马口鱼源鮰爱德华氏菌的分离鉴定及耐药性_吴斌.pdf

收稿日期:20221001修回日期:20221102基金项目:福建省种业创新和产业化工程项目(2021FJSCZY04);福建省属公益类科研院所基本科研专项(20211014004);福建省海洋服务与渔业高质量发展专项(FJHY-YYKJ-2022-2-8)作者简介:吴斌(1978)，男，高级工程师研究方向:水产动物病害分子免疫学Email:wubinfire 126com马口鱼源鮰爱德华氏菌的分离鉴定及耐药性吴斌(福建省淡水水产研究所，福建 福州 350002)摘要:从发病马口鱼脑组织中分离出致病菌株 ObB210709B1，通过对该菌株形态特征、生理生化特性、16S rDNA 基因测序分析，鉴定分离菌株为鮰爱德华氏菌人工感染试验证实此菌株可引起健康马口鱼发病死亡，并表现出与自然发病相似的症状药敏试验发现:该菌对 3 种-内酰胺类、5 种氨基糖苷类、5 种喹诺酮类、2 种四环素类、1 种氯霉素类、1 种多粘菌素类等17 种药物高度敏感;对青霉素、苯唑西林、红霉素、万古霉素和复方新诺明等 5 种药物耐药对健康对照组、自然发病组和病原菌回归感染 120 h 组进行组织病理切片观察，感染鮰爱德华氏菌的马口鱼病理表现为:鳃丝崩解、肝空泡坏死、脾出血且开放科学(资源服务)标识码(OSID)坏死、肾小球出血与肾小管破裂，多组织器官均有细菌团块的聚集，肠道尤为严重关键词:马口鱼;鮰爱德华氏菌;分离鉴定;组织病理;药物敏感性中图分类号:Q941文献标识码:A文章编号:1671-5470(2023)03-0351-08DOI:1013323/jcnkijfafu(natsci)202303010Isolation，identification and antimicrobial resistance of Edwardsiellaictaluri from Opsariichthys bidensWU Bin(Freshwater Fisheries esearch Institute of Fujian，Fuzhou，Fujian 350002，China)Abstract:Bacterial strain ObB210709B1，isolated from brain tissue of moribund Opsariichthys bidens，was identified as Edwardsiel-la ictaluri by morphological observation，physiological and biochemical identifications and 16S rDNA sequence analysis egressioninfection of the strain resulted in the symptoms similar to the natural incidence even death Antibiotic sensitivity test showed thatObB210709B1 was resistant to 5 types of antibiotics including penicillin，oxacillin，erythromycin，vancomycin and co-trimoxazole，but highly sensitive to 17 antibiotics such as-lactam，aminoglycosides，quinolones，tetracyclines，chloramphenicol，polymyxins，etc Histopathological section of the natural incidence and regressive infection group showed collapsed gills，hepatic vacuolar necro-sis，splenic hemorrhage necrosis，glomerular hemorrhage，rupturedrenal tubule rupture and accumulation of bacterial masses inmulti-tissues and organs especially in intestinesKey words:Opsariichthys bidens;Edwardsiella ictaluri;isolation and identification;histopathology;drug sensitivity马口鱼(Opsariichthys bidens)俗称花杈鱼、桃花鱼、宽口等，隶属于鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprin-idae)马口鱼属(Opsariichthys)，广泛分布于我国的江河干、支流和湖泊中，是一种小型杂食偏肉鱼类12 马口鱼较易捕捞，其肉质鲜美，营养价值高，颇受消费者青睐，并且在南方 1 冬龄即性成熟，人工养殖潜力巨大3 目前，马口鱼的研究主要集中在规模化人工繁殖技术46、细胞遗传78、亲缘地理9、营养成分10、食性11 等方面，对于养成过程中的病害防控研究还未见报道2021 年，福建省南平市某淡水鱼养殖场养殖的马口鱼出现摄食能力减弱现象，患病鱼头部、鳍条根部、口腔内部黏膜存在出血症状，解剖发现肝脏为土黄色，脾脏肿大，出现血样腹水，个别鱼出现一侧或两侧眼球凸起，有身体异常弯曲和打转的症状12 龄亲鱼的死亡率小于 10%，23 cm 小苗的死亡率高达80%本试验从患病鱼的肝、肾、脾、脑组织中均可分离到菌落特征相同的优势菌株，选择脑中分离的菌株，对其进行生理生化特征研究以及耐药性分析，再利用形态学观察与分子技术构建系统进化树，以期为该病福建农林大学学报(自然科学版)第 52 卷 第 3 期Journal of Fujian Agriculture and Forestry University(Natural Science Edition)2023 年 5 月的防治提供依据1材料与方法11材料111样本回归感染用健康马口鱼，体质量2530 g，体长1214 cm，均来自顺昌县兆兴鱼种养殖有限公司112培养基与试剂脑心浸液培养基、脑心浸液琼脂、革兰氏染色液均购自北京陆桥技术有限责任公司;药敏纸片和细菌微量生化反应管均购于杭州微生物试剂有限公司;Taq PC Master Mix(2，blue dye)购自 BBI 生命科学有限公司;细菌基因组 DNA 提取试剂盒、DNA Marker DL2000、Nucleic Acid Dye 购自天根生化科技(北京)有限公司;16S rDNA 通用引物(27F 和 1492)合成、测序均由上海生物工程技术有限公司完成12方法121病原菌的分离纯化与保存取患病马口鱼，观察、记录发病环境、临床症状和解剖症状，选择具有典型发病症状的病鱼脑组织进行细菌分离，脑心浸液琼脂平板划线分离细菌，28 恒温箱中培养24 h 后，挑取形态大小、颜色等特征基本一致的优势菌落重复纯化 2 次，然后接种于脑心浸液培养基，在 28、200rmin1摇床中培养 12 h，加入无菌甘油，使菌液和甘油的比例为 7 3(体积比)，混匀后分装于无菌冻存管中，先放置在20 冰箱 2 h，后转移至80 冰箱内长期保存122回归感染试验取体质量约 25 g 健康马口鱼暂养于 150 L 玻璃缸中，连续曝气，水温 2527，每日投喂 2 次，投喂 30 min 后换水，每次换全水体的 30%，暂养 7 d 使其稳定，试验前停食 24 h 后用于回归感染试验将80 条件下保存的菌株接种于脑心浸液琼脂平板，28 恒温箱中培养 12 h，无菌生理盐水冲洗平板获得细菌悬液，根据预试验结果，采用无菌生理盐水 10 倍稀释法，将细菌悬液稀释成 5 个合适的浓度备用回归感染试验分为肌肉注射法和腹腔注射法肌肉注射法:随机捞取健康马口鱼 60 尾，分 6 组，每组10 尾，背部肌肉注射，试验组每尾注射细菌悬液 01 mL，对照组注射 01 mL 无菌生理盐水腹腔注射法:随机捞取健康马口鱼 72 尾，每组 12 尾，注射部位为腹腔，其他步骤同肌肉注射法暂养期间连续曝气，不投饵，水温 2628，每日换水 1 次，每次换水 30%观察记录各组发病情况，及时捞除死亡马口鱼，连续观察 10 d，对濒临死亡、症状显著的马口鱼进行细菌的再次分离、纯化和保种123菌株鉴定1231形态特征观察将分离纯化得到的菌株接种于普通脑心浸液琼脂平板上，28 培养 1416 h，观察菌落形态特征，挑取单菌落，革兰氏染色，在光学显微镜下观察菌体形态特征1232分子生物学鉴定将保存菌株接种于脑心浸液培养基中，200 rmin1摇床(28)中培养 12 h后，12 000 rmin1离心 10 min 后收集菌体，使用天根细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取细菌全基因组DNA16S rDNA 引物序列:上游引物(27F)为 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，下游引物(1492)为 5-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3PC 反应体系 50 L，其中，Taq PC Master Mix(2blue dye)25 L，上下游引物各 2 L(10 molL1)，DNA 模板 1 L，ddH2O 20 L反应条件:94 预变性 5 min;94 变性 30s，58 退火30 s，72 延伸1 min，35 个循环;最后72 延伸10 minPC 反应产物在琼脂糖凝胶(质量分数为 10%)中电泳(120 V)25 min，采用凝胶成像系统观察电泳结果并送上海生物工程技术有限公司测序，获得的测序序列采用 NCBI 中的 nucleotide blast 进行序列同源性分析，利用 MEGA 70 软件构建系统进化树1233生化鉴定取分离保存的菌株接种于脑心浸液琼脂平板上，28 培养 48 h 备用，分别按照各细菌微量生化管试剂盒说明书进行后续试验，系统地鉴定该菌株的生化特性和生物学特性1234药物敏感性试验将首次分离保存的菌株接种于脑心浸液培养基，200 rmin1摇床(28)中培养 12 h，调整菌液浓度至 108cfumL1取 100 L 调整后的细菌悬液，均匀涂布于脑心浸液琼脂平板上，适度干燥后用无菌镊子将药敏纸片贴于培养基表面，28 培养 24 h 后分别测量各种抗生素纸片抑菌圈的直径，根据产品说明书判别结果253福建农林大学学报(自然科学版)第 52 卷1235组织病理观察迅速解剖健康对照组、自然发病组和病原菌回归感染 120 h 后的马口鱼做组织病理切片，取其鳃、肝、脾、肾、肠、脑、心组织块，用体积分数 4%的中性甲醛溶液固定 24 h 后，保存于 4 冰箱按照常规方法制作石蜡切片，H-E 染色，中性树胶封片，Olympus CX41 型显微镜观察并照相2结果与分析21病原菌的回归感染从自然患病鱼脑部分离纯化获得 1 株细菌，命名为 ObB210709B1，分别采用腹腔注射和肌肉注射的方法感染健康的鱼(表 1、表 2)两种回归方法中高浓度组死亡均集中在前 3 d，低浓度组死亡集中在 47 d，所有试验组的鱼最终均死亡，表明这株菌的毒力很强;回归鱼均能表现出鳍条根部、头部、口腔黏膜出血，脾脏肿大，血样腹水等自然发病症状;回归鱼无眼睛凸起、打转的症状，但该症状在自然发病中也只有个别鱼存在综上可知，该菌为马口鱼的致病菌表 1ObB210709B1 腹腔注射回归感染试验Table 1egression infection of strain ObB210709B1 by intraperitoneal injection菌液浓度cfumL1试验鱼总数尾累计死亡数/尾1 d2 d3 d4 d5 d6 d7 d8 d9 d0120000000009251091251112925108120111292510712015710111292510612011226101112925105120012451012表 2ObB210709B1 肌肉注射回归感染试验Table 2egression infection of strain ObB210709B1 by intramuscular injection菌液浓度cfumL1试验鱼总数尾累计死亡数/尾1 d2 d3 d4 d5 d6 d7 d8 d9 d0100000000009251091010925108103710925107103388891092510610122347910925105101111581022细菌的形态学特征分离菌最适培养基为脑心浸液培养基，但在脑心浸液琼脂平板上生长速度仍然较慢，菌落小，28 条件下生长 4 d 直径为 24 mm，菌落形态相似，圆形，黄白色半透明，表面光滑湿润，边缘整齐(图 1A)菌体革兰氏染色阴性，两端钝圆，短杆状，菌体大小(0510)m(1030)m，无芽胞(图 1B)A:菌落;B:革兰氏染色图 1分离菌株菌落特征和革兰氏染色(100)Fig1Colony characteristics and Gram staining of isolated strain353第 3 期吴斌:马口鱼源鮰爱德华氏菌的分离鉴定及耐药性23生化鉴定通过细菌微量生化管对 ObB210709B1 进行生化鉴定(表 3)分离菌生化活性较弱，只能利用葡萄糖、麦芽糖、果糖，不能分解其他糖类，且其他生化试验结果也多为阴性，参考 伯杰氏系统细菌学手册12，发现分离菌的生化特性与鮰爱德华氏菌最相似，初步确定该菌为鮰爱德华氏菌表 3分离菌株 ObB210709B1 生理生化特征1)Table 3Biochemical and physiological characteristics of strain ObB210709B1测定项目ObB210709B1Edwardsiellaictaluri测定项目ObB210709B1Edwardsiellaictaluri测定项目ObB210709B1Edwardsiellaictaluri运动性+D-甘露醇甲基红溶血性+七叶苷V-PD-葡萄糖产气+肌醇丙二酸盐乳糖D-山梨醇硝酸盐还原+麦芽糖+山梨糖DNA 酶D-甘露糖淀粉蛋白酶蔗糖棉子糖赖氨酸脱羧酶+L-鼠李糖ONPG+精氨酸双水解酶阿拉伯糖明胶液化鸟氨酸脱羧酶+纤维二糖H2S氧化酶果糖+吲哚产生氧化/发酵(O/F)FF1)“+”为阳性，“”为阴性，“F”为发酵，“O”为氧化2416S rDNA 序列分析PC 扩增 ObB210709B1 菌株的 16S rDNA 基因并测序，获得序列采用 MEGA 软件构建系统进化树PC 扩增产物约为 1 500 bp 的特异性条带，经测序获得基因片段序列，与 GenBank 中已有的核酸序列进行 BLAST 分析，结果表明，该序列与 Edwardsiella ictaluri Ms12(GeneBank 登录号 KC1129921)的16S rDNA基因序列同源性为 9950%系统进化树分析表明，分离菌株与鮰爱德华氏菌属同一分支(图 2)结合形态学和生理生化特征，将所分离菌株鉴定为鮰爱德华氏菌图 2菌株 ObB210709B1 的系统进化树Fig2Phylogenetic tree of strain ObB210709B125药物敏感性菌株 ObB210709B1 对 24 种药物的敏感性试验(表 4)结果表明:该菌株对参与试验的氨基糖苷类药物、喹诺酮类药物、四环素类药物、氯霉素药物、多粘菌素类药物及-内酰胺类的氨苄西林、羧苄西林、阿莫西林均高度敏感;对-内酰胺类的青霉素、苯唑西林，大环内脂类的红霉素，糖肽类的万古霉素，磺胺类的复方新诺明均耐受综上可知，该菌的耐药性低，临床治疗药物的选择种类较多453福建农林大学学报(自然科学版)第 52 卷26组织病理261临床症状患病马口鱼鱼体充血、出血，腹部膨胀，鳍条根部出血严重，肛门红肿，腹部及尾部坏死形成溃烂(图 3A);眼球出血、突出(图 3B);解剖腹腔内充满大量血腹水(图 3C);肝脏血管扩张淤血，肿大，呈土黄色;脾脏肿胀，淤血呈暗红色(图 4F)表 4菌株 ObB210709B1 的药物敏感性1)Table 4Drug sensitivity of strain ObB210709B1药物分类药物名称直径/mm敏感性-内酰胺类青霉素00氨苄西林190S羧苄西林390S苯唑西林00阿莫西林250S氨基糖苷类庆大霉素265S妥布霉素205S链霉素155S新霉素300S卡那霉素265S喹诺酮类氧氟沙星470S环丙沙星560S诺氟沙星510S依诺沙星500S恩诺沙星470S大环内酯类红霉素00四环素类四环素350S多西环素345S氯霉素类氟苯尼考380S糖肽类万古霉素00磺胺类复方新诺明00多粘菌素类多粘菌素 B165S1)S:高度敏感;I:中度敏感;:耐药A:鱼体状态;B:眼部;C:腹腔;D:肝脾部“”指病变位置图 3患病马口鱼剖检变化Fig3Necropsy changes of diseased Obidens262病理变化健康对照组的鳃、肝、脾、肾、肠、脑、心的组织切片见图 4a14a7自然发病组和病原菌回归感染 120 h 后组织病理学变化主要表现为鳃增生粘连，最后鳃丝崩解(图 4b1、图 4c1);肝细胞细胞核消失，空泡变性严重，灶性坏死，淋巴细胞、巨噬细胞浸润(图 4b2、图 4c2);脾淋巴细胞减少，灶性坏死，脾血窦淤血(图 4b3、图 4c3);肾小球血管内皮细胞肿胀，肾小囊内大量蛋白渗出染成红色，肾小球上皮细胞变性、坏死(图 4b4、图 4c4);肠道黏膜上皮坏死，脱落，固有膜内大量炎症细胞浸润，有大量细菌团块(图4b5、图 4c5);脑外膜脱落，出血、炎性细胞浸润(图 4b6、图 4c6);肌间隙增宽、水肿，心肌纤维变性、坏死，有细菌团块(图 4b7、图 4c7)感染组的组织病变情况要比自然发病组严重3讨论爱德华氏菌是水产养殖中较常见的条件致病菌，由其所引起的鱼类疾病，通常称为鱼类的爱德华氏菌病鱼类致病性爱德华氏菌共有 3 种，即迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、鮰爱德华氏菌和保科爱德华氏菌(Ehoshinae)，其中，前两种在鱼类病害中最常见12 鮰爱德华氏菌通常感染鲶形目的一些鱼类，例如，斑点叉尾鮰(Parasilirus asotus)13、黄颡鱼(yellow catfish)14、白鲶鱼(white catfish)15、蟾胡子鲶(walking catfish)16、鲑鳟(Oncorhynchus mykiss)17、云斑鮰(brown bullhead)18 等其中，Eictaluri 最易感染斑点叉尾鮰并形成斑点叉尾鮰肠型败血症，具有感染速度快、发病率和死亡率高等特点，对斑点叉尾鮰的养殖具有严重影响19 此外，Eictaluri 也可感染非鲶形目的一些鱼类，如蓝色弓背鱼(green knife fish)、斑马鱼(bengal danio)、日本鳗鲡(Japanese eel)2021 此外，Eictaluri 也可引起大鲵发病22 本试验从福建自然发病的马口鱼体内分离到 Eictaluri，并通过人工感染试验证实其是病原菌，Eictaluri 在自然状态下也能感染马口鱼致病，提示其感染宿主的范围进一步扩大，也为防控马口鱼养殖可能发生的疾病提供依据进化树分析表明，该菌与其他来源的鮰爱德华氏菌有一定的遗传距离，可能由于感染不同宿主，即使是同553第 3 期吴斌:马口鱼源鮰爱德华氏菌的分离鉴定及耐药性一种病原菌，在感染力、毒力上也会存在差异，这种差异造成菌株之间的遗传距离这种遗传距离的存在提示应该根据分离菌株的宿主、分离时间与区域等信息，继续进一步分析该菌种的种群进化关系，以揭示该菌种的分子流行病学特征a(对照组):a1:鳃;a2:肝;a3:脾;a4:肾;a5:肠;a6:脑;a7:心肌;b(自然发病组):b1:鳃增生粘连;b2:肝细胞空泡变性，灶性坏死;b3:脾淋巴细胞减少，灶性坏死，脾血窦淤血;b4:肾小球血管内皮细胞肿胀，肾小管内大量蛋白渗出;b5:肠道黏膜上皮坏死，脱落，固有膜内有大量细菌团块;b6:脑出血，白细胞浸润;b7:心肌纤维间隙增宽、水肿;c(回归感染组):c1:鳃丝崩解;c2:肝细胞细胞核消失，空泡变性严重，坏死，淋巴细胞、巨噬细胞浸润;c3:脾淋巴细胞减少，淤血;c4:肾小球血管内皮细胞肿胀、出血、坏死，肾小管上皮细胞破坏;c5:肠道黏膜上皮粘连，有大量细菌团块，固有膜内大量炎症细胞浸润;c6:脑外膜脱落，出血、炎性细胞浸润;c7:心肌纤维水肿、变性、坏死，肌间隙增宽，有细菌团块“”指病变位置图 4患病马口鱼组织病理损伤Fig4Histopathological lesions of diseased Obidens本试验发现鮰爱德华氏菌感染马口鱼的组织病理损伤主要表现为肝空泡坏死，脾出血、坏死，肾小球出血与肾小管破裂，多组织器官均有细菌团块的聚集，肠道尤为严重，与吴中明等22 的研究结果一致鮰爱德华氏菌可在马口鱼体内多组织、多器官定殖，引起病理损伤，甚至导致死亡，该菌对机体的损伤与炎症反应，尤其是肝、脾、肾和肠的病理损伤最为严重马口鱼在临床上出现明显的腹水与全身性出血等临床特653福建农林大学学报(自然科学版)第 52 卷征，肝、肾的结构损伤较严重，从而引起蛋白合成障碍、肾小球滤过性增强、肾小管重吸收能力降低等，导致血管内外液体交换及球管失衡，钠、水在体内潴留出现水肿23 养殖鱼暴发疾病后应尽快进行药敏试验，选择合适的敏感药物进行治疗此次分离的 Eictaluri 对恩诺沙星、氟苯尼考等高度敏感，耐药程度较低该菌株是第 1 次从养殖发病的马口鱼分离获得，且该养殖场养殖的马口鱼亲鱼均来源于野生捕捞并由养殖场人工繁育子一代或子二代，因此，推测该病原菌株的耐药性较低，可能是因为菌株还未受到疾病治疗过程中相关药物的影响，仍未形成广泛耐药性药敏试验结果与国内外相关研究结果2427 基本一致，为临床治疗中提供可参考使用药物Eictaluri 对磺胺类药物复方新诺明表现强耐药，提示需科学合理使用抗生素药物，避免单一、超剂量和长期用药而导致耐药性此外，中草药是一种天然环保的药物，具有安全、有效、残留少、价格低廉等优点，已有研究表明，连翘、大黄、蒲公英、金银花、黄柏等中草药制剂对 Eictaluri 均有抑菌作用，抑菌圈平均直径大于 20 mm28，也为鮰爱德华氏菌病的防治提供了一种途径参考文献 1ZHANG M Z，WANG S D，GAN L，et al Effects of fishmeal replacement with eight protein sources on growth performance，blood biochemistry and stress resistance in Opsariichthys bidens J Aquaculture Nutrition，2021，27(6):112 2杜光辉马口鱼生物学特性及人工繁育技术 J 黑龙江水产，2021，40(5):5052 3钟全福，樊海平，叶小军马口鱼的研究现状及开发利用进展 J 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