高效液相色谱法在中药复方成分分析中的应用.pdf

其他研究Identification&SourceGendingSwhyenz 304高效液相色谱法在中药复方成分分析中的应用韦雯怡1，罗宇东2*，李芳婵1，谭安蔷2，陈晓艺2（1.广西中医药大学，南宁 530200；2.广西中医药大学制药厂，南宁 530023）基金项目：广西科技重大专项（桂科AA22096034）、广西壮瑶药重点实验室（桂科基字201432号）、南宁市创新创业领军人才“邕江计划”资助项目（2019020）、壮瑶药协同创新中心（桂教科研201320号）、广西壮族自治区民族药资源与应用工程研究中心（桂发改高技函20202605号）、广西中医药重点学科壮药学（GZXK-Z-20-64）、广西一流学科中药学（民族药学）（桂教科研201812号）第一作者：韦雯怡，硕士研究生，主要从事中药新药开发及中药制剂质量控制的研究工作*通讯作者：罗宇东，硕士，主任药师，主要从事中药、壮药与保健食品新产品开发工作【摘 要】随着越来越多学者对中药复方制剂有效成分的深入挖掘，高效液相色谱法（HPLC）作为一种高效、准确、灵敏度高的分析手段受到越来越广泛的应用。目前，高效液相色谱法多与其他分析手段如质谱、红外光谱、荧光检测器等技术联用便于对中药复杂成分的分析。【关键词】中药复方；高效液相色谱法；分析手段；成分分析Application of High-performance Liquid Chromatography in the analysis of Traditional Chinese Medicine Compound CompositionWei Wenyi1，Luo Yudong2*，Li Fangchan1，Tan Anqiang2，Chen Xiaoyi2（1.Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning530200；2.Prescriptions Basis and Application Research of Guangxi Colleges and Universities，Nanning530023）【Abstract】As more and more scholars dig deeper into the effective components of traditional Chinese medicine compound preparations，high-performance liquid chromatography（HPLC）has been widely used as an efficient，accurate and sensitive analytical method.At present，high-performance liquid chromatography is mostly combined with other analytical methods such as mass spectrometry，infrared spectroscopy，fluorescence detector and other technologies to facilitate the analysis of complex components of traditional Chinese medicine.【Keywords】Chinese medicine compound；high-performance liquid chromatography；analytical tools；component analysis中药复方制剂是我国中医药文化的重要组成部分，其通过多途径、多靶点共同发挥临床疗效，具有丰富的研究价值，同时关于中药复方制剂的研究更是我们中医药文化不断传承创新下去的必要过程。中药复方因其药味多、复杂的成分构成、研发困难等制约了其现代化和国际化进程，利用高效液相色谱技术（HPLC）可高效、准确、定量的阐明其药效物质基础、全面控制制剂质量，为揭示中药方剂中的药效物质基础和配伍规律提供有效手段。高效液相色谱法是建立在经典的气相色谱和经典的液相色谱的技术基础上的一种分析技术手段。高效液相色谱是以高压下的液体为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用高效液相色谱来分析。高效液相色谱和气相色谱在基本理论方面没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质的差别。1 HPLC在指纹图谱中的应用现代研究中，现代中药制剂不论是在配方组成、生305高效液相色谱法在中药复方成分分析中的应用产工艺还是批发零售等环节都必须按照国家相关部门的相应标准严格执行，因此在测定中药制剂中各种成分的含量时，HPLC法是最可靠，最常用，最稳定的色谱指纹图谱分析方法，且质量评价也在提倡指纹图谱1-3。利用HPLC有简便、准确、持久、专属性强的特点4，通过HPLC建立的指纹图谱被广泛运用于多种中药复方制剂的单个成分和多成分的定性定量分析中，为中药复方制剂的药效学、最优工艺筛选研究提供一定的理论基础。1.1 指纹图谱与药效学研究中药复方的定量研究应建立在整体性的基础上，复方成分复杂，单一指标性成分分析无法完整体现复方的质量，通过对中药复方进行指纹图谱的建立，能最大限度地获取中药复方制剂药效化学成分，避免有效成分的遗漏。Zhang5等利用HPLC测定大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠在不同时间点给予养阴通脑颗粒后不同时间点的指纹图谱，并成功建立了养阴通脑颗粒对脑缺血再灌注损伤大鼠的谱效关系。Xiao6等采用HPLC对12批三白汤建立了指纹图谱，为筛选其抗氧化作用的药效物质基础奠定了基础。王倩等7对20批芪胶升白胶囊建立了指纹图谱，经过联合网络药理学发现了辅助治疗肿瘤、癌症及白细胞减少症的关键成分，揭示了芪胶的药效成分及作用机制。以上研究表明，利用HPLC对中药复方制剂指纹图谱的建立，为进一步的药效学研究提供了良好的基础条件。1.2 指纹图谱与工艺筛选采用传统方法制备得到的中药复方制剂，对于复方中的有效成分有较大的影响，因此需要摸索其有效成分保留最佳的提取以及干燥工艺，最终利用高校液相色谱法技术监测其有效成分变化以达到择取最优条件的同时，达到用药安全、规范的作用。裴晓蕾8等对不同喷雾干燥工艺参数下的当归补血汤样品指纹图谱按出峰时间进行分段，发现不同工艺参数对不同出峰时间的成分影响不同，表明了制剂加工过程中可能出现的药效成分变化和迁移，保证中药复方质量标志成分的稳定传递。刘滢等人9利用HPLC测定指纹图谱相似度、量值传递转移率、浸出率等指标优选经典名方泻白散标准煎液的最佳工艺。李硕等10基于对益气活血通便方指纹图谱的建立，测定7种指标性成分含量结合化学模式识别技术快速、有效的优选了益气活血通便方最佳提取工艺，为制剂后续的开发提供了参考。李明明等11则建立生脉汤指纹图谱过程中利用HPLC考察了其最佳的提取纯化方法为水煎煮后醇沉取滤液再加甲醇，同时发现提取方法影响了生脉汤里面的皂苷类成分含量，对10批生脉汤进行相似度评价，并利用聚类分析、主成分分析和正交偏最小二乘判别分析控制生脉汤质量。以上说明通过HPLC建立的指纹图谱对于中药复方制剂的工艺筛选有一定的作用。2 HPLC在中药复方成分分析中的应用中药复方制剂是通过方剂中各味中药相辅相成、相互制约组成的制剂，并非是单一成分或单味药材就能达到理想的疗效。因此，对中药复方制剂的含量进行控制显得犹为重要，而利用HPLC对复方中的复杂成分进行含量测定是现代常用手段。2.1 经典名方成分分析经典名方复方制剂研发离不开“物质基准”质量研究，经典名方物质基准是指以古代医籍中记载的经典名方制备方法为依据制备而得的中药药用物质的标准，除成型工艺外，其余制备方法应当与古籍记载基本一致，其制剂的所有药学研究均须与物质基准进行对比，以确保与物质基准的关键质量属性一致。因此，建立以关键质量属性辨识和量值传递是经典名方新药研发的核心。Xu Y等人12利用HPLC对芍药甘草汤中含量较高的芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷和甘草酸建立了质量标准的质量指标，并通过实验研究发现芍药苷（11.729.25 g/mL）和甘草素（17.1928.65 g/mL）协同作用能显著降低最大收缩力，同时这些化合物通过抑制乙酰胆碱（Ach）诱发的收缩反应来发挥浓度依赖性解痉作用。陈秋谷等13利用HPLC对经典名方辛夷清肺饮中的7个成分进行含量测定，通过网络药理学技术筛选和分析了这7个定量成分具有治疗变应性鼻炎的作用靶点和通路，为后续的药理学研究提供了理论基础。以上体现了HPLC在古代经典名方的成分分析中是一种普遍利用的手段。2.2 中药制剂成分分析中药制剂以其疗效佳、不良反应较少而被广泛应用于临床，但对其制剂成分和剂量控制有着严格的要求。为了保证中药制剂的质量、成分的安全有效性，现代学者对中药制剂利用HPLC进行质量的控制，并有利于制剂有效成分的筛选，为中药复方制剂的质量控制提供科学依据。邹满星等14对葛根芩连汤氯仿部位进行了多成分含量测定，并发现葛根芩连氯仿部位及其单体均对羧酸酯酶具有较强的抑制作用，通过抑制羧酸酯酶以缓解伊立替康所致迟发型腹泻。陈健勇等15利用HPLC其他研究Identification&SourceGendingSwhyenz 306筛选出银翘清咽颗粒中具有明显IL-6调控作用的成分，建立了贴近功效主治的银翘清咽颗粒含量测定。以上表明HPLC在中药制剂的含量成分分析中发挥着越来越重要的作用，对于未来的复方成分研究具有很大的潜力。3 HPLC联用技术分析仪器联用技术已在全行业样品分析中得到应用，随着新物质不断出现，以及科技的进步，对分析工具的技术要求更高，仪器联用将发挥重要的作用。中药复方制剂成分复杂，当分析过程中发现灵敏度不够、无法检测或者便于结构表征时，采用联用技术不失为提高分析的手段。在中药复方的分析中常用液-质联用，可以同时满足分离以及结构测定。3.1 液质联用中药复方制剂相对于中药单味药来说，成分种类多但含量少，分离提纯过程较为复杂，液质联用在中药复方质量控制上具有专属性和灵敏度16，是鉴定复杂化学成分的一种有效的分析测定方法，所以Yang17等在研究胃脾灵汤减轻胃癌前病变的作用及其在胃癌前病变治疗中的抗炎作用过程中，使用HPLC-MS/MS对其主要成分进行评估，建立了4种代表性成分。Qiuyue等18利用高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（HPLC-QTOF/MS）检测了清热化湿汤中的20个植物化学成分，并建立了谱图。吴冬雪等19利用高效液相色谱-三重四极杆质谱（HPLC-QqQ/MS）分析方法快速分离检测中药复方益气养血口服液中的人参皂苷，并考察了6种无机多孔材料对4种主要人参皂苷的吸附活性，充分发挥了该分析方法对准确分析复杂体系中微量人参皂苷的检测价值。高效液相色谱与质谱的联用有利于复杂成分的分离分析，也为复方制剂的开发利用提供技术支持和理论支撑。3.2 HPLC联用检测器在中药复方制剂分析中，联用不同检测器可快速分析成分，CAD检测器的响应信号只跟化合物的质量有关，不受结构影响，适用于无紫外吸收的非挥发性或弱挥发性物质的检测，因此林楚慧等20利用高效液相色谱仪-电喷雾检测器（HPLC-CAD）以CAD雾化温度为55；气速模式为Analytical；幂律参数为1.35和过滤常数为3.6测定方法测定了牛黄解毒片中6种胆汁酸类物质，建立了6种胆汁酸的HPLC-CAD含量测定方法，提供了更多中药复方制剂质量评价的分析方法。DAD检测器与HPLC联用在中药复方成分含量分析中具有准确、可靠、便捷的优点，因此顾涵等21应用高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）同时测定养生丸中的芍药苷、阿魏酸、羌活醇及异欧前胡素4种活性指标性成分的含量，经过方法学验证具有专属性强、操作简单、准确快速的优势，可全面控制该制剂的质量。高效液相色谱荧光检测法（HPLC-FLD）在中药复方制剂的痕量分析中应用广泛，并且可以去除制剂中的干扰性成分，毕健丽等22采用HPLC-FLD测定了经典名方金海硝排石丸芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚5种标志性成分，方法学验证均达到标准，且分析时间短，有利于该方的质量评价。蒸发光散射检测器（ELSD）对几乎没有紫外吸收的化合物的含量测定犹为适用，李婷等人23用高效液相色谱蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）对芪蛭通络胶囊中人参皂苷Rb1和黄芪甲苷2个成分进行含量测定，缩短了处理时间，提高了检测效率。HPLC通过与多种检测器配合联用，可对中药复方制剂中有效成分含量进行评价，筛选最佳处理条件，便于中药复方制剂的开发利用。4 讨论自从高效液相色谱法的推出，因其精密的分析、操作简便、进样量小和分离度高在中药及其制剂的研究中得到广泛应用，特别在指纹图谱的建立以及多种有效成分的含量测定中引发了学术界高度的关注，而各项研究都离不开高效液相色谱法分析手段，其与多种检测器联用更是达到取长补短的效果，对多种成分均达到有效分离的效果。随着国家对中药复方制剂的高度重视，高效液相色谱在食品药品检验中将发挥更大的价值，这为后期的临床安全用药提供了检验手段和便利。307高效液相色谱法在中药复方成分分析中的应用参考文献1张维方，梁献葵，纪亮，等.不同品种牛膝3个成分含量测定及HPLC指纹图谱研究J.时珍国医国药，2020，31（11）：2 665-2 669.2王盼，储全根，轩云，等.抵当陷胸汤HPLC-MS指纹图谱研究J.时珍国医国药，2020，31（12）：2 937-2 940.3迟玉霞，肖海燕，胡冬梅，等.HPLC法测定解毒散结丸中迷迭香酸含量方法的研究J.山东化工，2022，51（18）：137-140.4J W，Q Y，C H，et al.Qualitative and quantitative analyses of Tripterygium hypoglaucum in Yinning Tablets，a compound traditional Chinese herbal preparationJ.Nan fang yi ke da xue xue bao=Journal of Southern Medical University，2022，42（6）：949-954.5Y Z，L Y，J Y，et al.Spectrum effect correlation of yangyin tongnao granules on cerebral ischemia-reperfusion injury ratsJ.Frontiers in pharmacology，2022，13：947978.6Y X，X S，H W，et al.Spectrum-effect relationship between HPLC fingerprint and antioxidant of“San-Bai Decoction”extractsJ.Journal of chromatography.B，Analytical technologies in the biomedical and life sciences，2022，1 208：123 380.7王倩，姜俊，许霞，等.指纹图谱及网络药理学联合分析芪胶升白胶囊的药效成分及机制J.中国中药杂志，2022，47（24）：1-10.8裴晓蕾，肖佳妹，赵佳柱，等.当归补血汤喷雾干燥工艺参数对其成分迁移的影响J.中医药导报，2022，28（10）：37-42.9刘滢，董金香，高原，等.基于指纹图谱和量值传递优化泻白散标准煎液制备工艺J.时珍国医国药，2022，33（1）：125-129.10李硕，杨晓玲，权起元，等.基于HPLC指纹图谱与化学模式相结合的益气活血通便方提取工艺优选J.中草药，2022，53（18）：5 692-5 700.11李明明，朱志军，党晓月，等.生脉汤HPLC指纹图谱的建立及质量控制J.中医学报，2022，37（11）：2 412-2 417.12Y X，C L，T C，et al.Quantitative Analysis of the Multicomponent and Spectrum-Effect Correlation of the Antispasmodic Activity of Shaoyao-Gancao DecoctionJ.Journal of analytical methods in chemistry，2022，2022：2 279 404.13陈秋谷，李常慧，莫平莉，等.基于HPLC和网络药理学分析经典名方辛夷清肺饮的质量标准研究J.中国药师，2022，25（11）：1 932-1 938.14邹满星，张欢，张焰，等.葛根芩连汤氯仿部位含量测定及对羧酸酯酶的抑制作用研究J.中药与临床，2019，10（2）：10-13.15陈健勇，许俏苑.银翘清咽颗粒中IL-6调控成分的筛选和HPLC同时测定各组分含量J.按摩与康复医学，2022，13（13）：77-80.16彭荣越.浅谈液质联用技术在中药质量控制中的应用J.Infection International（Electronic Edition），2018，7（4）：84-85.17P Y，H Y，H Z，et al.Weipiling decoction alleviates N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine-induced gastric precancerous lesions via NF-B signalling pathway inhibitionJ.Chinese medicine，2022，17（1）：104.18H Q，YE H，S Z，et al.Efficacy of Qingre Huashi decoction on infection of：inhibiting adhesion，antioxidant，and anti-inflammationJ.Journal of traditional Chinese medicine=Chung i tsa chih ying wen pan，2022，42（6）：915-921.19吴冬雪，刘淑莹，陈思键，等.固相萃取结合高效液相色谱-三重四极杆质谱快速分离检测益气养血口服液中人参皂苷的新方法J.分析测试学报，2020，39（7）：867-873.20林楚慧，柴瑞平，张璐，等.高效液相色谱-电雾式检测器测定牛黄解毒片中的6种胆汁酸J.分析化学，2022，50（5）：764-771.21顾涵，沈申，戴国友，等.HPLC-DAD法同时测定养生丸中4种活性成分的含量J.亚太传统医药，2022，18（12）：72-76.22毕健丽，金文芳，徐胜，等.HPLC-FLD法对经典名方金海硝排石丸中5种标志性成分的分析J.沈阳药科大学学报，2023，1（1）：1-8.23李婷，程显隆，王郡瑶，等.HPLC-ELSD法同时测定芪蛭通络胶囊中2个皂苷类成分的含量J.药物分析杂志，2022，42（4）：720-726.