：，：，：，：，：，（）：，：？，（）：王宁，李志坚，刘平，苏胜 在糖尿病视网膜病变中的作用 医学综述，（）：，（）：，：，：，：，（）：，：，（）：李敏，莫诗雯，李伊，张全鹏 血 视网膜屏障损伤的机制及治疗对策 国际眼科杂志，（）：，（）：，：，：【】（），（）（，），（），（），（，），（，）（）（），（），（）（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），【】；眼 科新进展 年 月第 卷第 期 ：