CKIP-1对模拟失重诱导的成骨细胞微丝变化的影响.pdf

论著C K I P 对模拟失重诱导的成骨细胞微丝变化的影响王脉桃宋卫红周华万倩惠辉(郴州市第一人民医院,湖南郴州 )摘要【目的】探讨酪蛋白激酶结合蛋白(C K I P )对模拟失重诱导的成骨细胞微丝变化的影响.【方法】选择小鼠成骨样细胞株(MC T E)进行研究,借助回转器模拟微重力环境,通过慢病毒感染构建C K I P 过表达模型,将细胞分为a组(微重力组)、b组(空载慢病毒及微重力组)、c组(C K I P 过表达慢病毒及微重力组)、d组(C K I P 过表达慢病毒组).使用F I T C标记的鬼笔环肽对细胞进行荧光染色,在激光共聚焦显微镜下观察细胞微丝的变化,同时通过q R T P C R技术测定C K I P mR NA、A L PmR NA及R UN X mR NA的表达情况.【结果】每组细胞的微丝结构均呈现不同程度的解聚,而且张力纤维可见紊乱排列,并数量下降,以C K I P 过表达慢病毒感染的成骨细胞模拟微重力组改变最为明显.c组、d组C K I P mR NA表达水平高于a组、b组,差异有统计学意义(P).c组成骨细胞R UN X mR NA、A L P LmR NA表达水平均低于a组、b组、d组,差异有统计学意义(P).a组、b组、d组成骨细胞R UN X mR NA、A L P LmR NA表达水平比较,差异无统计学意义(P).【结论】C K I P 过表达可能会进一步加重微重力条件下成骨细胞骨架微丝的解聚,进而抑制成骨细胞增殖及分化.关键词成骨细胞/超微结构;失重模拟T h eE f f e c t o fC K I P o nM i c r o f i l a m e n tC h a n g e s i nO s t e o b l a s t s I n d u c e db yS i m u l a t e dW e i g h t l e s s n e s s WANG M a i t a o,S ONG W e i h o n g,ZHO U H u a,e ta l(T h eF i r s tP e o p l esH o s p i t a lo fC h e n z h o uC i t y,C h e n z h o uH u n a n )A b s t r a c t【O b j e c t i v e】T oi n v e s t i g a t e t h e e f f e c t o fC K I P o nm i c r o f i l a m e n t c h a n g e s i n d u c e db ys i m u l a t e dw e i g h t l e s s n e s s i no s t e o b l a s t s【M e t h o d s】W e s e l e c t e dm o u s e o s t e o b l a s t l i k e c e l l l i n e(M C T E)f o r t h e s t u d y,s i m u l a t e dm i c r o g r a v i t ye n v i r o n m e n tw i t hag y r a t o r,a n dc o n s t r u c t e daC K I P o v e r e x p r e s s i o nm o d e l t h r o u g h l e n t i v i r u s i n f e c t i o n T h e c e l l sw e r ed i v i d e d i n t og r o u pa(m i c r o g r a v i t yg r o u p),g r o u pb(e m p t y l e n t i v i r u sa n dm i c r o g r a v i t yg r o u p),g r o u pc(C K I P o v e r e x p r e s s i o n l e n t i v i r u sa n dm i c r o g r a v i t yg r o u p),a n dg r o u pd(C K I P o v e r e x p r e s s i o nl e n t i v i r u sg r o u p)F l u o r e s c e n c es t a i n i n gw a sp e r f o r m e do nc e l l su s i n gF I T Cl a b e l e dg h o s t p e nc y c l i cp e p t i d e s,a n dc h a n g e s i nc e l lm i c r o f i l a m e n t sw e r eo b s e r v e du n d e r l a s e r c o n f o c a lm i c r o s c o p y T h e e x p r e s s i o no fC K I P m R N A,A L Pm R N A,a n dR U N X m R N Aw a s a l s om e a s u r e du s i n gq R T P C Rt e c h n o l o g y【R e s u l t s】T h em i c r o f i l a m e n t s t r u c t u r eo f e a c hg r o u po f c e l l s s h o w e dv a r y i n gd e g r e e so f d e p o l y m e r i z a t i o n,a n dt h e t e n s i o nf i b e r sw e r ed i s o r d e r l ya r r a n g e da n dt h en u m b e rd e c r e a s e d T h em o s t s i g n i f i c a n t c h a n g e sw e r eo b s e r v e d i nt h e s i m u l a t e dm i c r o g r a v i t yg r o u po f o s t e o b l a s t s i n f e c t e dw i t hC K I P o v e r e x p r e s s i o n l e n t i v i r u s T h e e x p r e s s i o nl e v e l o fC K I P m R N Ai n t h e g r o u p c a n d t h e g r o u pdw a sh i g h e r t h a n t h a t i n t h e g r o u pa a n d t h e g r o u pb,a n d t h e d i f f e r e n c ew a s s t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t(P )T h ee x p r e s s i o nl e v e l so fR UN X m R N Aa n dA L P L m R N Ai nb o n ec e l l sc o m p o s e do ft h eg r o u pc w e r el o w e rt h a nt h o s ei nt h eg r o u pa,t h eg r o u pb,a n dt h eg r o u pd,w i t hs t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c e(P )T h e r ew a s n o s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n t h e e x p r e s s i o n l e v e l s o fR UN X m R N Aa n dA L P Lm R N Ai nb o n e c e l l sb e t w e e nt h eg r o u pa,t h eg r o u pb,a n d t h eg r o u pd(P )【C o n c l u s i o n】O v e r e x p r e s s i o no fC K I P m a y f u r t h e r e x a c e r b a t e t h ed e p o l y m e r i z a t i o no f c y t o s k e l e t a lm i c r o f i l a m e n t s i no s t e o b l a s t su n d e rm i c r o g r a v i t y c o n d i t i o n s,t h e r e b y i n h i b i t i n gt h ep r o l i f e r a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o no f o s t e o b l a s t s K e yw o r d sO s t e o b l a s t s/U L;W e i g h t l e s s n e s sS i m u l a t i o n 中图分类号R 文献标识码Ad o i:/j i s s n 文章编号 ()随着我国航天事业的不断发展,宇航员们实现了从舱内试验到太空行走,从太空短期停留到中长期驻留,而随着宇航员们太空活动的增加以及驻留时间的延长,失重导致的骨质疏松也将因此加重.医学临床研究 年月第 卷第期JC l i nR e s,A p r ,V o l ,N o 基金项目郴州市科学技术局科技发展计划项目(Z D Y F )通信作者,E m a i l:q q c o m研究显示,失重环境对骨代谢的影响主要体现为骨形成下降,而这个过程主要受成骨细胞的调控,在力学影响下,成骨细胞的反应可因其所受作用力的强度、性质、环境及年龄的不同而有不同.成骨细胞对机械力学反应最敏感的部分为细胞骨架,骨架系统可将力学信号转变为细胞内的生物电信号.酪蛋白激酶结合蛋白(c a s e i nk i n a s ei n t e r a c t i n gp r o t e i n ,C K I P )作为一个多功能分子,其不仅参与了细胞信号转导、分化、凋亡,还参与了细胞骨架重组,有望成为新的治疗骨质疏松的药物靶点 .本研究以小鼠成骨样细胞株(MC T E)作为研究对象,观察在模拟微重力条件下过表达C K I P 对成骨细胞微丝结构的影响,并测定成骨相关基因A L PmR NA、RUN X mR NA的表达,以期为后期研究失重所致继发性骨质疏松症的发生机制提供参考.材料与方法仪器和试剂激光共聚焦显微镜(L S CM,O l y m p u s公司);美国宇航局研发的旋转式生物反应器S y n t h e c o n型(r o t a r y c e l l c u l t u r e s y s t e m,R C C S);D DMEM细胞培养基(美国S i g m a公司);青链双抗(华北制药股份有限公司);胎牛血清(美国H y c l o n e公司):C y t o d e x 型微载体(美国S i g m a公司);D A P I(瑞士R o c h e公司);F I T C标记的鬼笔环肽(瑞 士A l e x i s公 司);L i p o f e c t a m i n e T r a n s f e c t i o n R e a g e n t(L i f e t e c h n o l o g i e s);O p t i MEMIR e d u c e dS e r u m M e d i u m(G i b c o);p u r e l i n kr n am i n i k i t(Am b i o n);S u p e r S c r i p t F i r s t S t r a n dS y n t h e s i sS u p e r M i x,S Y B RG r e e n E Rq P C RS u p e r M i x U n i v e r s a l(I n v i t r o g e n),C K I P 抗 体(Om n i m a b s),R e a l t i m eP C R试剂盒.微载体处理备用取微载体 m g,室温下使用磷酸盐缓冲液(P B S)浸泡h后置于高压蒸汽灭菌,然后弃P B S,DMEM冲洗次后更换含 胎牛血清的DMEM培养液浸泡,此过程无菌操作,最后冷藏保存.C K I P 过表达慢病毒的构建C K I P 基因采用来自美国国立生物技术信息中心合成的c D NA序列,结合B a mH I和XH o I的酶切位点进行合成,并构建 至 带G F P的 过 表 达 载 体 中,然 后 连 接 至p R e c e i v e r L v 载体,取载体液进行恒压 V转膜 m i n,脱脂牛奶封闭,孵育C K I P 抗体过夜.次日T B S T洗膜,室温孵育二抗h后洗膜,利用C h e m i化学发光成像系统验证p R e c e i v e r L v C K I P 构建成功,最后进行病毒包装及浓缩,分装后保存在 冰箱.细胞微载体共培养将南方医科大学解剖实验室提供的小鼠成骨样细胞株进行复苏、培养并传代,至第代时,按 个细胞/m L将对数生长期的细胞分别随机接种于个已放置微载体的回旋培养筒 中,将 回 旋 筒 放 置 在 培 养 箱(湿 度 饱 和、C O、)中培养,h后分别添加慢病毒或者空病毒.实验分为a组(微重力组)、b组(空载慢病毒及微重力组)、c组(C K I P 过表达慢病毒及微重力组)、d组(C K I P 过表达慢病毒组),将组均置于培养箱中培养 h后更换新鲜的完全培养基.将a组、b组、c组置于回转器上,以 r/m i n转速在培养箱中回转培养 h,d组静置于同一条件的培养箱中培养 h,提取标本进行测定.微丝染色后观察实验完成后,从各组取出含有适量细胞的微载体,P B S洗涤后,下用 胰酶 E D T A溶液m L消化m i n,期间振荡数次,用含 胎牛血清的DMEM培养液m L终止消化,r/m i n离心m i n,弃上清.再加入含 胎 牛 血 清 及 青 链 双 抗 的DMEM培 养 液m L,混匀后接种至预先放置盖玻片的孔板内.h后细胞爬片,丢弃培养液,使用多聚甲醛固定,m i n后用P B S洗涤次,再予B S A封闭,m i n后加入F I T C P h a l l o i d i n孵育,h后用P B S洗涤次,再加入D A P I染色,m i n再次用P B S洗涤次,L C S M下观察拍照.q R T P C R检测按实验要求培养完成后,收集各组细胞,采用实时荧光定量核酸扩增检测系统(q R T P C R)检 测C K I P mR NA、A L P L mR NA、RUN X mR NA表达情况.标本处理将上述处理后的细胞置于无R NA酶 的E P管 中,裂 解 液 裂 解 后 加 入T R I z o lm L,剧烈震荡m i n;加入 L氯仿,用力震荡至乳化 呈 乳 白 色,室 温 静 置 m i n.环 境 下 g离心 m i n后裂解液分为层:上清液,中间白色蛋白层及下层带有颜色的有机相.吸取上清液予异丙醇沉淀,乙醇清洗,沉淀溶解完成本处理.总R NA反转录 条件下将R NA水浴m i n,置 于冰上冷却.反转 录反 应 条 件:,m i n;,m i n;,m i n;保存.反应体系(L):R NA P r i m e rM i x L,R T医学临床研究 年月第 卷第期JC l i nR e s,A p r ,V o l ,N o R e a c t i o nB u f f e rL,mm o l/Ld NT P sL,U/LR N a s e I n h i b i t o r L,U/LM ML VR t a s eL,O l i g o(d T)L,d d HO(D N a s e f r e e)L.R e a l t i m eP C R反 应 体 系:P r i m e rP L,P r i m e rP L,s u p e r m i x L,P A S S I V E D Y E L,T e m p l a t eL,d d HOL,共 L.反应条件:m i n,s,s,s,个循环.溶解曲线:s,s,m i n升温,s.引物序列:C K I P上游引 物 C GA T C C C G C C ATGAA GA ,C K I P下 游 引 物 T C A G C A C C AC ATAG CG G T T T ;RUN X 上游引物 A C TAT GG C GT C AAA CAG CC T ,RUN X 下游引物 T A CAA CC T TGAA G G CC A CG G ;A L P L上游引物 T G C AG G AT C G GA A C G T C AAT ,A L P L下游引物 GAG T T G G T A AG GC AGG G TC C .统计学方法采用S P S S 软件进行数据分析,计量资料采用(xs)表示,组间比较行L S D t检验,P 为差异有统计学意义.结果细胞微丝骨架的改变各组细胞经旋转培养及C K I P 过表达慢病毒感染后微丝均出现一定的结构变化,见图.镜下可见a组、b组(图a、b)的成骨细胞骨架结构紊乱,微丝出现应力纤维数量减少和局部解聚的趋势,应力纤维表现为无方向性、短而纤细,散乱于胞浆内,但部分仍可见呈网状分布;d组(图d)成骨细胞微丝结构在解聚程度上和a组、b组相似,其应力纤维也有部分可交织成网,但整体表现为粗细不一、方向多变;c组(图c)细胞骨架结构破坏程度最重,骨架蛋白弥散分布,镜下微丝无法清晰辨认、网络结构消失、细胞核区模糊.图各组细胞骨架L C S M下图像(F I T C p h a l l o i d i n染色的微丝呈绿色,D A P I染色的细胞核呈蓝色;a、b、c、d分别代表a组、b组、c组、d组细胞骨架L C S M图像)各组C K I P 的表达情况比较 c组、d组C K I P mR NA表达水平高于a组、b组,差异有统计学意义(P),见图.图成骨细胞中C K I P mR NA水平柱状图(表示P,n s表示P)各组成骨相关基因RUN X、A L P LmR NA的表 达c组 成 骨 细 胞RUN X mR NA、A L P LmR NA表达水平均低于a组、b组、d组,差异有统计学意义(P).a组、b组、d组成骨细胞RUN X mR NA、A L P L mR NA表达水平比较,差异无统计学意义(P),见图.图成骨细胞中A L P LmR NA、RUN X mR NA水平柱状图(表示P,n s表示P)讨论随着载人航空事业的发展,宇航员在太空停留的时间也越来越长,由此可能出现的一系列继发性疾病如肌肉萎缩、骨质疏松等.目前,临床学者通过模拟微重力创造失重环境,对成骨细胞感受和传导机械应力的结构、细胞信号转导及基因表达等方面进行研究,取得了一定的进展.成骨细胞形态骨架和运动协调系统的稳定主要通过胞核、质膜、细胞医学临床研究 年月第 卷第期JC l i nR e s,A p r ,V o l ,N o 器、细胞骨架等进行调节,微丝为细胞骨架的主要结构之一,其参与细胞内外的多种信号传导和物质运输,调控细胞的增生和分化过程 .成骨 细 胞 的 信 号 转 导 通 路 主 要 包 括Wn t、BMP、R ANK L、NOT CH,信号通路间互相关联交叉构成复杂网络结构,可精确地调控分化过程.BMP信号通路作为经典通路,是骨重建过程中的重要信号通道,其在成骨细胞的分化与成熟方面起主要调节作用,在信号通路的传导过程中,骨形态发生蛋白作于转化生长因子超家族的一员,对骨代谢的调节发挥了重要作用.BMP配体与受体结合,激活下游R S m a d s,R S m a d s与C o S m a d s形成复合物转位至细胞核内,启动RUN X 及O s t e r i x等靶基因 转 录,促 进 成 骨 分 化.有 研 究 显 示,在BMP信号通路传导体系中,C K I P 可以通过调控S m u r f 的活性,进而参与骨代谢过程.也有研究表明,在体内和体外牵张大鼠下颌骨成骨模型中,低表达的C K I P 可以促进骨形成,C K I P 过表达可抑制成骨细胞,可以导致骨质疏松 .本研究笔者选用小鼠成骨样细胞(MC T E)作 为 实 验 对 象,通 过 回 转 器 模 拟 微 重 力 效 应,C K I P 过表达细胞模型采用慢病毒感染获得,通过观察细胞微丝的变化并检测成骨相关基因表达水平,研究在微重力下,C K I P 与细胞微丝系统变化的相关性,并探讨失重所导致的成骨细胞分化成熟障碍,C K I P 是否参与调控.本研究结果显示,c组和d组的抑骨相关基因C K I P mR NA表达水平显著升高,c组与其他三组比较,微丝结构解聚最为显著,应力纤维稀疏,网络结构消失,而同时c组的成骨相关基因R U N X m R N A、A L P Lm R N A表达水平低于其他三组,提示A L P Lm R N A、R U N X m R N A表达水平下调与微丝解聚是相对应的,而且与解聚程度呈正相关.本研究c组微丝严重解聚,可能不仅受微重力的影响,还有受C K I P 调控,因此笔者推断C K I P 作为参与调节骨形成的重要的蛋白因子,有类似模拟微重力促使微丝解聚的作用.随着细胞骨架结构 的 破 坏,进 一 步 影 响 细 胞 传 导 通 路,影 响R U N X 基因的表达,导致成骨细胞分化成熟障碍,引起骨形成减少,从而导致骨质疏松.参考文献S O E J I MAK,K L E I N N U L E N DJ,S EM E I N SCM,e t a lD i f f e r e n t r e s p o n s i v e n e s so f c e l l s f r o ma d u l t a n dn e o n a t a lm o u s eb o n e t om e c h a n i c a l a n db i o c h e m i c a l c h a l l e n g eJJC e l l uP h y s i o l,():B O S CDG,G R AHAMKC,S A U L N I E RRB,e t a l L i t c h f i e l dDW I d e n t i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fC K I P ,an o v e l p l e c k s t r i nh o m o l o g yd o m a i n c o n t a i n i n gp r o t e i nt h a t i n t e r a c t sw i t hp r o t e i nk i n a s eC K JJB i o lC h e m,():尹秀山 C K I P 基因的敲除小鼠模型建立及其在骨骼、免疫系统中的生理功能研究D上海:中国人民解放军军事医学科学院,王脉桃,黄震,杨力,等模拟微重力诱导小鼠成骨细胞微丝变化对碱性磷酸酶及骨钙蛋白的影响J中华航空航天医学杂志,():A L B O R Z IA,MA CK,G L A C K I NCA,e ta l E n d o c h o n d r a la n di n t r a m e m b r a n o u sf e t a lb o n ed e v e l o p m e n t:O s t e o b l a s t i cc e l lp r o l i f e r a t i o na n d e x p r e s s i o no f a l k a l i n e p h o s p h a t a s e,m t w i s t,a n dh i s t o n eH JJC r a n i o f a cG e n e tD e vB i o l,():J I A N GCJ,WE E D SAG,KHA NS,e t a l F a c t i na n dG a c t i nb i n d i n ga r eu n c o u p l e db ym u t a t i o no f c o n s e r v e dt y r o s i n er e s i d u e si nm a i z ea c t i nd e p o l y m e r i z i n gf a c t(o rZ mA D F)JP r o cN a t lA c a dS c iUSA,():J AM E SMF,MA N C HA N D AN,G O N Z A L E Z A G O S T IC,e ta l T h en e u r o f i b r o m a t o s i sp r o t e i np r o d u c tm e r l i ns e l e c t i v e l yb i n d sF a c t i nb u t n o tG a c t i n,a n d s t a b i l i z e s t h e f i l a m e n t s t h r o u g ha l a t e r a l a s s o c i a t i o nJB i o c h e mJ,(P t):D O RMA NLJ I nv i t r oe f f e c t so fb m p ,b m p ,a n db m p o np r o l i f e r a t i o na n dd i f f e r e n t a t i o no fm o u s em e s e n c h y m a l s t e mc e l l sJB i o m e dS c i I n s t r u m,:MA T S UMO T O Y,O T S U K AF,H I N OJ,e ta l B o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n b(B M P b)i n h i b i t s o s t e o b l a s t d i f f e r e n t i a t i o nv i aS m a d/p a t h w a yb yc o u n t e r a c t i n gS m a d/s i g n a l i n gJM o lC e l lE n d o c r i n o l,():W A N G YF,N I EJ,W A N G Y W,e t a lC K I P c o u p l e sS m u r f u b i q u i t i n l i g a s ew i t hR p t s u b u n i t o f p r o t e a s o m e t op r o m o t e s u b s t r a t ed e g r a d a t i o nJEMB OR e p,():Z HO UZCC K I P s i l e n c i n gp r o m o t e sn e wb o n e f o r m a t i o n i nr a tm a n d i b u l a rd i s t r a c t i o no s t e o g e n e s i sJO r a lS u r g e r yO r a lM e dO r a lP a t h o lO r a lR a d i o l,():e e L I T C H F I E L DDW C K I P o f s i g n a l i n gm o l e c u l e sJN a tR e vM o lC e l lB i o l,():L I UJ,L UC W,WUX H,e ta l T a r g e t i n go s t e o b l a s t i cC a s e i nk i n a s e i n t e r a c t i n gp r o t e i n t oe n h a n c es m a d d e p e n d e n tB M Ps i g n a l i n ga n d r e v e r s e b o n e f o r m a t i o n r e d u c t i o n i ng l u c o c o r t i c o i d i n d u c e do s t e o p o r o s i sJS c iR e p,:K A W A T A TD u a l i n h i b i t i o no f t h em T O R C a n dm T O R C s i g n a l i n gp a t h w a y s i s ap r o m i s i n gt h e r a p e u t i c t a r g e t f o ra d u l tT c e l ll e u k e m i aJC a n c e rS c i,():Z HA N GG,G UOB,WU H,e ta l Ad e l i v e r ys y s t e mt a r g e t i n gb o n e f o rm a t i o ns u r f a c e s t o f a c i l i t a t eR N A i b a s e da n a b o l i c t h e r a p yJN a tM e d,():(本文编辑:张兴珍)收稿日期 医学临床研究 年月第 卷第期JC l i nR e s,A p r ,V o l ,N o