半枝莲含药血清对膀胱癌T24细胞凋亡和黏附力的影响探究.pdf

医学理论与实践 年第卷第期 半枝莲含药血清对膀胱癌 细胞凋亡和黏附力的影响探究 基金项目:年烟台南山学院青年基金()孙业香 王潇潇 王丽华 吕常旭烟台南山学院山东省龙口市 摘要 目目的的:探究半枝莲含药血清对膀胱癌 细胞凋亡和黏附力的影响 方方法法:级雄性 大鼠 只随机分为无药血清组、半枝莲低剂量组、半枝莲中剂量组、半枝莲高剂量组每组 只分别以蒸馏水及半枝莲./()、/()、/()腹腔注射灌胃连续 末次灌胃后抽取心主动脉血经灭活处理及微孔过滤或获得半枝莲含药血清 体外培养膀胱癌 细胞株分为无药血清组、半枝莲(低、中、高剂量)组分别对应各组动物血清以无药血清及含 的药物血清培养 使用 法检测细胞增殖情况流式细胞仪检测各组细胞凋亡率及周期分布 酶标仪法检测各药物浓度下细胞的黏附率以蛋白印记免疫法检测凋亡相关蛋白细胞淋巴瘤因子()抗体、关联 蛋白()抗体、胱天蛋白酶()的表达 结结果果:与无药血清组比较半枝莲低剂量组 及 的增殖抑制率及凋亡率、细胞/期、黏附率增加(.)与半枝莲低剂量组比较半枝莲中剂量组 及 的增殖抑制率及凋亡率、细胞/期、黏附率增加(.)与半枝莲中剂量组比较半枝莲高剂量组 及 的增殖抑制率及凋亡率、细胞/期、黏附率增加(.)与无药血清组比较半枝莲低剂量组 相对表达量下降、相对表达量增加(.)与半枝莲低剂量组比较半枝莲中剂量组 相对表达量下降、相对表达量增加(.)与半枝莲中剂量组比较半枝莲高剂量组 相对表达量下降、相对表达量增加(.)结结论论:半枝莲含药血清体外培养膀胱癌 细胞可有效抑制细胞增殖、降低黏附力并能诱导细胞凋亡具有作为抗膀胱癌药物研发的价值关键词 膀胱癌 半枝莲含药血清 凋亡 细胞黏附力中图分类号:.文献标识码:/:.:./()/()/().().()()().:/(.)./(.)./(.).年第卷第期医学理论与实践(.).(.).(.).:.膀胱癌是临床最常见的泌尿系统恶性肿瘤也是全球最普遍的癌症之一 据全球癌症负担统计全世界每年诊断超过 万新发癌症病例其中.的新发癌症诊断和.的癌症死亡是由膀胱癌引起的且随着世界人口结构的变化及各种不同风险因素的变化其发病率和死亡率也随之变化 膀胱癌具有多发性、多器官和易复发的特点即使经规范化治疗仍有较高的复发率且本病的病因复杂涉及基因、蛋白、代谢等因素对癌细胞生长、侵袭、凋亡等生命活动的影响 近年来越来越多的学者从影响癌细胞生命活动方面进行研究以期为膀胱癌的治疗寻找新的方向和靶点 半枝莲为唇形科植物半枝莲的干燥全草中医认为其具有清热解毒、活血化瘀、消肿止痛等多种功效并具有抗癌作用但其具体的抗癌机制及对膀胱癌细胞的作用仍有待进一步探究 本研究使用膀胱癌 细胞株研究半枝莲含药血清对其凋亡及黏附力的影响为半枝莲在膀胱癌中的治疗研究提供参考材料与方法.实验材料.实验动物与细胞 级雄性 大鼠(中山大学粤)体重 周龄人膀胱癌 细胞株(中山大学生命科学院细胞库).药品与试剂 半枝莲提取物(水提物兰州沃特莱斯生物科技有限公司)胎牛血清、培养基(内蒙古奥普赛生物科技有限公司)胰蛋白酶(北京索宝来公司)(二甲基噻唑)四甲基偶氮噻唑蓝()溶液(公司)兔源一抗 细胞淋巴瘤因子()抗体、关联 蛋白()抗体、胱天蛋白酶()蛋白、二抗羊抗兔(英国 公司)流式细胞仪(贝克曼库尔特有限公司中国)/细胞凋亡检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)离心机(赛默飞世尔科技有限公司中国)电热恒温孵育箱(北京福意电器有限公司)倒置荧光显微镜(徕卡显微系统贸易有限公司上海)低温冰箱(中国海尔公司).方法.细胞培养 人膀胱癌 细胞于 胎牛血清、青/链 霉 素 的 培 养 基 置 于、的恒温培养箱中培养 换液 次至细胞融合至 用.胰蛋白酶消化传代.含药血清制备 大鼠适应性饲养 周后编号随机分为无药血清组、半枝莲低剂量组、半枝莲中剂量组、半枝莲高剂量组 只/组半枝莲低、中、高剂量组分别以./()、/()、/()(加入 蒸馏水制成混悬液)灌胃 次/连续灌胃 无药血清组采用蒸馏水灌胃 次/末次灌胃后 将大鼠以/、戊巴比妥钠腹腔注射麻醉固定于手术台使用注射器经右心室抽血室温下静置凝固/离心分离上层血清灭活处理后以.的微孔滤膜无菌过滤后于 冰箱保存.细胞分组及干预 对数生长期人膀胱癌 细胞分为无药血清组、半枝莲低剂量组、半枝莲中剂量组、半枝莲高剂量组以 大鼠血清(各组细胞对应各组大鼠)培养分别于 和 两个时间点采用流式细胞仪检测各浓度下 细胞的凋亡率实验均重复 次.细胞增殖情况 对数生长期 细胞以胰酶消化重悬 个/孔接种于 孔板中恒温培养设置 个复孔加入培养基 于培养、时每孔加入 溶液 在细胞培养箱中继续培养 以酶标仪测定 处吸光度()值 计算细胞增殖抑制率 (对照孔 值 实验孔 值)/对照孔 值 .细胞凋亡情况 对数生长期细胞以胰酶消化重悬 个/孔接种于 孔板中恒温培养流式细胞仪技术检测 细胞的凋亡周期变化.细胞黏附力情况 孔培养板预铺 基质胶每孔/于超净台内风干 孔板中加入含有 的 培养基/孔细胞培养箱内封阻 冲洗加入各组细胞混悬液/孔每组 个复孔培养 弃培养液洗涤去掉未黏附细胞加入 培养基及 溶液各 继续培养 每孔加入 震荡 于酶标仪上检测 波长处的吸光度()值 细胞黏附率 (对照孔 值 实验孔 值)/对照孔 值 .凋亡相关蛋白表达 取各组培养 后的 细胞 洗涤 离心收集上清 环境下/离心 弃上清液提取细胞蛋白加入上样缓冲液混匀水浴变性检测蛋白浓度以 电泳转膜 脱脂奶粉封闭 医学理论与实践 年第卷第期 洗涤加入、及内参蛋白 一抗孵育液孵育过夜 洗涤加入二抗孵育 洗涤显色、成像使用 软件分析目的蛋白条带灰度值.统计学方法所有实验数据均采用.软件进行分析符合正态分布计量资料使用 表示数据比较为独立样本 检验多组计数资料比较采用方差分析组间比较采用 检验 .表示差异有统计学意义结果.半枝莲含药血清对膀胱癌 细胞增殖影响各组细胞 及 的增殖抑制率比较差异有统计学意义(半枝莲中剂量组 半枝莲低剂量组 无药血清组(.)见表.半枝莲含药血清对膀胱癌 细胞凋亡影响表 各组细胞增殖抑制率比较()组 别 增殖抑制率 增殖抑制率无药血清组.半枝莲低剂量组.半枝莲中剂量组.半枝莲高剂量组.值.值.注:与无药血清组比较 .与半枝莲低剂量组比较.与半枝莲中剂量组比较.各组细胞凋亡率以及细胞周期/期、期、期比较差异有统计学意义(.)凋亡率、/显示:无药血清组 半枝莲低剂量组 半枝莲中剂量组 半枝莲高剂量组(半枝莲低剂量组 半枝莲中剂量组 半枝莲高剂量组(.)见表 表 各组细胞凋亡及周期情况比较()组 别凋亡率/无药血清组.半枝莲低剂量组.半枝莲中剂量组.半枝莲高剂量组.值.值.注:与无药血清组比较.与半枝莲低剂量组比较.与半枝莲中剂量组比较.半枝莲含药血清对膀胱癌 细胞黏附力影响各组细胞黏附率比较差异有统计学意义(.)即无药血清组(.)半枝莲低剂量组(.)半枝莲中剂量组(.)半枝莲高剂量组(.)(.).半枝莲含药血清对膀胱癌 细胞凋亡相关蛋白表达影响各组细胞、相对表达量比较差异有统计学意义(半枝莲低剂量组 半枝莲中剂量组 半枝莲高剂量组(.)、显示:无药血清组 半枝莲低剂量组 半枝莲中剂量组 半枝莲高剂量组(.)见表 表 各组细胞凋亡相关蛋白表达比较()组 别无药血清组.半枝莲低剂量组.半枝莲中剂量组.半枝莲高剂量组.值.值.注:与无药血清组比较.与半枝莲低剂量组比较.与半枝莲中剂量组比较.讨论在恶性肿瘤的发生发展过程中癌细胞的凋亡、侵袭、转移是病情进展及预后不佳的重要因素 凋亡是细胞自身调节的一种机制在肿瘤中发挥重要的调节作用可以防止肿瘤细胞的过度增生和扩散并促进肿瘤细胞的死亡和清除 侵袭和转移是肿瘤增殖生长和远处转移的特性与治疗效果及预后息息相关细胞与其周围基质间的黏附情况是影响其侵袭能力的重要因素 因此促进癌细胞凋亡增加其黏附力从而抑制侵袭、转移在恶性肿瘤的治疗中有重要作用目前靶向治疗为恶性肿瘤的重要治疗方式之一关于膀胱癌的靶向治疗药物有、多韦替尼、厄达替尼等但存在药物安全性及治疗准确性等问题 随着中医药在癌症治疗中研究的深入中草药被证实能从多层面、多环节和多部位发挥明显的多靶点效应成为恶性肿瘤靶向治疗的研究热点半枝莲属中医药中清热解表药物其性温、苦、寒归肺、肾经具有清热解毒、活血化瘀及利水消肿的作用 现代药理研究表明半枝莲中含有黄酮类、二萜类、二萜内酯类及多糖等化学成分具有解热、镇痛、抗癌、抗炎、抗病毒、免疫调节、护肝等多种作用因此被应用于癌症的相关研究 目前关于含有半枝莲的中药复方制剂及半枝莲有效成分的抗癌作用已有较多研究但关于其在人前列腺癌方面的研究较少 张峰等在体外细胞研究发现半枝莲总黄酮能上调迁移侵袭蛋白的表达抑制人胃腺癌细胞的增殖、诱导细胞凋亡提高其放疗敏感性 刘明胜等将半枝莲醇提取物应用于结直肠癌细胞结果表明半枝莲醇提取物能抑制结直肠癌细胞的克隆形成促进凋亡其机制可能与调控/通路有关 亦有相关研究证实半枝莲及其相关提取物在乳腺癌、肝细胞癌中均发 年第卷第期医学理论与实践挥良好的抗癌效果 本研究中与无药血清组比较半枝莲低/中/高剂量组的增殖抑制率、凋亡率且其变化程度与剂量有明显的关系这说明半枝莲含药血清可抑制人膀胱癌 细胞的增殖提高细胞与基质间的黏附力有明显的体外抗膀胱癌活性细胞的凋亡受细胞凋亡调节蛋白和细胞存活调节蛋白平衡的影响 家族蛋白在线粒体介导的内在细胞凋亡途径中有重要作用在癌细胞中属于抗凋亡蛋白其过度表达能增强细胞对细胞毒素的抵抗性抑制多数肿瘤化疗药物引起的靶细胞凋亡 亦属于 家族成员为促凋亡蛋白能引起线粒体外膜的透化触发细胞凋亡细胞中的 蛋白被激活后可释放凋亡信号因子促进细胞凋亡 与 的比值失衡则可造成细胞的过度凋亡或过度增殖影响细胞的发生发展 是保守蛋白质家族中广泛表达的成员能特异性地切割天冬氨酸残基上的肽键引起细胞凋亡是多种细胞动物体内所有凋亡蛋白中的主要执行对象直接参与调控凋亡导致细胞染色质浓缩、被吞噬敏感性增加 本研究中经半枝莲含药血清干预的各组细胞/期、与 相对表达量增加均增加细胞 期、期及 蛋白相对表达量均下降且呈剂量依赖性说明半枝莲含药血清能在体外将膀胱癌 细胞阻滞于/期诱导细胞的凋亡与既往对半枝莲抗癌作用研究的特性相符 赵鸿翔等进行的动物实验表明雄性 大鼠脑室内注射 淀粉样蛋白、三氯化铝及重组人转化生长因子能引起线粒体凋亡因子、及 的异常改变半枝莲黄酮能逆转这一改变可说明半枝莲能通过增加 的表达抑制 的表达促进人膀胱癌 细胞的凋亡抑制其增殖发挥相关抗癌作用综上所述半枝莲含药血清能抑制人膀胱癌 细胞的增殖诱导凋亡提高细胞黏附力可作为抗膀胱癌药物进行研究 本研究的不足之处在于仅从细胞实验方面验证了半枝莲在对人膀胱癌 细胞的抗癌作用后续仍需进一步建立动物皮下移植瘤模型深入进行多机制探讨为膀胱癌的防治研究提供更加全面的参考参考文献 .:.()():.:.():.():.胡宴彬魏瑞波代甜甜等.基于网络药理学和分子对接技术探讨“半枝莲山慈菇”抗乳腺癌的作用机制.现代药物与临床():.林怡彤宋高臣.半枝莲多糖组分抗肿瘤作用和免疫调节的实验研究.中医药信息 ():.代志军王西京薛茜等.半枝莲含药血清对肝癌 细胞凋亡及线粒体膜电位的影响.中西医结合学报():.:.():.():.王彩虹尹宁王柯静等.基于 通路研究半枝莲多糖对宫颈癌移植瘤小鼠肿瘤组织血管生成的作用机制.中药药理与临床 ():.王桂玲费洪荣赵雪梅等.半枝莲和白花蛇舌草药对总黄酮的富集及其抗氧化和抑菌作用.华西药学杂志():.张锋吴震徐宁等.半枝莲总黄酮调控 对人胃腺癌细胞 增殖凋亡和放疗敏感性的作用及机制研究.药物评价研究 ():.刘明胜陈文超蔡颖畅.半枝莲醇提取物调控/对结直肠癌细胞克隆形成和凋亡的影响.中国药师():.牛俊杰胡锦洋王柱.基于 信号转导通路探讨半枝莲石油醚提取物对人三阴性乳腺癌细胞的影响.中医药导报 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