黑桫椤多器官全长转录组分析及类黄酮生物合成结构基因的挖掘.pdf

DOI：10.11913/PSJ.2095-0837.23069林泓，王桢，王艇，苏应娟.黑桫椤多器官全长转录组分析及类黄酮生物合成结构基因的挖掘J.植物科学学报，2024，42（1）：5665Lin H，Wang Z，Wang T，Su YJ.Analysis of multi-organ full-length transcriptome and structural genes involved in flavonoid biosynthe-sis of Gymnosphaera podophylla Dalla Torre&Sarnth.J.Plant Science Journal，2024，42（1）：5665黑桫椤多器官全长转录组分析及类黄酮生物合成结构基因的挖掘林 泓1#，王 桢1#，王 艇2*，苏应娟1,3*（1.中山大学生命科学学院，广州 510275；2.华南农业大学生命科学学院，广州 510642；3.中山大学深圳研究院，广东深圳 518057）摘要：黑桫椤（Gymnosphaera podophylla Dalla Torre&Sarnth.）为著名的孑遗蕨类，具有很强的环境适应能力，然而其适应性机制尚不清楚。本研究采用 PacBio 和 Illumina 技术对黑桫椤的根、羽轴和羽片进行转录组测序，分别生成 12 879、14 185 和 16 084 个全长 unigenes。基因表达分析结果表明，与黑桫椤抗干旱、缺水胁迫和生物胁迫相关的基因表达水平较高。根、羽轴和羽片特异性上调基因均显著富集到 KEGG 代谢通路中的“苯丙烷生物合成途径”，根和羽轴的器官特异性上调基因还显著富集到“类黄酮生物合成途径”。共有 192 个全长 unigenes 被注释为类黄酮生物合成途径所涉及的 13 个酶结构基因，其中包括 112 个差异表达基因（DEGs），表明黑桫椤类黄酮生物合成途径较为保守，且存在器官特异性差异表达基因。本文对黑桫椤多器官全长转录组和类黄酮生物合成途径结构基因进行了综合分析，为进一步研究其对环境的适应性提供了丰富的遗传资源。关键词：黑桫椤；类黄酮生物合成；全长转录组中图分类号：Q943.2文献标识码：A文章编号：2095-0837（2024）01-0056-10Analysis of multi-organ full-length transcriptome and structural genesinvolved in flavonoid biosynthesis of Gymnosphaera podophylla DallaTorre&Sarnth.Lin Hong1#，Wang Zhen1#，Wang Ting2*，Su Yingjuan1,3*（1.School of Life Sciences,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510275,China；2.College of Life Sciences,South China AgriculturalUniversity,Guangzhou 510642,China；3.Research Institute of Sun Yat-Sen University in Shenzhen,Shenzhen,Guangdong 518057,China）Abstract：Gymnosphaera podophylla Dalla Torre&Sarnth.is a famous relict tree fern with strong environ-mental adaptability.However,the mechanisms underlying its adaptability remain unclear.In this study,thePacBio and Illumina platforms were used to sequence the root,rachis,and pinna transcriptomes of G.podophylla,resulting in the generation of 12879,14185,and 16084 full-length unigenes,respectively.Tran-script quantification showed that these unigenes were related to drought resistance and biological stress andwere highly expressed.KEGG enrichment analysis indicated that the up-regulated genes in the roots,rachis,and pinna were enriched in the phenylpropane biosynthesis pathway,while the up-regulated genes in the 收稿日期：2023-06-12，接受日期：2023-08-20。基金项目：国家自然科学基金项目（31872670，32071781）；广东省基础与应用基础研究基金项目（2021A1515010911）。作者简介：林泓（2000），男，硕士研究生，研究方向为植物分子系统发育（E-mail：）；王桢（1997），男，硕士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学（E-mail：）。#共同第一作者。*通信作者（Authors for correspondence.E-mail：；）。植物科学学报2024，42（1）：5665Plant Science Journalhttp:/roots and rachis were enriched in the flavonoid biosynthetic pathway.A total of 192 full-length unigenes wereannotated as structural genes involving 13 enzymes in the flavonoid biosynthesis pathway,including 112 dif-ferentially expressed genes(DEGs),suggesting that the flavonoid biosynthesis pathway was conserved in G.podophylla,with organ-specific DEGs.This research is the first to perform a comprehensive analysis of the full-length transcriptome across multiple organs in G.podophylla and to investigate the structural genes of theflavonoid biosynthetic pathway.This study provides an abundance of genetic resources for further examina-tion of environmental adaptation in this species.Key words：Gymnosphaera podophylla；Flavonoid biosynthesis；Full-length transcriptome 黑 桫 椤（Gymnosphaera podophylla DallaTorre&Sarnth.）隶属于桫椤科黑桫椤属，为大型草本蕨类植物1,2。该植物高 13 m，叶柄、叶轴和羽轴均具棕色鳞片，为国家二级保护植物。作为第四纪冰川孑遗植物，黑桫椤主要生长在低纬度温暖、潮湿和阴凉的栖息地。尽管面临全球气候变暖所引发的高温、干旱和缺水胁迫等问题，黑桫椤群落仍能呈稳定的低增长趋势3。研究发现，生长在环境较差的山坡上的黑桫椤，其叶片总黄酮浓度高于生长在沟底的黑桫椤，且叶片中的总黄酮量高于其复叶柄4。类黄酮化合物是植物总黄酮的主要成分，是以 2-苯基色原酮为骨架衍生的一类化合物的总称5，属植物次生代谢产物。这类化合物在植物遭受胁迫时大量积累，在清除自由基、提高植物对逆境胁迫的耐性和抗性等过程中发挥重要作用6。因此，类黄酮化合物的积累可能是黑桫椤应对胁迫的一种策略。蕨类植物中的类黄酮化合物主要有查尔酮、黄酮以及黄酮醇7。目前已在 Cyathea delgadiiSternb.的细胞悬浮液中检测出丰富的类黄酮化合物8，桫椤（Alsophila spinulosa(Wall.ex Hook.)R.M.Tryon）根、羽轴和羽片的器官特异性上调基因均富集到“类黄酮生物合成”KEGG 途径9。同时，基于转录组和代谢组学分析，蕨类植物金星蕨科和水龙骨科的类黄酮生物合成途径已被阐述10,11。然而，目前还缺乏对桫椤科植物类黄酮生物合成途径的转录组学分析。本研究以黑桫椤为研究对象，采用 PacBio 三代测序技术，分别对根、羽轴和羽片 3 种器官进行测序。同时，利用 Illumina 测序进行校准，以获得高质量的全长转录组数据。本文重点挖掘黑桫椤的类黄酮生物合成基因，旨在为进一步阐明其合成途径奠定基础，也为深入了解树蕨类植物的适应性提供分子资源。1材料与方法 1.1实验材料黑桫椤的根、羽轴和羽片的新鲜样本于 2019年 5 月 1 日取自海南昌江县霸王岭（海拔 884 m，19434N，109846E），将样品洗涤干燥后立即 浸入 RNA 保 护 液 中，20 保 存。使 用RNeasy Plus Mini 试剂盒（QIAGEN，Hilden，德国）提取总 RNA，分别利用琼脂糖凝胶电泳、Nanodrop、Qubit2.0、Agilent 2100 来分析 RNA降解程度和纯度、检测 OD260/OD280比值、定量RNA 浓度及检测 RNA 完整性。1.2实验方法 1.2.1二代测序（Illumina）和转录本拼接采用 Oligo dT 磁珠富集 mRNA，利用 NEB-Next Ultra RNA Library Prep Kit 制备 NGS 文库，在 NovaSeq 6000 平台进行双端测序。使用 Trim-momatic v0.3912软件过滤数据，去除包括含接头的 reads、N10%以及低质量 reads 的原始读数。过滤后的数据用 Trinity v2.4.013软件拼接转录本，min_kmer_cov 设置为 2。组装后的序列采用 Corset v1.0514软件聚类，获得 unigenes。1.2.2三代测序（Iso-Seq）和下机数据处理采用 SMARTer PCR cDNA 合 成 试 剂 盒 将mRNA 逆转录成 cDNA，并进行 PCR 扩增。利用BluePippin Size Selection System 富集4 kb 的cDNA，不筛选片段和4 kb 片段按 11 等摩尔混合，构建 SMRT bell 文库，在 Sequel SystemSMRT Cell 平台上测序。下机数据用 SMRT Linkv6.0 软件处理并 polish，获得高质量的 polish con-sensus 序列。再利用 LoRDEC v0.715软件和二代测序的 clean reads 对 polish consensus 进行校正，第 1 期林 泓等：黑桫椤多器官全长转录组分析及类黄酮生物合成结构基因的挖掘57通过 CD-HIT v4.6.816软件去冗余，获得非冗余全长转录本。合并 3 种器官的全长 unigenes（FLunigenes），同样采用 CD-HIT 去冗余，获得 3 种器官全长转录组的参考序列（ref）。1.2.3基因功能与基因结构注释为获得全面的基因功能信息，使用 BLASTv2.7.1+17软件对 FL unigenes 进行 NT 数据库注释；使用 Diamond v0.8.3618软件进行 NR、KOG、Swiss-Prot、KEGG 数据库的注释；使用 HMMERv3.119软件进行 Pfam 数据库注释；使用 pfam2go进行 GO 数据库注释。分别使用 ANGEL v2.420和 MISA v1.021软件预测编码序列（CDS）和简单序列重复（SSR）。植物转录因子则由 iTAK v1.722软件预测。采用默认 参 数，分 别 通 过 CNCI v223、CPC v0.924、PfamScan v0.925和 PLEK v1.226等 4 种软件预测 LncRNA。交集且长度200 bp 的被认为是预测准确的 LncRNA。1.2.4基因表达定量与差异表达基因分析使用 Bowtie2 v2.3.427软件将二代转录本与参考序列（ref）比对，再用 RSEM v1.3.028软件定量分析转录本，通过 DEGseq v1.12.029软件获得差异表达基因（Differentially expressed genes，DEGs）。以非冗余 FL unigenes 的 GO 与 KEGG注释为背景文件，使用 TBtools v1.09876130软件的 KEGG enrichment analysis 和 GO enrichment功能对器官特异性上调基因进行 GO 和 KEGG 富集分析，P 0.05 的GO term 或KEGG 通路被选用。1.2.5类黄酮生物合成通路分析基于 KEGG 注释中的类黄酮生物合成通路（ko00941）基因，结合 Swiss-Prot 数据库的注释结果，确定与类黄酮生物合成途径相关的结构基因。排除在 3 种器官中均不表达的基因（FPKM1 且 q value10），标红字体表示未发现 FNS和 F3H 的 FL unigenes，虚线箭头表示由多个酶参与的多步反应。Heatmap showing DEG expression profiles of flavonoid biosynthesis pathway in three organs.Highlighted gene contains multiple unigenes(10)in G.podophylla.Red font indicates F3H and FNS genes were not found in transcriptome.Dotted arrows indicate multi-step reactionwith multiple enzymes.图 2类黄酮生物合成通路Fig.2Flavonoid biosynthesis pathway第 1 期林 泓等：黑桫椤多器官全长转录组分析及类黄酮生物合成结构基因的挖掘61抗逆相关的基因，为进一步研究黑桫椤的适应性进化机制提供了参考。黑桫椤根部的上调表达基因最多，其次是羽片，羽轴的上调表达基因数量最少。树蕨根部更易受生物和非生物胁迫，导致其具有更多特异性上调表达的基因9。黑桫椤根部的上调基因显著富集到与植物激素信号转导、转录因子等与环境适应相关的 KEGG 途径，特别是富集到 MAPK 信号通路。该通路能与乙烯、生长素、茉莉酸、脱落酸等多种信号途径相互作用，调控下游特定转录因子，并与植物生长发育和逆境应答密切相关38。树蕨类植物是仅存的具有木质茎的孑遗蕨类，茎干的次生壁部分沉积大量木质素的管胞39。黑桫椤羽轴的上调表达基因显著富集到苯丙烷生物合成途径，这可能与羽轴木质素生物合成十分活跃有关。羽片的上调表达基因主要富集到与光合代谢相关的 KEGG 途径和 GO 术语，与其参与光合代谢的功能相一致。3.2黑桫椤类黄酮生物合成通路中的基因成员和DEGs由 PAL、C4H 和 4CL 催化生成对香豆酸辅酶A 的途径被称为公共苯丙烷途径（General phenyl-propanoid pathway）5。该途径为下游类黄酮生物合成分支提供前体。目前发现，桫椤中存在 21 个AspiPAL 成员、10 个AspiC4H 成员和48 个Aspi4CL成员39，而在黑桫椤转录组中对应地分别有 11、37 和 33 个 FL unigenes。鉴于苯丙烷代谢具有多个分支途径，多个 unigenes 成员的存在可能与黑桫椤调控这些分支途径有关。PAL 引导莽草酸途径产物到苯丙烷生物合成途径及其分支途径，控制着初级代谢物向次级代谢物的转化，是苯丙烷途径的第一个限速酶40。C4H 的蛋白质活性和转录丰度能直接影响苯丙烷生物合成途径中的多个分支途径5。GpC4H-14 在黑桫椤羽轴中上调表达，是所有 C4H unigenes 成员中表达量最高的，也是整个类黄酮通路中表达水平最高的，可能是黑桫椤羽轴类黄酮生物合成和木质素生物合成中的关键调控基因。CHS 是类黄酮途径中的第一个限速酶41，黑桫椤中有 37 位成员。CHS 的总 FPKM 值在羽轴最高（5 207.72），其次是根（4 116.66）和羽片（2 450.44），说明由 CHS 控制的苯丙烷分支转向类黄酮分支非常活跃，特别是在羽轴和根部。和桫椤一样39，PAL、C4H、4CL、CHS 等基因家族可能在黑桫椤基因组中发生了基因重复。但本研究分析的是转录组数据，因此这种结果也可能是由可变剪切等原因所造成的。CHS 催化生成各类查尔酮，在环境胁迫与生物胁迫下被普遍诱导42。以咖啡酰辅酶 A 和阿魏酰辅酶 A 为偏好底物的CHS 被紫外线和病原体诱导，生成多羟基和甲氧基取代的查尔酮，以响应胁迫43-45。CCoAOMT 的DEGs 主要在黑桫椤羽片中上调表达，可能有助于 O-甲基化查尔酮的生成。CHI 催化查尔酮生成黄烷酮46，并在 F3H、F3H、F35H 等酶的催化下生成二氢黄酮醇。本研究中没有发现 F3H 基因，但发现了柚皮素-3-羟化酶/黄酮醇合成酶（Naringenin 3-dioxygenase/Flavonol synthase，FLS）基因。F3H、FLS 均为2OGD 超家族（2-Oxoglutarate-dependent dioxy-genase family）DOXC 类成员。研究表明，FLS由 F3H 进化而来，具有补充 F3H 功能的作用47,48。二氢黄酮醇可在 FLS 催化下生成黄酮醇，或在 DFR 催化下生成无色花青素49，无色花青素在LDOX 催化下生成有色花青素。光是影响花青素积累的重要环境因素之一，黑桫椤虽然分布在低纬度地区，但生长在温暖、湿润、阴蔽的环境，光照受到影响，可导致有色花青素的含量下降。本研究鉴定出 13 个 DFR 成员和 1 个 LDOX 成员，GpLDOX（HQ_AP3_Rachis_10 323/f2p0/1520）在羽片中的 FPKM 值仅为 3.41，转录丰度和表达水平都不高。陈雪菲等50检测到小黑桫椤（Gym-nosphaera metteniana（Hance）Tagawa）植 物叶片中有色花青素含量为 49.1 mg/kg，总黄酮为48.93 mg/g，原花青素含量为 38.42 mg/g。据此推测，黑桫椤中由 DFR 催化生成的无色花青素可能参与了原花青素的形成；其类黄酮种类主要是查尔酮和黄酮醇。在干旱条件下，花青素会抑制气孔关闭，降低植物的抗旱能力，而黄酮醇则能通过清除过量 ROS、增强对渗透胁迫的耐受性、调节气孔关闭、降低失水率等方式提高植物的抗旱能力51。此外，黄酮醇还在调节和转运生长素、抵抗真菌等病原体中发挥重要作用49,52。F3H、F35H 在黑桫椤羽片中上调表达，可能有利于槲皮素、杨梅素等黄酮醇的积累，这些类黄酮化合物在黑桫椤适应环境过程中发挥着重要作用。62植 物 科 学 学 报第 42 卷 4结论本研究通过 PacBio 和 Illumina 测序技术，分析了黑桫椤根、羽轴和羽片的全长转录组，从中分别鉴定出 12 879、14 185、16 084 个 FL uni-genes，并对其进行了功能注释。定量表达分析表明，黑桫椤各器官中的高表达基因与胁迫抵御相关。此外，本文还构建了黑桫椤的类黄酮生物合成通路，并阐述了该通路结构基因的表达情况。这些结果为进一步研究黑桫椤的适应性进化机制提供了分子资源，也为树蕨类植物的其他研究提供了全长转录组遗传资源。致谢致谢：感谢中山大学生命科学学院洪永峰、何梓卿在材料采集中提供的帮助！参考文献：苏应娟，王艇，郑博，江宇，欧阳蒲月，等.根据cpDNA trnL-F非编码区序列变异分析黑桫椤海南和广东种群的遗传结构与系统地理J.生态学报，2004，24（5）：914919.Su YJ，Wang T，Zheng B，Jiang Y，Ouyang PY，et al.Genetic structure and phylogeography of populations ofAlsophila podophylla in Hainan and Guangdong，southernChina，based on cpDNA trnL-F noncoding sequencesJ.Acta Ecologica Sinica，2004，24（5）：914919.1 Ppg I.A community-derived classification for 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