果蝇杂交、同工酶及分子标记系列分析实验-遗传学实验报告.docx

果蝇及其他物种杂交、遗传分析 果蝇杂交、同工酶及分子标记系列分析实验摘 要：本实验在果蝇杂交实验的基础上，结合同工酶分析实验和遗传分子标记实验，利用果蝇杂交实验获得的材料，进一步从基因组和蛋白水平上对不同物种或同一物种不同个体之间的差异以及遗传性亲缘关系和进化关系等方面进行分析。关键词：黑腹果蝇 伴性遗传 杂交 同工酶 SSR分子标记A series of experiments of Drosophila hybridization，isozyme analysis and molecular markerAbstract：This experiment is based on Drosophila hybridization, associated with isozyme analysis and genetic molecular markers analysis. Making use of the materials gathered in the hybridization, from the level of genome and protein, discuss differences between different species or different individuals of the same species and genetic or evolutionary relationships. Key Words：Drosophila melanogaster sex-linked inheritance hybrid isozyme SSR 果蝇性染色体上的基因传递方式与雌雄性别有关，这种伴性基因的遗传方式称为伴性遗传（sex-linked inheritance）。果蝇的性染色体有X和Y两种，雌性是XX，为同配性别；雄性是XY，为异配性别。伴性基因主要位于X染色体上，而Y染色体上没有相应的等位基因，果蝇的红眼与白眼是一对相对性状，关系为红眼对白眼完全显性。当红眼雌性果蝇和白眼雄性果蝇杂交，子一代（F1）中的果蝇均为红眼，子二代（F2）中红眼果蝇白眼果蝇=31，其中雌果蝇中全为红眼，在雄果蝇中红眼果蝇白眼果蝇=11。当反交时，即红眼雄性果蝇和白眼雌性果蝇杂交，F1中的雌果蝇都为红眼，雄果蝇都为白眼；F2中红眼果蝇白眼果蝇=11，在雌果蝇或雄果蝇中红眼果蝇与白眼果蝇的比例均为11。这一结果说明果蝇的眼睛颜色这一性状的决定基因存在于X性染色体上。同工酶是催化反应相同但结构和理化性质不同的一组酶，不同物种的同工酶的活性与分子量均有所差异。本实验对小鼠肝组织，鱼组织，大果蝇D.Virilis，黑腹果蝇Drosophila melanogaster（三隐形品系亲本及子二代）的酯酶（Est）和乳酸脱氢酶（LDH）进行酶活性与分子量的比较分析，结果表明不同物种的同工酶活性及分子量有差异，同一物种，不同品系的个体其同工酶的活性与分子量也不相同。遗传学研究的一个核心问题就是基因的结构与功能。除了大规模的基因组测序外，遗传分子标记实验是研究基因组结构的有效途径。随着聚合酶链式反应（PCR）的广泛应用，多种以PCR为基础，设计特殊引物扩增DNA的分子标记技术应运而生，如RAPD、DAF、SSR等。其中，SSR因在真核生物基因组中广泛分布且操作简单快速而被广泛应用于生物的基因定位和分离、连锁和系统演化等方面的研究。1. 果蝇的伴性遗传杂交实验 1.1 实验原理1.1.1 果蝇杂交实验设计与分析果蝇的野外采集与鉴定:果蝇的生活力很强，野外采集非常方便。若在实验室收集，可在培养瓶中装八一些即将腐烂的水果，如苹果、香蕉等吸引果蝇，待果蝇进入培养瓶后盖上瓶口，进行培养观察，将野外采集的果蝇接入麻醉瓶中，待麻醉后倒在一张向纸上进行观察选种。选种时利用毛笔、放大镜对野外采集的果蝇的体色、眼色、刚毛的形状以及身体大小琴遗传性状进行观察记录，将实验室培养的突变体果蝇和野外采集的果蝇进行比较观察，挑选合适的果蝇进行果蝇杂交实验。果蝇的伴性遗传杂交实验:位于性染色体上的基因叫作伴性基因，其遗传方式与位于常染色体上的基因有一定差别，它在亲代与子代之间的传递方式与雌雄性别有关，伴性基因的这种遗传方式称为伴性遗传（sex-linkedinheritance）。果蝇的染色体有X和Y两种，雌性是XX，为同配性别；雄性是XY，为异配性别。伴性基因主要位于X染色体上，而Y染色体上没有相应的等位基因，所以这类遗传也叫X-连锁遗传。 果蝇的红眼与白眼是一对相对性状，由单基因控制，位于X染色体上，基因之间的关系为红眼对白眼完全显性。当红眼果蝇（）和白眼果蝇（）杂交，F1代中的果蝇均为红眼，F2代中红眼果蝇白眼果蝇=31，但在雌果蝇中全为红眼，在雄果蝇中红眼果蝇白眼果蝇=11。当反交时，F1代中的雌果蝇为红眼，雄果蝇却为白眼。F2代中红眼果蝇白眼果蝇=11，在雌果蝇或雄果蝇中红眼果蝇与白眼果蝇的比例均为11。正交： 白眼雌红眼雄 反交： 红眼雌白眼雄 P： XwXwX+Y P： X+X+ XwY F1： X+XwXwY F1： X+XwX+YF2： X+Xw XwXw X+Y XwY F2： X+X+X+Xw X+Y XwY表型: + w + w 表型: + + + w 选取处女蝇的必要:由于雌蝇体内有贮精囊，一次交配可校长时间地贮存许多有活性的精子，以供多次排卵受精使用，因此在杂交前必须选取处女蝇，以确保得到准确可靠的实验结果，选处女蝇时，首先要放掉培养瓶中的全部老蝇，然后于10h内(雌蝇在孵出后12h内一般不进行交配，为保险起见确定为10h内)选择新孵出的雌蝇单独收集备用。1.1.2 果蝇的生长周期果蝇的整个生活周期分为4个时期，分别为卵、幼虫、蛹和成虫阶段，1012天为一个世代。饲养果蝇的最适温度为2025。下图为果蝇的生活史。图1. 果蝇生活史示意图1.2 实验目的1.学会果蝇的野外采集与鉴定，掌握果蝇杂交技术和运用统计学原理处理数据的方法。2.通过果蝇杂交实验加深理解遗传伴性遗传规律。1.3 实验准备1.3.1 实验材料黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)突变品系：三隐性 (XwXw XwY)野生型品系：野生型 (X+X+ X+Y)1.3.2 实验式剂和主要仪器设备实验试剂：乙醚，玉米粉、琼脂、白糖、酵母粉、丙酸。仪器设备：实体解剖镜，手持放大镜，麻醉瓶，培养瓶(250mL广口瓶)，塑料板，毛笔，试剂瓶。1.3.3 方法培养基配制 玉米粉 28g，白糖 22g，水270mL，琼脂 2.5g，酵母粉 2.5g，丙酸 2mL。混匀加热并煮沸后，倒入培养瓶，晾至自然凝固。 果蝇麻醉轻拍培养瓶口，使聚集在瓶口的果蝇掉落至瓶底，直到瓶口不再有果蝇后，取开瓶塞，将另一空的麻醉瓶口对准果蝇培养瓶，用光诱法引诱果蝇向麻醉瓶移动。果蝇全部移动至麻醉瓶后，迅速用塑料板将两个瓶口隔开，各自盖好。在麻醉瓶瓶盖上放一棉球，滴加乙醚7滴左右，盖在麻醉瓶上，直到果蝇停止活动。果蝇性别的鉴定雄性雌性体型较小较大腹部形态腹部窄小，腹背有3条条纹，腹背后端呈明显黑色腹部浑圆，宽厚，有5条条纹。性梳有，位于第一对足的跗节基部无1.4 实验操作与步骤1.4.1收集处女蝇9月22号，放飞培养瓶内成蝇，10小时内用光诱法将果蝇引诱到空的培养瓶，等果蝇全部爬进毒瓶，用沾有乙醚的棉球置于瓶盖处，盖上毒瓶。等到果蝇麻醉程度至停止活动，停止麻醉并收集处女蝇，雌蝇单独放入小指管内，雄蝇放入大试管内；9月23早7:00和晚上10:00收集处女蝇，方法同上。1.4.2 果蝇杂交亲代培养与杂交培养瓶中分别装入野生雄性（XWY）和三隐形雌性（XwXw）各11只对雌雄果蝇混合培养，此组作为正交；再分别将三隐性雄性（XwY）12只和野生型雌性（XWXW）10只装入同一有培养基的培养瓶内杂交，作为反交。贴好标签，做好标记（9月28日-9月30日）。各组放入生化培养箱中培养，培养温度为37，每天进行果蝇生长周期观察，培养9 d。F1代培养、收集与杂交培养9天后（10月8日），放飞亲本，继续培养F1，将新生长的成虫果蝇引诱到毒瓶中麻醉，观察并统计成虫性别和眼睛颜色。连续收集统计3天。持续3天（10月12日至15日)收集F1代。10月16日，从正反交F1中各取雌雄性10只，在广口瓶内杂交，做好标记，37培养，培养7天。剩余F1代果蝇进行表型观察并记录，收集冻存。F2代培养、收集与杂交7天后（10月23日），放飞F1代，继续培养F2代，培养5天。5天后，F2开始羽化，将新生长的成虫果蝇引诱到毒瓶中麻醉，观察并统计成虫性别和眼睛颜色。连续收集统计3天（10月28、29日）。1.5 实验结果与分析讨论1.5.1数据记录由于在10月8号放飞亲本蝇时，最终F1代收集到的总数为112只，正交F1雌性全为红眼，雄性全为白眼；反交F1全部为红眼，数据见表1：表1. 果蝇F1代统计结果雌性()雄性()正交2917反交3630表2. 果蝇F2代统计结果F2代本小组经10月28、29日两天的收集，总计收集到673只果蝇，详见表2：正交反交红眼白眼总计红眼白眼总计雌性()140111251雌性()3360336雄性()137113250雄性()204133337总计277224501总计540133 6731.5.2 统计分析果蝇杂交世代图谱如下：正交： 白眼雌红眼雄 反交： 红眼雌白眼雄 P： XwXwX+Y P： X+X+ XwYF1： X+XwXwY F1： X+XwX+YF2： X+Xw XwXw X+Y XwY F2： X+X+X+Xw X+Y XwY表型: + w + w 表型:+ + + w理论： 1 : 1 : 1 : 1 理论： 2 ： 1 ： 1实际： 140 : 111 : 137 : 113 实际： 336 : 204 : 133 统计数据的2检验根据统计公式2 =（观察值 理论值）2 / 理论值。具体检验结果如表4所示。表4. F2 数据2检验正交表型雌红雌白雄红雄白合计实际值140111137113501预期数125.25125.25125.25125.2550125.66P(n=3)0.05(差异不显著)反交表型雌红雌白雄红雄白合计实际值3360204133673预期数335.50168.25168.25673214.99P(n=3)0.01(差异极显著)根据2测定，查2表，正交n=4-1=3，P（0.01）=5.66，差异不显著，符合伴性遗传;反交n=4-1=3, P（0.01）=14.99差异极其显著，不符合伴性遗传。结果分析果蝇的眼色是由X染色体控制的遗传性状，其基因仅位于果蝇的X染色体上。对于这对基因来说，遵守伴性遗传的规律，且正反交个体在F1、F2代上表型比率不同【张根发，遗传学实验，北京：北京师范大学出版社，2010.9：8687】。由实验结果可见，收集到的果蝇中，正交F1代雌性全为红眼，雄性全为白眼，反交F1不论雌雄全为红眼，与理论预测相符合。通过2适合度测验，正反交F2代P值均0.01，不符合伴性遗传规律，分析可能的原因有：1)在伴性遗传中，眼色基因并不是独立进行遗传，其会与X染色体上其他基因发生连锁交换，从而产生表型性状不符合理论比率的情况【徐晋麟，徐沁，陈淳，现代遗传学原理，北京：科学出版社，2001.3:7879】；2) 果蝇眼色遗传的复杂性：果蝇的颜色不仅受X染色体上的基因控制，还受到常染色体基因的控制，并且果蝇眼色还受到一组复等位基因的控制，任何基因位点的突变都会影响果蝇的眼色；【陈宝明，果蝇眼色遗传及基因漫谈，生物学通报，西安，42(5)：2627】2) 实验时间有限，果蝇总数不足，数据的代表性不足；3) 实验随机误差大。实验操作的不到位以及对果蝇性别和性状的不标准分辨都会对实验结果产生影响。另外，在实验中还出现了：在反交F2中，出现白眼雌蝇的性状(按照遗传图谱分析，F2代不会出现该性状)，可能与减数分裂时染色体的异常分离有关【D. Peter Sunstad, Michal J. Simmons著，赵寿元等译，遗传学原理(第三版)，北京：高等教育出版社，2011.4:112113】，也可能是基因突变引起的。实验中出现了很多问题，针对这些问题，我们总结出以下一些经验供后人参考使用：1) 用乙醚麻醉果蝇的时候要注意乙醚的用量，乙醚过多会使果蝇死亡，过少则会使果蝇在计数时醒过来逃逸，影响实验；2) 在盖麻醉甁的盖子和培养瓶的棉球的时候要确保瓶口处没有果蝇，否则果蝇可能被压死，影响实验结果；3) 将麻醉了的果蝇放入培养甁时注意确保瓶内干燥，否则果蝇会被粘在瓶壁上不能活动，影响果蝇的生存和繁殖；4) 在放飞果蝇的时候注意不能用力拍打培养甁甁壁，负责会使培养基变形，压住部分果蝇和为孵化出来的幼虫；5) 实验持续时间较长的时候，要注意保证实验设备持续正常运行，避免影响实验结果。2、 同工酶分析实验2.1 实验原理能催化同一反应而蛋白质结构不同的酶，称为同工酶。同工酶的蛋白结构既然有差别，它们的理化性质也就有所差异。因此可用电泳或其他方法将它们分离开来。并利用特异底物染色法使它们在凝胶上显示出迁移率不同的活性区带。这样基因的产物就直接反映出来了。同工酶电泳分析是一种重要而用途广泛的分子生物学方法。酯酶（Est）是催化酶类化合物水解的酶系，其同工酶的遗传学较为复杂。以萘乙酸脂为底物的同工酶属于羧基的酯酶类，一般为单链或二聚蛋白质。通过凝胶电泳分离后在染料监牢蓝RR盐存在下，凝胶上的酶带与-乙酸萘脂或-乙酸萘脂作用后显示出褐色或红色的酶带，由此易鉴别出酶谱的差异，酶带颜色的深浅正反映出酶活性的大小。乳酸脱氢酶(LDH)是用于催化乳酸脱氢反应的酶。乳酸脱氢酶（LDH）同工酶，它们都能催化乳酸脱氢产生丙酮酸，但经电泳法分离后，就有5个同工酶区带。2.2 实验目的掌握同工酶分析的方法技术理解同工酶分析的遗传学意义2.3 实验材料生物材料：小鼠肝脏适量，鱼组织0.05g，D. Virilis大果蝇10只，两代黑腹果蝇各20只；实验试剂：组织匀浆液：100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl (pH8.0)，25mmol/L EDTA。上样缓冲液：0.25%溴酚蓝、40%（W/V）蔗糖水溶液。1.5mol/L Tris-HCl (pH8.8)，4存放。0.5mol/L Tris-HCl (pH6.8)，4存放。30% Acr/Bis：29.2g Acr + 0.8g Bis，用双蒸水定容至100ml，过滤备用，4存放。5电泳缓冲液（室温存放）：Tris 7.5g，Gly 36g，双蒸水溶解，定容至500ml，使用时稀释5倍。pH7.0磷酸缓冲液：61.0mL 0.2mol/L Na2HPO4 + 39.0mL 0.2mol/L NaH2PO4。染色液EST染液（由一个小组配240ml，均分每组20ml）：A. 醋酸-萘脂和醋酸-萘脂各120mg，溶于12ml丙酮中。B. 监牢蓝RR盐240mg，溶于12ml丙酮中，加216ml pH7.0磷酸缓冲液。两者完全溶解后把A倒入B中，迅速搅拌均匀，避光过滤。LDH染液（由一个小组配240ml，均分每组20ml）：NAD+ 120mg，NBT 72.0mg，PMS 4.8mg，乳酸钠溶液24ml，0.5mol/L Tris-HCl (pH6.8） 107.2ml，NaCl 0.08g，蒸馏水108.8ml。设备仪器：电泳仪，离心机，研钵，小指管等。2.4实验步骤酶液提取 将5只蓝枪头口事先在酒精灯上烧圆，制成枪头杵子；取实验材料（普通果蝇20只、大果蝇10只、小鼠肝0.03g、鱼肝0.05g）置于1.5ml离心管；加入适量液氮后，在冰上用枪头杵子捣碎至样品成粉末状且发白；在冰上，加入80L组织匀浆液，充分悬浮样品，每静置7至8min吹打几次, 如此重复3次；4，13000rpm离心5min；移上清于另一离心管，4保存。电泳与染色 配制分离胶（7.5%）和浓缩胶（4%）。分离胶注入两玻璃夹缝中（加到离短玻璃上缘2cm），胶面上加1cm蒸馏水（自然凝胶后倾出、除干净）。浓缩胶加入两玻璃夹缝中，并在两玻璃板夹缝中水平插入梳子（注意有棱一面在短玻璃侧），待凝胶后在缓冲液中小心拔出梳子。样品制备：酶液10L与上样缓冲液10L（1:1）在PE手套上混匀。加样：小心地向每个上样孔加入20L的样品，加样顺序依次为小鼠、鱼、大果蝇、黑腹果蝇亲代、黑腹果蝇后代F2，再顺次重复一遍。电泳：4冰盒中，180V电泳（电泳时配染色液，避光保存）。停止电泳: 指示剂溴酚兰移至底部约0.5cm时，切断电源。染色：在电泳过程中配染色液，在抽屉中避光保存；电泳结束后，小心从玻璃板中取下胶。去掉浓缩胶，将分离胶进行染色至酶带显色。Est和LDH染色约1020min，染色中注意要避光（37环境中 染色更好）。脱色、固定、保存、染色后的胶置于7%乙酸、照相。2.5 实验结果通过对染色结果照片的观察与测量，推测各物种之间的亲缘关系并计算各个物种体内同工酶的迁移距离和迁移率等。图1 各样品电泳后Est染色图（从左到右依次为：黑腹果蝇杂交子代、黑腹果蝇杂交亲代、大果蝇（D.Virilis）、鱼、小鼠）本实验结果大体上较为清楚，只是小鼠的条带，颜色太浓几乎无法准确区分条带数和条带位置，可能是其条带太多太密以及染色时间较长造成的。鱼能清楚看到两条条带，第一条颜色较深且细，第二条颜色较浅且粗。大果蝇由于整体颜色都很浅，后面的条带由于屏幕显示问题难以辨认，手机拍的照片能看到浅的三条条带。黑腹果蝇的亲代有四条条带，前两条宽且浅，后两条颜色特别深且条带细。黑腹果蝇子代有三条条带，颜色由深至浅，说明酶的活性逐渐降低。黑腹果蝇的亲代和子代其最上端三个条带的位置相近，可能是二者亲缘关系较近造成的。图2 各样品电泳后的LDH染色图（从左到右依次为：黑腹果蝇杂交子代、黑腹果蝇杂交亲代、大果蝇（D.Virilis）、鱼、小鼠）本实验基本未得到完整结果。小鼠能看到一个较浅的条带，鱼能看到一个颜色最深的条带。大果蝇，黑腹果蝇均看不到条带。表1：各样品EST染色条带性质样品带数图谱（由近及远）表示出宽窄，染色深浅颜色迁移距离迁移率黑腹果蝇子代1红褐1.20.242浅红褐2.50.503浅红褐4.00.80黑腹果蝇亲代1红褐1.30.262浅红褐2.40.483深红褐4.10.824深红褐4.80.96大果蝇1浅红褐1.20.242浅红褐2.10.423浅红褐3.60.72鱼1红褐1.30.262红褐2.00.40小鼠无法分辨深红褐表2：各样品LDH染色条带性质样品带数图谱（由近及远）表示出宽窄，染色深浅颜色迁移距离迁移率黑腹果蝇子代0黑腹果蝇亲代0大果蝇0鱼1蓝紫1.10.22小鼠1浅蓝紫1.40.282.6 分析与讨论Est染色中，以萘乙酸酯为底物（本次实验中为醋酸-萘酯 和醋酸-萘酯）的同工酶属于羧基的酯酶类，一般为单链或二聚蛋白质。也可说明羧基酯酶（Est）具有多态性。另外羧基酯酶是由同一基因座位的复等位基因控制产生的同工酶即等位酶，一般是由一个基因座位的少数几个突变而形成的等位基因控制产生。因为带的位置表示酶的分子量，带的颜色表示酶的活性。本次实验Est染色实验结果有些模糊，小鼠的条带，颜色太浓几乎无法分辨，可能是其条带太多太密以及染色时间较长造成的，也说明其酶的活性很高；大果蝇的条带由于整体颜色都很浅，导致后面的条带难以辨认，可能是时间过长，酶失活造成的；由Est染色看出黑腹果蝇后代和黑腹果蝇亲代的羧基酯酶（Est）大致相同，其酯酶应为二聚体，且亲缘关系很近。LDH同工酶是一种参与糖酵解的酶类，催化乳酸和丙酮酸的相互转化，它是由A、B亚基按不同比例组成的5种不同的同工酶,5种同工酶都是四聚体，分别为LDH1（B4）、LDH2（B3A1）、LDH3（B2A2）、LDH4（B1A3）和LDH5（A4）。本次实验中，LDH染色结果不完整，在照片中只出现了两个条带。分别为鱼和小鼠的条带，其他大果蝇，黑腹果蝇均看不到条带。大多数鱼类LDH同工酶为四聚体,即有2个基因座位Ldh a和Ldh b编码的A、B亚基聚合成四聚体,在PAGE中会随机组合形成5条酶带。EST同工酶的种间特异性比LDH同工酶种间特异性更显著，说明不同物种间EST同工酶的变异是显著地，因此作为遗传标志来鉴别亲缘关系。本次实验主要是通过研究物种组织所具有的同工酶种类相似性来判断其亲缘关系。查文献可知，酶带的产生既有它的遗传背景，也会受生理（发育阶段和存在的组织器官）、各种实验因素（染色方法、酶的浓度、电泳分辨率等）的影响。导致实验结果不理想的因素很多，情况较为复杂。前面提及，取的鱼和小鼠的组织器官具有随机性，且教师提供的鱼和小鼠材料已经处死，其发育阶段也不清楚；在加液氮研磨材料时，由于液氮极易挥发，可能研磨不充分，最终酶提取液中酶浓度较低，未达到聚丙烯酰胺凝电泳的分辨率，进而出现一片弥散或没有条带的现象；研磨及所有的步骤均由小组4人一起完成，各样品分别由不同的同学进行研磨及后续操作，不同人的操作能力、细心程度和实验状态等都有不同程度地差异，使得随机误差较大，也可能会造成不同样品间浓度、酶活性等存在显著差异；此外通过电泳将同工酶的不同亚基进行分开，胶块质量也会影响实验结果。3.油松亲子代遗传标记分析（叶绿体SSR实验）3.1实验原理3.1.1油松基本知识叶绿体基因组为单倍型；油松叶绿体来自父本。比较种子胚叶绿体与潜在父本叶绿体基因组，可进行父源(花粉供体)分析。（另从胚乳可获得母源基因）胚叶绿体单倍型与采集种子的树的叶绿体单倍型：一致：可能为自交；不一致：可能为异交。这种判断误差的大小与基因取样位点的多寡相关。3.1.2微卫星DNA又称短串联重复，或简单重复序列SSR。基序长度为16 nt，重复次数n=1060；多位于基因组非编码区，可认为是中性标记；其变异丰富，称共显性特征。这些小的串联排列的重复序列经常是通过核苷酸链的滑动错配或者其它未知的过程来改变它们的长度，从而导致微卫星在数量上的差异。微卫星的突变率高：每代每个配子的每个位点有2510-5110-2突变，因此造成了它们的多态性。微卫星寡聚核苷酸的重复次数在同一物种的不同基因型间差异很大。微卫星通常是复等位的，代表每个微卫星位点的等位基因数目高度可变。3.1.3亲本分析亲本分析，是根据遗传定律和亲子代的形态、生理、遗传特征，判断亲本来源和特征的分析方法。根据松科植物的重要特点：（1）物种形成历程中经历了广泛的杂交与渐渗(两物种的杂交后代与亲本反复回交，把某一亲本的性状带至另一亲本，可使一个物种的基因插入到另一物种)。（2）两种质体基因遗传方式不同：线粒体基因为母系遗传（通过种子传播，基因流有限）；叶绿体基因为父系遗传（通过花粉和种子传播，基因流广泛）。本次实验的测序引物分为两组：A组和B组，基于如下原则（12个）：A组、B组内部的三个引物可以同时上机测定片段长度组合的原则是长度和标记荧光颜色的差别。所以分组情况如下：A组：pt2（TAMARA黄色）、pt6（FAM蓝色）、pt20（HEX绿色），B组：pt9（TAMARA黄色）、pt10（FAM蓝色）、pt4（HEX绿色）。3.2 实验目的比较种子胚叶绿体与潜在父本叶绿体基因组，进行父源分析；熟识实验操作技能。3.3 实验方法与步骤3.3.1 课前准备灭菌（具有石英砂和磁珠的Fastprep管，1.5ml指管，蓝枪头、黄枪头、白枪头），120，20min；确保DNA提取试剂盒中的PW和GD液已加入无水乙醇。3.3.2 DNA提取（1）每组领取种子（1颗），并记录种子来源；（2）分装全班所需裂解液GP1（700L/管样品），65预热；（3）剥取油松种子胚和胚乳，分别置于Fastprep管中，做标记；（4）在Fastprep组织破碎仪中，以5级速度，破碎Fastprep管中样品（20 sec）；（5）在通风橱中，向预热的GP1中加入巯基乙醇（终浓度为1%），取700L含巯基乙醇GP1加入每管已破碎的样品中（破碎完的样品需迅速加入GP1，以防止DNA降解）；（6）在65水浴锅中水浴45min，期间每隔5-10min上下颠倒混匀一次；（7）水浴结束，取出晾2-3min，加入700L氯仿，上下颠倒混匀。12000rpm，离心5min；（8）小心从离心机中取出（防止破坏分层），吸取上层水相于一个新离心管中，加入700L GP2，上下颠倒混匀；（9）将上一步混匀液体分两次移入吸附柱CB3中，静置3min，12000rpm，离心30s，弃掉废液；（10）加入500L去蛋白液GD，12000rpm，离心30s，弃掉废液；（11）加入700L漂洗液PW，12000rpm，离心30s，弃掉废液；（12）加入500L漂洗液PW，12000rpm，离心30s，弃掉废液；（13）12000rpm，再次离心2min，充分去除漂洗液；（14）将吸附柱至于一个干净的离心管中，通风橱中晾10min，使吸附柱中酒精充分挥发；（15）加65预热的洗脱缓冲液TE，50l（务必悬空加到吸附柱的中央），静置5min。12000rpm，离心2min；（16）将上一步离心产物吸出，重新加入到吸附柱中，静置5min，12000rpm离心2min，以提高DNA洗脱效率。（17）保留离心产物，做好标记；丢弃吸附柱。3.3.3 PCR聚丙烯酰氨凝胶电泳每组4对引物（pt2, pt4,pt6,pt9,各10M），2个DNA样品。（1）配制反应液（20L /每对引物）： 2L buffer（10 mM TrisHCl pH 8.3，50 mM KCl） 1.5L MgCl2（1.5mM） 1.6L dNTP（4种各0.2mM） 0.48L前导引物（0.24 M，荧光标记） 0.48L后置引物（0.24 M） 0.16L Taq 酶（0.8U）每对引物取19L混合液，加1L DNA 模板，混匀。（2）反应条件： 95预变性5min， 94 1min 55 50s 20个循环 72 1min 72后延伸8min。3.3.4 电泳及PCR产物量估算（1）制备电泳缓冲液（5TAE）500 ml：24.2 g Tris，5.71 ml 冰乙酸，3.72 g EDTA，定容至1000 ml）。使用前将5TAE稀释成1TAE用作工作液。（2）配制1% 琼脂糖凝胶：称取琼脂糖0.5 g，加入50 ml 1TAE电泳缓冲液，用光谱炉加热煮沸至琼脂糖全部融化, 即成凝胶液；待凝胶液温度降至60时，加入2.5 L Goldview，混匀后灌制凝胶板。根据电泳胶板大小决定配制/灌胶量，一般常温凝固30 min内即成凝胶。（3）1%琼脂糖电泳：每样孔2L 6 LoadingBuffer + 5 L PCR产物+5 L H2O；2L Marker （DL2000）（点于左侧第一孔）；恒压120V，时间20min。3.3.5 PCR产物变性和序列分析（1）变性液： 0.5L PCR产物pt2TAMARA（约5-10ng）+0.5LPCR产物pt6FAM（约5-10ng）+ 0.3LRox +7.7L甲酰胺； 0.5L PCR产物pt4TAMARA（约5-10ng）+0.5LPCR产物pt9 TAMARA（约5-10ng）+ 0.3LRox +7.7L 甲酰胺；（2）变性程序：94, 4min； 取出置-20 , 3min。（3）测序（用3100测序仪测序）（4）数据读取(Genemapper软件）3.4 实验结果与分析油松亲子代遗传标记分析（叶绿体SSR） 图二.全班基因组DNA聚丙烯酰氨凝胶电泳图三：PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分析：1）.看上面全班基因组凝胶电泳结果(右侧9-12)，可以看出我们从油松种子中提取出了DNA。下面的凝胶结果：凝胶有两条带，下面的一条带是我们组的结果，从凝胶电泳结果来看每个孔里面都有DNA，结果还是比较乐观，但由于加样时不太均匀，造成DNA的层次不齐，没有在同一水平线上。2）.最左边为Marker DL2000，从左往右上样顺序依次为胚（引物）pt2、pt4、pt6、pt9、pt10、pt20和胚乳（引物）pt2、pt4、pt6、pt9、pt10、pt20。凝胶下边为上样处。 表三 本组种子的胚及胚乳的单倍型行号列号班级胚or胚乳pt2pt4pt6pt9pt10pt20E04周三下午胚149.38145.2163.5187.857589.44F04周三下午胚149.28145.24163.5787.857589.29G04周三下午胚乳148.75162.0287.9475.189.3H04周三下午胚乳149.59148.76162.5487.957589.55Pt6结果分析：对胚和胚乳引物扩增产物序列分析，可得本组胚和胚乳叶绿体的6种SSR的序列长度：胚： pt2 pt4 pt6 pt9 pt10 pt20基因长度分别为：149 147 164 89 75 89胚乳： pt2 pt4 pt6 pt9 pt10 pt20基因长度分别为：150 151 162 89 75 89则本组种子胚乳的单倍体为149-151-162-89-75-89。由于胚乳pt2测序结果不理想，实验结果可能会有误差。图四.油松实验对象潜在父本的叶绿体单倍型分析数据根据我组实验数据，胚乳的单倍型为149-149-162-87，与7#植株的单倍型149-149-162-87基本匹配，验证了母本来源于7#植株，胚的叶绿体单倍型为149-147-164-89-75-89，与给出的基因序列比较，猜测父本可能为6#或7#植株。其中有数据不准，可能是由于实验操作过程中出现误差导致的，所以实验结果只能是推测。 图五.父源花粉分布图油松亲子代遗传标记分析（叶绿体SSR）查资料可知，维管植物叶绿体DNA一般为120150kb,其中被子植物120kb，裸子植物如银杏为158kb，石松为154kb。由测序仪输出的测序结果图主峰可以分别读取各组所测种子胚和胚乳不同引物PCR得到的SSR序列长度，得出胚和胚乳的单倍型，并据此汇总为实验结果表。但由于实验操作各个步骤中温度、pH、引入杂质(如导致Rox质量下降)等因素的影响，以及测序过程中的误差，所测得的单倍型可能与种子胚和胚乳的实际单倍型存在差异。从实验结果分析，这说明油松的传粉方式为风媒传粉，花粉的传播基本限于无障碍的植株之间。花粉来源的方向可反映风向，根据实验结果，我们推测花粉来源是6#和7#植株，而胚乳来源是7#植株，而6#植株在7#植株北面，因此该地区可能常刮北向的风。但观察分布图还可以发现，本次实验结果显示部分临近植株之间缺少花粉交流。可能由于：(1)实验种子样本较少，结果有偏差，某些父本来自临近植株的种子没有包括在内；(2)在树林中可能由于空气在各植株间流动而形成乱气流，使得有所阻隔的临近植株之间也可能互相传粉等等。3.5 讨论1.所测种子胚、胚乳的单倍型是什么？和胚乳的单倍型是什么？ 两者单倍型的差异意味着什么？答：种子的胚乳为母源叶绿体，胚为父源叶绿体，如果两者的单倍型一致，说明其可能是自交产物，如果不一致，则可能是异交产物。本实验中我组结果是：胚乳单倍型是：150-151-162-89-75-89，胚的单倍型是：149-147-164-89-75-89，由此可以看出两种单倍型差距不是很大，可以初步断定为自交，父本为7#植株，其中的误差有可能是因为操作过程中的失误导致的，或者是由于仪器的不精准。2.你所测种子的父本可能是源于哪棵树？距离多远？答：父本可能来