BCOR突变通过PI3K_Akt_mTOR通路介导MDS细胞生物学行为改变的机制研究 (1).pdf

基金项目:上海市自然科学基金资助项目(22ZR1447700)作者单位:200233上海交通大学医学院附属上海市第六人民医院血液科通信作者:吴凌云,电子信箱:lincy2032 BCOR 突变通过 PI3K/Akt/mTOR 通路介导MDS 细胞生物学行为改变的机制研究陈佳楠金嘉诚徐凡环郭娟刘宏陶英常春康李晓吴凌云摘要目的探讨 BCOR(BCL6 co-repressor)基因突变介导骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes,MDS)细胞生物学行为的分子机制。方法通过构建 BCORP483L过表达慢病毒以及空载体病毒,转染 K562 细胞,采用集落形成实验检测BCOR 突变对细胞克隆形成能力的影响,流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期,Western blot 法和实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)方法检测细胞焦亡和 PI3K/Akt/mTOR 通路分子水平,采用转录组测序技术(RNA-sequencing,RNA-Seq)检测分析 BCORP483L突变对下游靶基因表达的影响。结果BCORP483L突变显著地抑制细胞克隆形成能力,促进细胞凋亡,并导致细胞周期阻滞和细胞焦亡水平增加。RNA-Seq 分析发现,BCORP483L突变后 K562 内与细胞凋亡、G2M 周期检查点、慢性髓系白血病、细胞衰老、细胞内炎性反应相关的基因以及原癌基因 MYC 目标基因表达上调。Western blot 法实验进一步证实,BCORP483L突变细胞的 PI3K/Akt/mTOR 通路明显受到抑制。结论BCOR 突变导致细胞 PI3K/Akt/mTOR 通路受到抑制,进而导致细胞凋亡增加、增殖受抑。BCOR 突变能通过上调细胞衰老相关基因以及原癌基因 MYC 目标基因表达,提高细胞内炎性反应水平,从而促进 MDS 疾病进展。关键词BCOR 突变骨髓增生异常综合征细胞凋亡细胞焦亡中图分类号R733文献标识码ADOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2024.04.014BCOR Mutation Induces the Change of Cell Biological Behaviors in Myelodysplastic Syndromes via PI3K/Akt/mTOR Pathway.CHEN Ji-anan,JIN Jiacheng,XU Fanhuan,et al.Department of Hematology,Shanghai Sixth Peoples Hospital Affiliated to Shanghai Jiao TongUniversity School of Medicine,Shanghai 200233,ChinaAbstractObjectiveTo explore the molecular mechanism of BCL6 co-repressor(BCOR)gene mutation in mediating the cell bi-ological behaviors of myelodysplastic syndromes(MDS).MethodsK562 cells were transfected with BCORP483Lexpression lentivirus andempty vector virus,respectively.Colony formation test was used to detect the effect of BCORP483Lmutation on the clonogenic formation a-bility of cells.The cell apoptosis and cell cycle were analyzed by flow cytometry.Western blot and real-time quantitative polymerasechain reaction(RT-qPCR)were used to detect the levels of pyroptosis and PI3K/Akt/mTOR pathway.And RNA-Sequencing(RNA-Seq)was used to detect the effect of BCORP483Lmutation on the expressions of downstream target genes.ResultsBCORP483Lmutation sig-nificantly inhibited the colony formation ability of cells,promoted cell apoptosis,blocked the cell cycle,and increased pyroptosis.RNA-Seq analysis showed that the genes related to cell apoptosis,G2M cycle checkpoint,chronic myeloid leukemia,cell senescence,intracel-lular inflammatory response,and the target genes of oncogene MYC were up-regulated in the K562 cells after BCORP483Lmutation.West-ern blot experiment further confirmed that BCORP483Lmutation significantly inhibited the PI3K/Akt/mTOR pathway in the K562 cells.ConclusionBCORP483Lmutation promotes cell apoptosis and inhibits cell proliferation via the inhibition of PI3K/Akt/mTOR pathway.And BCORP483Lmutation can up-regulate the cell-senescence-related genes,oncogene MYC target genes,and increases the level ofthe intracellular inflammatory response,thus promoting the development of MDS.Key wordsBCOR mutation;Myelodysplastic syndrome;Cell apoptosis;Cell pyroptosis骨 髓 增 生 异 常 综 合 征(myelodysplastic syn-dromes,MDS)是一组起源于造血干/祖细胞的恶性克隆性疾病,其典型特征为骨髓造血细胞发育异常,向急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)转化的风险较高1,到目前为止 MDS 发病机制尚未完全阐明。随着二代测序技术的广泛开展,发现80%90%MDS 患者存在基因突变。笔者和其他多个中心的前期研究均发现 MDS 和 AML 中存在 BCOR(BCL696医学研究杂志 2024 年 4 月第 53 卷第 4 期论著co-repressor)突变2 5。BCOR 编码的转录调节因子是 BCL6 的相互作用辅阻遏子,也是非典型多梳抑制 复 合 物 1.1(polycomb repressive complex 1.1,PRC1.1)的一个重要组成部分,参与组蛋白 H2A 第119 位赖氨酸单泛素修饰(H2AK119ub1),从而调节基因转录,发挥多种细胞功能6 8。研究证实,BCOR 突变促进血液系统肿瘤转化及疾病进展,具有预测预后价值9 11。笔者前期临床研究发现,在核型正常的 MDS 患者中,BCOR 突变频率为 8.7%,明显高于核型异常的 MDS 患者(4.2%,P=0.04)。且进一步的分析发现,相对无突变的患者,携带 BCOR 突变的 MDS 患者的原始骨髓细胞比例较高,且存在更高的白血病转化风险2。然而,BCOR 突变促进 MDS 进展的具体分子机制尚未阐明。笔者前期在 MDS 患者中发现了 BCOR 基因 4 号外显子的 p.P483L 热点突变2。因此本研究通过体外构建 BCORP483L突变细胞以及多种实验方法进一步研究 BCORP483L突变对 MDS 细胞生物学功能影响,探索可能的分子机制。材料与方法1.实验细胞培养及病毒转染:K562 细胞于 含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗溶液的 IM-DM 培养基中培养,并置于 37、5%CO2、100%湿度培养箱中培养。根据 BCOR 序列(基因库编号:NM_001123385)设计靶序列,合成 P483L-突变-BCOR序列,构建重组慢病毒载体(由上海吉凯基因医学科技股份有限公司构建)。将对数生长期的细胞随机分为两组,即 BCORP483L突变组和阴性对照组,分别加入 BCORP483L突变病毒和对照空载体慢病毒。病毒转染 72h 后用嘌呤霉素进行筛选,分别获得 BCORP483L突变组细胞和阴性对照组细胞,将未转染的 K562 细胞作为空白对照组。2.实验试剂:MethoCult 甲基纤维素半固体培养基购自加拿大干细胞技术有限公司。Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒、细胞周期和凋亡分析试剂盒、RIPA 裂解缓冲液、BCA 蛋白质分析试剂盒以及 ECL化学发光试剂盒均购自上海碧云天生物技术股份有限公司。BCOR 抗体,NLRP3 抗体,PI3K 抗体,Akt 抗体,p-Akt 抗体,P-mTOR 抗体,mTOR 抗体均购自美国 ABCAM 公司,GAPDH 抗体购自美国 Affinity 抗体公司,IL-18 抗体,IL-1 抗体购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。抗鼠二抗以及引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司,抗兔二抗购自美国CST 公司。预制凝胶购自上海天能生命科学有限公司。RT-qPCR 相关试剂购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。BigDye Terminator 购自美国 AppliedBiosystems 公司。EDTA 购自国药集团化学试剂有限公司。3.Sanger 测序:下载目的位点序列,合成 P483L-突变-BCOR 序列,设计特异性位点扩增引物,进行位点扩增。PCR 产物经 2%琼脂糖凝胶电泳,割取大小对等的目的条带,纯化回收。构建 Sanger 测序反应体系:总体系 5l,测序引物 1l,纯化后 PCR 产物3l,BigDye Mix kit 1l。使用以下反应程序:9460s,进行 28 个循环:95 20s,50 10s,60 4min,最后 4 30min。产物经纯化后使用 3730 xl 测序仪进行测序,并用 DNA Sequencing analysis 软件分析测序结果。4.集落形成实验:分别取对数生长期的 3 组细胞,使用含 2%FBS 的 IMDM 将细胞稀释到 5000 细胞/毫升的浓度,使每个 35mm 培养皿中的接种细胞数为 500 个。将 0.4ml 细胞悬液加入预分装了 4mlMethoCultTM培养基的试管中,充分混合后将 1.1ml 含有细 胞 的 MethoCultTM培 养 基 混 合 物 分 装 到 3 个35mm 培养皿中。轻轻倾斜、旋转培养皿,使培养基均匀分布在培养皿中。将培养皿放入外培养皿中,并在其中加入约 3ml 无菌水。14 16 天后进行集落计数。5.细胞凋亡检测:Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。取空白对照组、阴性对照组以及突变组细胞,1200r/min 离心(离心半径:15cm),加入5l 膜联蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)和 10l 碘化丙啶(PI)染色液,轻轻混匀。室温避光孵育 10 20min 后采用流式细胞仪检测。实验重复 3 次。6.细胞周期检测:用细胞周期和凋亡分析试剂盒分析细胞周期分布。取空白对照组、阴性对照组以及突变组细胞,1000 g 离心 5min,用冰冷的 PBS 清洗后离心,去上清。在细胞内加入 70%的乙醇,在 4冰箱内固定至少 12h,用含有 RNase A 和 PI 的染色溶液重新悬浮,37 避光孵育 30min 后使用流式细胞仪检测分析。使用 ModFit 版本 4.0.5 计算处于不同细胞周期的细胞比例。实验重复 3 次。7.转录组测序技术:由上海美吉生物医药科技有限公司完成。收集 BCORP483L突变细胞和阴性对照细胞,提取总 RNA。使用 TruSeq-TMRNA 样品制备试剂盒 制 备 RNA-Seq 转 录 组 文 库。使 用 Illumina07论著J Med Res,April 2024,Vol.53 No.4HiSeq X ten/NovaSeq 6000 测序仪对双端 RNA-Seq测序文库进行测序。根据每百万阅读转录本方法计算每个转录本的表达水平,以识别两组之间的差异。此外,还对差异表达基因进行针对 KEGG(Kyoto En-cyclopedia of Genes and Genomes)通路和 GO(GeneOntology)的功能富集分析。8.Western blot 法:用 RIPA 裂解缓冲液裂解细胞样品 30min,使用 BCA 蛋白质分析试剂盒测定蛋白质浓度。样品在 95 下变性 10min 后,使用 BiofurawTM预制凝胶分离 30g 蛋白质样品。使用 eBlotTML1 转膜机将蛋白质样品转移到 PVDF 膜上。将膜置于一抗内在 4 摇床上孵育过夜,再加入二抗于常温孵育1h,最后用 ECL 化学发光试剂显示蛋白条带。9.RT-qPCR 检测:提取细胞的总 RNA,反转录合 成 cDNA。在 QuantStudio7 Flex 上 进 行 RT-qPCR。每孔(20l 反应体积)包含 2l cDNA 模板、2 ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10l、0.8l 引物和 9.2l ddH2O。使用以下热循环程序:95 30s,进行 40 个循环:95 10s,60 30s,最终延伸 95 15s,60 60s,95 15s。引物序列如表 1 所示。选择 GAPDH 为内参,用 2-Ct法检测基因的相对表达水平。实验重复 3 次。表 1引物序列基因名引物序列(53)NLRP3上游引物:GATCTTCGCTGCGATCAACAG下游引物:CGTGCATTATCTGAACCCCACGSDMD上游引物:GTGTGTCAACCTGTCTATCAAGG下游引物:CATGGCATCGTAGAAGTGGAAGCASPASE 1上游引物:TTTCCGCAAGGTTCGATTTTCA下游引物:GGCATCTGCGCTCTACCATCCASPASE 4上游引物:CAAGAGAAGCAACGTATGGCA下游引物:AGGCAGATGGTCAAACTCTGTAGAPDH上游引物:TGTGTCCGTCGTGGATCTGA下游引物:CCTGCTTCACCACCTTCTTGA 10.统计学方法:应用 SPSS 26.0 统计学软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数 标准差(x s)表示,两组样本均值比较采用 t 检验,3 组及以上样本均值比较采用单因素方差分析(ANOVA)来衡量差异的显著性,以 P 0.05 为差异有统计学意义。结果1.检测慢病毒转染后 K562 3 组细胞内 BCOR 蛋白表达和 BCORP483L突变:Western blot 法检测结果显示,突变组内 BCOR 蛋白表达较阴性对照组和空白对照组明显增高(图 1A)。Sanger 测序确认突变组内携带 BCORP483L突变(图 1B)。图 1检测慢病毒转染后 K562 3 组细胞内 BCOR 蛋白表达和 BCORP483L突变A.Western blot 法检测 3 组内 BCOR 蛋白表达水平;B.Sanger 测序确认突变组内存在 BCORP483L突变2.BCORP483L突变对细胞克隆形成能力的影响:集落形成实验结果显示,14 16 天后,BCORP483L突变组的集落数明显少于阴性对照组和空白对照组(P=0.0019),表明 BCORP483L突变可抑制 K562 细胞的克隆形成能力(图 2)。3.BCORP483L突变对细胞凋亡的影响:凋亡实验结果 显 示,与 阴 性 对 照 组 和 空 白 对 照 组 比 较,BCORP483L突变组早期凋亡细胞数上升(P=0.0285),晚期 凋 亡 细 胞 数 明 显 上 升(P=0.0008)。表 明BCORP483L突变能促进 K562 细胞凋亡(图 3)。4.BCORP483L突变对细胞周期的影响:周期实验结果 显 示,与 阴 性 对 照 组 和 空 白 对 照 组 比 较,BCORP483L突 变 组 G0/G1期 细 胞 数 明 显 增 加(P 0.0001),S 期和 G2期细胞数明显下降(P 分别为 2,且 P 0.05。对这些基因进行基因集富集分析,选择 C2:KEGG pathways 和 C5:GO 进行分析。显著富 集 的 GO 包 括 细 胞 凋 亡(MAP04210),NES=-1.11,nominal P=0.114;细胞周期(MAP04110),NES=1.41,nominal P=0;细胞衰老(MAP04218),NES=1.17,P=0.029,慢性髓系白血病(MAP05220),NES=1.288,nominal P=0.02(图 6A)。显著富集的 KEGG通路包括 HALLMARK_细胞凋亡,NES=-1.36,P=0.0065;HALLMARK_G2M 检查点,NES=1.82,P=0;HALLMARK_ 炎 性 反 应,NES=-1.22,P=0.05;HALLMARK_ MYC 目 标 基 因,NES=2.069,P=0;HALLMARK_NF-B/TNFA 信 号,NES=-1.508,P=0(图 6B)。数据分析显示,BCORP483L突变 K562细胞内与慢性髓系白血病、细胞衰老、细胞内炎性反应相关的基因以及原癌基因 MYC 目标基因上调。27论著J Med Res,April 2024,Vol.53 No.4图 5BCORP483L突变对细胞焦亡的影响A.Western blot 法检测 NLRP3、IL-1、IL-18 蛋白表达;B.RT-qPCR 实验检测 NLRP3、GSDMD、CASPASE1、CASPASE4 的 mRNA 表达图 6RNA 测序分析 BCORP483L突变 K562 细胞基因表达变化A.显著富集的 GO 通路;B.显著富集的 KEGG 通路7.Western blot 法检测 3 组 PI3K、p-Akt、Akt、mTOR、p-mTOR 蛋白的表达:与阴性对照细胞和空白对照细胞比较,BCORP483L突变组内 PI3K、p-Akt、Akt、mTOR、p-mTOR 蛋白表达均明显下降(图 7)。讨论MDS 是一组以病态造血、无效造血为特征的恶性克隆性造血干/祖细胞疾病,克隆性增殖与细胞过度凋亡、焦亡异常共存。MDS 肿瘤细胞新陈代谢往往丧失正常调控状态12,13。PI3K/Akt/mTOR 通路能通过多种机制参与调节细胞代谢14,15。研究显示在多种人类恶性肿瘤中存在 PI3K/Akt/mTOR 信号通路上调,其可能机制是癌基因激活突变、癌基因扩增、受体酪氨酸激酶上游激活或抑癌基因失活等16 19。PI3K/Akt/mTOR 通路是调控造血细胞增殖、发育的重要通路,与细胞增殖、分化、生存、细胞周期、自噬等密切相关。该通路在高危 MDS 患者和 60%的 AML图 7Western blot 法检测 3 组 PI3K、p-Akt、Akt、mTOR、p-mTOR 蛋白的表达与阴性对照组以及空白对照组比较,BCORP483L突变明显抑制 K562细胞内 PI3K 表达和 Akt、mTOR 蛋白及其磷酸化水平37医学研究杂志 2024 年 4 月第 53 卷第 4 期论著患者 中 被 结 构 性 激 活,且 与 疾 病 预 后 不 良 相关17,18,20。本 研 究 发 现 BCORP483L突 变 明 显 抑 制K562 细胞系克隆形成能力,促进细胞凋亡和周期阻滞。进一步通过 RNA-Seq 研究以及 Western blot 法检测发现,BCORP483L突变抑制 PI3K/Akt/mTOR 通路的表达,促进促凋亡基因和 G2M 检查点相关基因的转录,导致增殖抑制和凋亡增加,G1到 S 期周期阻滞。RNA-Seq 结果显示,BCORP483L突变导致白血病、细胞衰老、细胞内炎性反应相关基因、原癌基因MYC 目标基因以及 NF-B/TNFA 信号在 K562 细胞内富集。通过 Western blot 法和 RT-qPCR 实验证实 BCORP483L突变细胞内焦亡水平上升,细胞微环境中促炎性细胞因子如 IL-18、IL-1、TNF-释放增加。目前的研究已经证实,慢性炎症通过促进细胞突变、克隆演变、破坏免疫监视等作用促进多种癌症的发生21。由炎症和先天免疫失调引起的慢性非感染性炎症是 MDS 发病机制之一。NLRP3 炎性小体激活是 MDS 关键驱动因素之一,与 MDS 无效造血有关。也有研究者提出,炎症通路的激活,如干扰素相关信号,可能是导致 MDS 髓系发育不良形成的潜在机制。因此 BCOR 突变通过促进炎性反应等方式,促进 MDS 疾病进展,导致预后不良。综上 所 述,BCORP483L突 变 通 过 下 调 PI3K/Akt/mTOR 通路直接促进细胞凋亡和周期阻滞,降低细胞克隆形成能力,但是能通过上调白血病、细胞衰老相关以及原癌基因 MYC 目标基因,提高细胞内炎性反应,从而促进 MDS 的发展,造成不良预后。利益冲突声明:所有作者均声明不存在利益冲突。参考文献1 Cazzola M.Myelodysplastic syndromes J.N Engl J Med,2020,383(14):1358-13742 Li X,Xu F,Zhang Z,et al.Dynamics of epigenetic regulator geneBCOR mutation and response predictive value for hypomethylating a-gents in patients with myelodysplastic syndromeJ.Clinical Epige-netics,2021,13(1):1693 Gill H,Leung AY,Kwong YL.Molecular and cellular mechanisms ofmyelodysplastic syndrome:implications on targeted therapyJ.Int JMol Sci,2016,17(4):4404 Nazha A,Zarzour A,Al-Issa K,et al.The complexity of interpre-ting genomic data in patients with acute myeloid 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