华蟾素对人胃癌MKN-28细胞增殖、凋亡的影响研究.pdf

年第卷第期医学理论与实践华蟾素对人胃癌 细胞增殖、凋亡的影响研究叶 磊 郑梓莹 陈 文 陈毅菁福建医科大学附属第二医院中西医结合肿瘤科福建省泉州市 摘要 目目的的:探究华蟾素对人胃癌细胞 细胞株的增殖、凋亡、细胞周期的影响揭示华蟾素的抗癌机制 方方法法:选用人胃癌细胞 细胞株作为研究对象采用不同浓度华蟾素处理细胞后通过 实验(法)计算半抑制浓度()再以 值作为最佳药物使用浓度处理 细胞同时以 作为对照比较两组细胞在增殖、凋亡、细胞周期等方面的差异 采用 检测两组细胞、等凋亡相关蛋白的表达情况 结结果果:实验结果显示随华蟾素处理浓度的增加胃癌细胞增殖能力逐渐下降 华蟾素对 细胞作用的 值为./在./华蟾素作用下对照组胃癌细胞凋亡比例为(.)而实验组凋亡比例为(.)差异具有统计学意义(.)实验组/期细胞所占比例显著增加而/期细胞所占比例显著降低差异具有统计学意义(.)经过华蟾素处理后 细胞中 蛋白表达量显著上升(.)而、表达量则显著下降(.)结结论论:华蟾素能使人胃癌细胞 的增殖能力下降诱导凋亡阻滞胃癌进展相关的细胞周期具有作为潜在抗癌药物的开发价值 基金项目:泉州市科技计划项目()关键词 华蟾素 胃癌细胞 细胞增殖 凋亡 细胞周期中图分类号:.文献标识码:/.:.:.()().:././(.)(.)(.)./(.).(.)(.).:.胃癌是我国常见的癌症之一中医药已被广泛用于胃癌的治疗由于其独特的优势中医药不仅可以显著改善患者的症状并可以在一定程度上逆转恶性肿瘤的病理恶化从而防止肿瘤进一步发展华蟾素作为一种从中华巨型蟾蜍的表皮分泌物中提取的天然类固醇内酯被认为具备清热解毒以及消肿止痛的功效对改善恶性肿瘤的预后具有重要价值 许多体内外的研究表明华蟾素具有抗肿瘤医学理论与实践 年第卷第期 活性和增强化疗效果的特性 一项荟萃分析指出华蟾素联合化疗方案治疗胃癌比单独化疗更为有效可明显减轻化疗相关的不良反应并改善胃癌患者的生活质量 尽管华蟾素在临床上已被广泛应用但其抗肿瘤的分子机制目前仍未完全明确因此本实验选用人胃癌 细胞系从基础实验层面探究华蟾素对胃癌细胞增殖和周期的影响并进一步探索华蟾素对胃癌 细胞系凋亡相关蛋白表达量的影响从而明确其抗癌机制为华蟾素治疗胃癌的应用提供参考依据材料和方法.细胞、试剂人胃癌 细胞购自上海(江西)中 洪 博 元 生 物 技 术 有 限 公 司 华 蟾 素(德思特生物)由中洪博元提供 本实验所 需 试 剂 包 括完 全 培 养 基()不完全培养基()培养基()胰蛋白酶 消化液()法细胞增殖检测试剂盒()/()()膜()超敏发光液(赛默飞)()()()()()()()().实验仪器培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)倒置荧光显微镜(广州市明美光电有限公司)洁净工作台()多功能酶标分析仪(上海闪谱生物科技有限公司)显微镜()流式细胞仪 艾森生物(杭州)有限公司全自动化学发光图像分析系统(上海天能科技有限公司).细胞培养及药物处理人胃癌 细胞经复苏、解冻后采用含 胎牛血清和 青霉素链霉素双抗的 培养 细胞培养条件:含 浓度的、饱和湿度的孵箱 细胞培养液隔天换液 次待细胞密度至 时需对细胞进行传代每 传代 次 取对数生长期的 细胞用于后续实验 在 实验(法)前弃去细胞培养上清用 洗两遍加入.胰酶(含.)消化待细胞变圆加入培养基终止消化并收集细胞悬液至 离心管中/离心 弃去上清液加入培养基重悬细胞进行传代.细胞增殖活力检测通过 法检测细胞增殖活力 细胞培养至状态良好行细胞计数后将细胞悬液分配至 孔板中做好标记将细胞置于培养箱中 待细胞贴壁后更换新鲜培养基每孔 不同孔分别加入/、./、./、./、./、./、./、./、./及./浓度的华蟾素继续培养 后更换培养基向各孔中加入 试剂于培养箱中孵育 在 波长下用酶标仪测定各孔吸光度值计算 待 法计算半抑制浓度()后 根 据 值 将 细胞进一步分为对照组()和实验组(华蟾素处理)对照组只加入 而实验组加 浓度华蟾素处理 后续进行对应检测.流式细胞凋亡检测收集 个细胞/离心 后 采用磷酸盐缓冲溶液()洗涤两遍取 预冷的 结合液重悬细胞向各孔中加入 和 轻微混匀后在室温条件下避光孵育 用流式细胞仪进行检测细胞凋亡状态.流式细胞周期检测收集 个细胞/离心 后采用 洗涤两遍按照细胞周期检测试剂盒说明书向各孔加入细胞周期检测试剂在室温条件下避光孵育 用流式细胞仪检测细胞周期.检测实验组和对照组 培养细胞弃去培养基加入 裂解液裂解细胞提取总蛋白 /高速离心机 离心取上清液 蛋白定量试剂盒对总蛋白进行定量 对蛋白样品进行变性后进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳()后用 恒流转膜.膜用脱脂奶粉封闭后一抗 孵育过夜次日 膜室温孵育二抗 用发光液浸湿 膜置于全自动化学发光图像分析系统中进行显影 所使用的抗体及对应稀释倍数见表 表 检测抗体信息表抗体名称稀释倍数鼠抗 兔抗 一抗 兔抗 一抗 兔抗 一抗 辣根酶标记山羊抗兔().统计学方法应用.软件进行统计分析 计算采用 .所有实验重复 次定量结果采用均数 标准差()表示两组设计组间差异采用独立样本 检验多组设计组间差异采用单因素方差分析两两比较采用 法 检验水准 .为差异有统计学意义结果.检测华蟾素对胃癌细胞增殖的影响及 测定随华蟾素处理浓度的增加细胞增殖能 年第卷第期医学理论与实践力逐渐下降与浓度呈负相关其中与/组相比浓度./的华蟾素即可以达到显著抑制胃癌细胞增殖的能力(.)采用 .计算 细胞最佳药物处理浓度为./见表 表 不同华蟾素作用浓度对胃癌 细胞的增殖影响()浓度生物学重复细胞增殖活度/./././././././././././.流式细胞凋亡检测对照组胃癌细胞凋亡比例为(.)而实验组凋亡比例为(.)两组比较差异具有统计学意义(.).流式细胞周期检测经华蟾素处理后实验组/期细胞所占比例显著增加而/期细胞所占比例显著降低差异具有统计学意义(.)实验组 期细胞所占比例减少但差异无统计学意义(.)说明华蟾素可以将 增殖阻滞在 期 见表 表 华蟾素对胃癌 细胞细胞周期的影响()组别/对照组.实验组.细胞凋亡相关蛋白 检测结果经过华蟾素处理后 细胞中 蛋白表达量显著上升(.)而、表达量则显著下降(.)见表 表 华蟾素对胃癌 细胞凋亡相关蛋白相对表达量的影响()组别对照组.实验组.讨论胃癌是全球第五大常见癌症也是全球癌症死亡的第四大原因 胃癌对我国人民的生命造成了巨大的威胁根据 年全球疾病负担研究中国的胃癌发病率占全球胃癌总数的.同时胃癌是中国第二大常被诊断的癌症也是癌症相关死亡的第二大原因 随着医疗技术的进展和抗肿瘤药物的出现胃癌的预后较前有了明显改善但鉴于化疗的耐药性与毒副作用临床医生一直在探索传统中药治疗胃癌的效果以提高患者的生存时间或生活质量减少化疗引起的副作用 华蟾素几十年来一直作为经典的辅助疗法在临床上应用 有多项临床研究报告表明华蟾素可能对胃癌具有一定的治疗效果但有关华蟾素发挥抗胃癌的具体机制尚未明确一些研究表明华蟾素可以抑制人胃癌 细胞的侵袭、迁移能力也可以抑制人胃癌 细 胞 的 增 殖 并 通 过 下 调 (、)信号通路的表达发挥抗肿瘤作用 然而华蟾素对人胃癌 细胞系是否有同样的抑制作用尚未得到报道 在本研究中笔者以胃癌 细胞作为研究对象采用不同浓度的华蟾素进行干预治疗采用 法检测华蟾素对胃癌 细胞增殖活力的影响 结果显示随华蟾素药物浓度的增加 细胞增殖活力逐渐下降其增殖活力与浓度呈负相关提示华蟾素对胃癌 细胞株亦有显著抗癌作用 基于 检测结果我们测算出华蟾素对 细胞的 值为./即采用./浓度的华蟾素对 细胞具有 的抑制效应该值通常作为细胞实验的理想药物浓度进一步研究显示采用./浓度的华蟾素干预胃癌 细胞株后实验组凋亡比例为(.)而对照组为(.)说明华蟾素具有促进胃癌 细胞凋亡的作用此外经华蟾素处理后实验组/期细胞所占比例显著增加而/期细胞所占比例显著降低说明华蟾素可以将 增殖阻滞在 期而既往已有大量研究表明/期细胞比例与肿瘤活性显著相关/期比例越高说明肿瘤增殖活性越高恶性程度越高 本研究结果表明华蟾素可以通过降低胃癌 细胞/期细胞比例而降低肿瘤增殖活性降低其恶性程度 笔者进一步通过 技术检测了华蟾素处理后细胞凋亡相关蛋白的表达差异 结果发现经过华蟾素处理后 细胞中 蛋白表达量显著上升而、表达量则显著下降表明华蟾素促进了胃癌细胞的凋亡华蟾素发挥抗肿瘤的机制还有待进一步阐明既往研究表明信使()和小非编码 分子()可能是华蟾素发挥抗肿瘤作用的重要靶分子之一 其中 可通过上调或下调靶点而发挥基因调控的作用目前学界公认 调控是癌症发生、发展和侵袭的关键因素 近几十年来中药的各种生物活性成分在调节 中的应用越来越受到关注 本研究的结果即 值的确定将为探索华蟾素对胃癌 细胞转录组的影响奠定研究基础未来我们可以在此基础上探讨华蟾素抗胃癌的作用机制医学理论与实践 年第卷第期 总之华蟾素能使人胃癌细胞 的增殖能力下降诱导凋亡阻滞胃癌进展相关的细胞周期具有作为潜在抗癌药物的开发价值但华蟾素具体抗癌机制仍有待后期进一步研究参考文献 .:.:.:.:.():.:.():.():.():.():.():.蒯晴叶程叶张艳等.华蟾素抗消化道恶性肿瘤及其作用机制研究进展.中国实验方剂学杂志():.乔翠霞张新峰蔡小平等.华蟾素抑制人胃癌 细胞体外侵袭、迁移的机理.中成药():.李楠静黄娟张又等.华蟾素对人胃癌 细胞增殖及 表达的影响.重庆医学():./.():.:./.():.:.():.收稿日期 (编辑 倩楠)(下接第 页).:.():.:.:.()().():.():.:.():.():.():.卢兴浩俞鹏陶恒等.拓扑异构酶()基因的表达与 细胞在肝细胞癌中的数量相关性及临床预后意义细胞与分子免疫学杂志():.:.:.():.().().():.收稿日期 (编辑 羽飞)