基因综合项目工程知识要点.doc

第一章1.基因工程:是在分子水平上进行遗传操作，指将一种或各种生物体（供体）基因或基因组提取出来，或者人工合成基因，按照人们愿望进行严密设计，通过体外加工重组，转移到另一种生物体（受体）细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新遗传性状技术。2.基因工程基本过程为哪些？切接转增检 获得目基因：从供体细胞分离出基因组DNA，用内切酶将外源DNA切开。切（同步选取运载目基因载体） 目基因与载体DNA拼接：用DNA连接酶将具有外源基因DNA片段接到载体分子上，形成DNA重组分子。 接 重组体分子导入受体细胞：借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中。转 短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞基因组中。 增 筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达基因工程菌或细胞。 检3.哪些基因是真核生物特有？ 假基因：核苷酸序列同其相应正常功能基因基本相似，但却不能合成出功能蛋白质失活基因。 基因家族：由功能有关基因成套组合形成 重复序列哪些是原核生物特有：插入序列。哪些是真核和原核共有：移动基因、重叠基因第二章1. 寄主细胞控制限制与修饰宿主控制限制核酸限制性内切酶宿主控制修饰修饰甲基转移酶以(k)噬菌体侵染E.coli B菌株为例解释寄主控制与修饰现象。（简述寄主控制限制与修饰现象。v 大多数细菌噬菌体侵染都存在着某些功能性障碍。所谓寄主控制限制与修饰现象简称（R/M体系）。R/M体系：寄主是由两种酶活性配合完毕一种是修饰甲基转移酶修饰 另一种是核酸内切限制酶限制R/M体系作用：v 保护自身DNA不受限制；v 破坏外源DNA使之迅速降解；2. 简述型、型和型核酸内切酶基本特性。（1）型酶基本特性 有内切酶活性和甲基化酶活性互斥 需要ATP、SAM（S腺苷甲硫氨酸）和Mg 2+辅助因子； EcoB和EcoK是由三种不同亚基构成。多肽链：特异性亚基，辨认DNA序列活性。多肽链：修饰亚基，具备甲基化酶活性。多肽链：限制亚基：具备核酸内切酶活性 有特定辨认位点 切割方式：结合在辨认位点，以滚环形式沿着DNA分子转位，从距辨认位点5 一侧几千bp处随机切割分子，无特异性。（2） 型酶：有内切酶活性和甲基化酶活性分开反映能辨认专一核苷酸序列，并在固定位置上切割辨认序列核苷酸对顺序呈回文构造（那项具备回文构造：辨认位点DNA序列呈双重旋转对称 ）切割可形成两种核苷酸切割末端粘性末端和平末端。粘性末端定义 ：指DNA分子在限制酶作用下形成具备互补碱基单链延伸末端构造，能通过互补碱基间配对而重新环化起来。（3）型酶： 由两个亚基构成蛋白质复合物，即同步具备内切酶活性和甲基化酶活性 需Mg 2+、ATP、SAM辅助因子可辨认特定碱基顺序，并在这一顺序3端24 26bp处切开，因此它切割位点也是没有特异性4. 同尾酶：指来源不同、辨认靶序列不同但产生相似粘性末端核酸内切酶。运用同尾酶可使切割位点选取余地更大。同裂酶：指来源不同但辨认相似靶序列核酸内切酶。同裂酶进行同样切割，产生同样末端。但有些同裂酶对甲基化位点敏感性不同。星号活性：同一限制酶当某些反映条件变化时酶专一性发生变化，即酶切位点专一性变化活性。包装上标“”注明。5.DNA缺口平移、取代反映概念DNA缺口平移：在DNA分子单链缺口上，DNA聚合酶5 3核酸外切酶活性和聚合伙用可以同步发生。（概念：当外切酶活性从缺口5一侧移去一种5核苷酸之后，聚合酶作用就会在缺口3一侧补上一种新核苷酸，但Pol不能在3-OH和5-P之间形成一种键，随着5一侧核苷酸不断移去， 3一侧核苷酸又按序列增补，缺口便沿着DNA分子合成方向移动。） 用途：通过DNA缺口转移，制备供核酸分子杂交用带放射性标记DNA探针。取代反映：如果在反映混合物中仅存在一种dNTP，则此酶35 外切酶活性将从ds DNA3端降解，直到互补于该dNTP碱基浮现为止，然后在该位置发生合成和取代反映。6.各DNA聚合酶基本特性及其区别；（1）大肠杆菌DNA聚合酶（Pol）酶活性 5 3聚合酶活性：需Mg2+ 5 3外切酶活性：可以从游离5-OH末端水解DNA分子(修复作用) 3 5外切酶活性（较低）：从DNA链3-OH末端向5水解DNA(校对作用)用途：重要功能参加DNA合成，起到修复作用；Pol同DNA分子克隆关系最为密切。（2）PolKlenow片断 53聚合酶活性； 35 外切酶活性 无53 外切酶活性。Klenow片断重要用途： 修补经限制酶消化DNA所形成3隐蔽末端； 标记DNA片断末端； cDNA克隆中第二条链cDNA合成； DNA序列测定。（3）Pol（参加DNA修复过程）酶活性： 53聚合酶活性：规定模板是双链DNA，中间有空隙单链DNA某些，且空隙某些不长于100 bp； 具备35 外切酶活性，无53 外切酶活性； 重要在DNA损伤修复中有一定作用（4）Pol 聚合伙用：是细胞内DNA复制所必须； 35 外切酶活性，底物是单链DNA； 53 外切酶活性，底物是单链DNA。（5）T4 DNA聚合酶 53聚合酶活性； 35 外切酶活性； 无53 外切酶活性； 取代反映:在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止；（6）T7 DNA聚合酶 53聚合酶活性； 35 外切酶活性（是klenow片段1000倍）； 无53 外切酶活性；（7）耐热DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）（选取题） 具耐高温特性，最适活性温度为72，持续保温30min仍有活性，一次加酶即可满足PCR反映全过程需求； Mg 2+依赖酶；具备聚合酶活性；具备53 外切酶活性，无35 外切酶活性 SDS完全抑制其酶活性。（8）反转录酶依赖RNADNA聚合酶。 多肽链具备反转录酶活性和RNase H活性； 多肽链具备以RNA-DNA杂交分子为底物53脱氧核酸外切酶活性。 以mRNA为模板合成cDNA；在反转录酶作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条cDNA。7.连接酶所需条件供能分子、磷酸基团和羟基。概念：可以催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键酶。即可以将DNA链上彼此相邻3-羟基（ OH ）和5-磷酸基团（-P），在供能分子作用下，形成磷酸二酯键。需要三种成分参加：3-OH，5-P，提供能量分子供能分子：NAD+（烟酰胺腺嘌呤二核酸）在E.coli等细菌中选用ATP（腺苷三磷酸）动物细胞、噬菌体中选用注： 只能连接缺口（nick）； 不能连接裂口（gap）； 并且被连接DNA链必要是双螺旋DNA分子一某些。8.缺口：在双链DNA某一条链上两个相邻核苷酸之间失去磷酸二酯键所浮现单链断裂。裂口：在双链DNA某一条链上失去一种或数个核苷酸所形成单链断裂。9、碱性磷酸酶：将DNA末端5端磷酸基除去，使其5端变成3羟基，能防止自身环化。作用：（1）去除DNA和RNA5”-磷酸基，然后在T4多聚核苷酸激酶催化下，用32PATP进行末端标记，继而进行序列分析。（2）去除载体DNA5”-磷酸基，防止自身环化，减少本底，提高重组DNA检出率。 发夹构造：10、末端转移酶特性： 催花dNTP添加到3-OH端，且不需模板； 需Co 2+。用途： 给载体或cDNA加上互补同聚尾； 标记3末端。第三章1、基因载体：离开染色体外源DNA不能复制，而插入外源DNA可作为复制子一某些在受体细胞中进行复制，这种复制子就是外源基因载体。 2、报告基因：有特殊意义基因，重组子转入宿主细胞中，可根据报告基因从其她细胞中辨认区别甚至挑选出来。2、载体应具备特性： 能在宿主细胞内进行独立和稳定DNA自我复制，插入外源基因后，仍保持稳定复制状态； 易于从宿主细胞中分离，并行纯化； 载体DNA序列中有单一酶切位点，并位于DNA复制非必须区内； 具备可以观测表型特性，如报告基因（遗传标记），插入外源DNA后，这些特性可以作为重组DNA选取标志。3、载体致死效应：运用载体进行克隆时，有时也许对大量克隆化基因和克隆化基因产物也许有害，宿主细胞呈现致死效应。如大量表达目蛋白不利于宿主繁殖，使其致死。3、R1质粒和Col E1-K30质粒R1质粒Col E1-K30E.Coli中严紧型松弛型奇异变形杆菌中松弛型严紧型4、质粒构型：常用构型：SC L OCA. 共价闭合环形DNA(cccDNA):呈现超螺旋SC构型B. 开环DNA(ocDNA):即OC型。C. 线性DNA(lDNA):即L型。依照寄主细胞所含拷贝数多少质粒分为严紧型和松弛型。5、质粒种类F质粒：又叫F因子、性质粒或致育质粒。是最具代表性单拷贝接合型质粒，共编码着19个转移基因。R质粒：又称抗药性因子，它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因。Col质粒：产生大肠杆菌素因子，编码有控制大肠杆菌素合成基因。属非结合质粒。6、Col E1质粒迁移作用：由共存接合型质粒引起非接合型质粒转移过程。其中参加迁移有两种基因：bom 基因：位于Col E1DNA上特异位点mob 基因：Col E1质粒特有，其编码核酸酶作用于bom位点7、细菌质粒不相容性在同一种大肠杆菌细胞，普通不能同步具有两种不同质粒。也称为质粒不亲和性。是指在没有选取压力状况下，两种亲源关系密切不同质粒，不可以在同一种寄主细胞系中稳定地共存现象。8、质粒报告基因应用类型：插入失活效应；互补简述如何应用插入失活和-互补（蓝白筛选）来筛选重组子pBR322质粒载体有:抗氨苄青霉素基因(ampr);抗四环素基因(tetr) 互补：LacZ（半乳糖苷酶基因）有两个重要亚基，亚基 和 亚基， 与 相结合就能体现出半乳糖苷酶活性，能将无色底物X-Gal 变成蓝色。片段基因coli基因组 - 肽基因质粒 将具有- 肽质粒转化到coli上（ - 互补），形成蓝色菌落； 插入外源基因，使- 肽编码区被破坏，LacZ失活则形成白色菌落。 运用- 互补（蓝白斑筛选）进行重组子筛选。9、如何对质粒进行人工改造，使其成为载体。（1）减小分子量：可容纳外源DNA更长；（2）改造内切酶位点，具备若干限制酶切单一位点多克隆位点（人工合成且密集排列）；（3）插入外源基因后，较易导入宿主菌内复制和表达，且不会因接触而转移到另一种细菌；（4）具备一种或几种报告基因。克隆载体：复始起始点、遗传标记、多克隆位点10、pBR322和pUC质粒各构成某些来源分别是什么？（1）pBR322重要构成某些来源 亲本：pMB1和pSF2124 ； ampr基因来源于pSF2124； tetr基因来源于Psc101； 复制起点（ori）Col E111、穿梭质粒：是指一类由人工构建具备两种不同复制起点和选取记号，因而可在两种不同寄主细胞存活和复制质粒载体。专 题 核酸分子提取及核酸凝胶电泳2、简述提取质粒DNA 原理及环节。碱变性法原理：运用染色体DNA与质粒DNA变性与复性差别而达到分离目。环节：材料准备 破碎细胞或包膜，使内容物释放 核酸分离、纯化沉淀或吸附核酸，去除杂质 核酸溶解在适量缓冲液或水中3、如何防止RNase污染？ 塑料器皿用0.1%DEPC水溶液浸泡12h以上，高温灭菌后，180烘干6h以上。 在超净工作台上操作。 操作时带一次性手套和口罩。 提取缓冲液中加入RNase抑制剂。1、温和噬菌体：既可引起宿主细胞裂解死亡，又可将其核算整合到细菌染色体上，使细菌细胞继续生长繁殖，并被溶溶原化噬菌体。 烈性噬菌体：将噬菌体感染记住细胞转变成为噬菌体“制造厂”，能产生出大量子代噬菌体。溶原化：用温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌过程。噬箘粒：由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成新型载体系列，称为噬菌粒载体。柯斯质粒：一类由人工构建具有DNAcos序列和质粒复制子特殊类型质粒载体。载体，也称粘粒、柯斯载体。4、PAGE、琼脂糖凝胶电泳和脉冲电泳区别及其应用范畴。电泳技术用途区别琼脂糖凝胶电泳检测总DNA或总RNA完整性、对PCR产物进行检测以及对核酸进行回收和纯化辨别100bp50kb核酸片段聚丙烯酰胺凝胶电泳生物多样性检测以及亲子鉴定等辨别1bp1000bp核酸片段脉冲电场凝胶电泳分离大分子量DNA分子辨别 50kb核酸片段2、噬菌体繁殖方式 溶菌性方式：噬菌体运用宿主酶类和原料，DNA复制成子代DNA，并装配呈子代噬菌体，最后裂菌，释放出许多新噬菌体。 溶源性方式：感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体DNA上，成为细菌DNA一种构成某些。3、噬菌体类型及体外包装程序（二）体外包装程序 包装反映底物，按照滚环复制机理合成多连体形式DNA，在具备噬菌体头部前体条件下，从cos位点处被切割成单体分子。 将线性单体分子装填到头部外壳里，由于具备粘性末端而发生环化。 把头部和分别组装尾部构造连成一体，形成成熟噬菌体颗粒。4、M13 载体长处和用途;长处： 只含单链DNA，因而可用作对DNA测序模板及其他基因克隆实验，如异源双链DNA分析，互补RNA分离及DNA序列分析等； 可用来产生单链DNA探针以选取和分离互补RNA； RF型是双链DNA，便于限制酶辨认和切割； RF型DNA经包装后分泌到细胞外而不溶菌； 不存在包装限制问题。用途： 制备测序用单链DNA模板； 用于制备杂交探针； 用于定点突变。6、质粒、 噬菌体和柯斯质粒包装限制。（1）噬菌体包装能力控制在为野生噬菌体DNA长度（约48.5 kb）75%-105%。 蛋白质外壳容纳DNA能力 噬菌体载体克隆外源DNA能力（2）柯斯质粒：可运用噬菌体体外包装特性进行体外包装，运用噬菌体感染方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA形式存在于细胞内。克隆外源基因可达45kb，比噬菌体大许多。由于包装限制缘故，存在最低限值（30kb）。:噬箘粒特点： 噬菌粒载体分子量较小，约3000bp； 既有质粒复制起点又有噬菌体复制起点。在寄主内，可以按正常双链质粒DNA形式复制，形成双链DNA既稳定又高产，具备常规质粒特性（选取性标记、多克隆位点等 在辅助噬菌体存在下，可进行噬菌体繁殖，产生单链子代噬菌体，包装成噬菌体颗粒后被挤出寄主细胞。 用噬箘粒克隆DNA进行测序，免除从质粒到噬菌体这一亚克隆环节。（分子量小、克隆能力大；能稳定遗传；可用来制备单、双链DNA。）（一）聚合酶链式反映（PCR）1、 原理：双链DNA分子在临近沸点温度下加热时便会分离成两条单链DNA分子，然后DNA聚合酶以单链DNA为模板，引物与互补DNA结合后，经单链杂交复性，并运用反映混合物中四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）按53方向将引物延伸，合成新生DNA互补链。2、 反映过程：模板DNA变性：模板DNA经加热至94左右一定期间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反映作准备； 模板DNA与引物退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链互补序列配对结合；引物延伸：DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶作用下，以dNTP为反映原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保存复制原理，合成一条新与模板DNA 链。 变性：通过热解决将待扩增模板双链DNA变性裂解成单链DNA; 退火：减少温度，使单链靶序列与寡核苷酸引物杂交结合； 延伸：在恰当条件下，DNA聚合酶使引物延伸，产生新双链。723、反映体系和反映条件PCR反映体系：模板：DNA；引物：P1 P2；DNA聚合酶：Taq；原料：dNTP；反映缓冲液；辅助因子：Mg2+Mg2+ 作用：Mg2+是DNA聚合酶激活剂。适当浓度为0.5-2.5mmol/L反映体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反映特异性。 Mg2+可与负离子结合,因此反映体系中dNTP、EDTA等浓度影响反映中游离Mg2+浓度。4、 引物二聚体：一条引物在另一条引物序列上进行延伸所形成与二条引物长度相近双链DNA片段。（引物之间或引物自身存在互补序列）7、Southern 杂交原理毛细管作用：用限制性内切酶将DNA消化成一定大小片段，用琼脂糖凝胶电泳分离消化片段，再用毛细管转移等办法将变性DNA片段转移到滤膜上，然后用标记ssDNA（单链DNA）或RNA探针对固定在滤膜上DNA进行杂交。操作程序：用凝胶电泳分离DNA片段 用碱变性也预解决凝胶，并将其放在两端浸在缓冲液中滤纸上 在凝胶上覆盖一张滤膜 滤膜上加一叠干滤纸，并放上重物 稳定DNA片段，并用X光胶片曝光后得放射自显影照片，并与凝胶谱带比较为什么在转移之前需要进行碱变性解决凝胶？使DNA片段保持单链状态而易于同探针分子发生杂交作用。8、Southern用途：（1）掌握DNA分子中基因编码区大小和位置；（2）构建DNA分子遗传图（3）分析基因组DNA消化片段、互有关系及长度多样性（4）转基因生物基因组中外源基因整合及整合位点鉴定（5）基因操作过程中复杂基因构件分析鉴定Nornthern blotting（RNA印迹杂交）用途; 检测真核基因转录水平、转录子分子大小及相对丰度；是研究真核细胞基因表达强有力手段。注意：防止RNA降解8、原位杂交（菌落或噬菌斑杂交）概念及原理：生长在培养基平板上菌落或噬菌斑，按照其本来位置不变地转移到滤膜上，并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用。 第六章 基因文库构建一、基因文库概念基因文库：将某种生物所有基因组遗传信息贮存在可以长期保存稳定重组体中，以备需要时可以随时应用它分离所需要目基因，这种保存基因组遗传信息材料称为基因文库。注：基因文库与基因库区别2. cDNA文库:指某生物某一发育时期所转录mRNA所有经反转录形成cDNA片段与某种载体连接而形成克隆集合。与基因组文库区别：cDNA文库不含非转录基因组序列一、cDNA文库特性 不含真核基因间隔序列及调控区，不是真正意义上基因； 仅包括某种组织或细胞正在表达基因； 基因总量比基因组文库小得多，易于筛选克隆； 具备时效性，在转录水平上反映该生物在某一特定发育时期，某一特定组织在某种环境条件下基因表达状况，不能涉及该生物体所有基因。二 三种分离mRNA办法（1） 老式分离办法是用oligo (dT)-纤维素柱分离总RNA；（2）把oligo(dT) -磁珠同总RNA混合，在强磁场下分离mRNA（3）用蔗糖梯度离心mRNA核糖体复合体（溶解细胞）来分离mRNA2、 cDNA 合成:第一链合成：mRNA，反转录酶 oligo(dT) 核酸末端转移酶，dNTPs： 1. oligo(dT) 引导cDNA合成法 2. 随机引物引导cDNA合成法第二链合成：用RNaseH酶降解mRNA-DNA杂交分子中mRNA，加入聚合酶，以第一条cDNA链为模板，降解mRNA段片段为引物合成第二链。三 cDNA文库构建程序： （1）分离细胞总RNA，从中纯化出重要含mRNA分部；（2）合成第一链cDNA； （3）将mRNA-DNA杂交分子转变成双链cDNA分子；（4）将合成双链cDNA重组到质粒载体或噬菌体载体上，导入大肠杆菌寄主细胞增殖。（三） cDNA克隆优越性 以mRNA为材料；（某些RNA病毒，不通过DNA中间体，对其研究，cDNA是唯一可行办法） cDNA文库筛选比较简朴易行； 由于每一种cDNA克隆都具有一种mRNA序列，在选取中浮现假阳性几率比较低； 克隆在细菌中表达基因，用作基因序列测定和发育过程中或组织中基因特异表达 一、应用mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）原理： 用3 -端锚定引物和反转录酶合成cDNA第一链；用3 -端锚定引物和5-端10-mer随机引物构成引物对，以反转录第一链为模板进行PCR扩增（DDRT-PCR），在原则序列胶中电泳23小时，可显示出50100条长度在1005000bp之间DNA条带。2. 建立文库目，应用范畴目： 便于目基因保存、扩增和纯化； 分离克隆目基因重要途径； 是复杂基因组作图重要根据。应用范畴： 研究基因构造、功能和筛选基因工程目基因； 基因定位、基因调控等方面研究。第七章 目基因制取2. 保护基团作用保证合成反映可以定向地进行，将不需要参加反映基团，用保护基选取性地保护起来，以获得特定序列。（二） 磷酸三酯法原理 对于参加缩合反映带5端保护基团单核苷酸，其磷酸分子中一种-OH基团已带上恰当保护基团。余下另一种具备活性-OH与另一种带有3端保护基团单核苷酸5 -OH缩合形成具磷酸三酯键二核苷酸分子。（四）用寡核苷酸片段组装基因方式1. 小片段粘接法： 将待合成目基因提成若干小片段，每段长1215bp，两条互补链分别设计成交错覆盖两套小片段，然后通过化学办法合成，并退火形成双链DNA大片段。小片段粘接法：依照目基因全序列，分别合成12-15碱基长单链DNA小片段 长处： 化学合成DNA片段小，收率高；缺陷： 各段互补序列较短，易在退火时发生错配。2. 补丁延长法 将目基因一条链提成若干4050bp大小片段，另一条链设计成与上述大片段交错互补小片段（约20bp补丁）。两组不同大小DNA单链片段退火后，用klenow酶将空缺某些补齐，最后用T4 DNA连接酶修复缺口补丁延长法： 依照目基因两条互补链全序列，分别合成20碱基长单链DNA小片段以及40-50碱基长单链DNA中片段长处：化学合成与酶促合成相结合办法 减少寡聚核苷酸合成工作量； 能保证互补序列足够长度。3. 大片段酶促法 将目基因两条链均提成40-50bp单链DNA片段，分别进行化学合成，然后用klenow和T4 DNA连接酶补平。长处：减少拼接模块数，合用于较大目基因合成。大片段酶促法：依照目基因全序列，分别合成40-50碱基长单链DNA片段上述三种办法各有利弊：化学合成DNA单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成分额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目基因时，虽然化学合成分额相对较小，成本较低，但大片段化学合成收率极低，例如，每聚合一种单体产物收率为95%则合成50个碱基长DNA单链大片段总收率只有7.7% 。四基因组装：按设计规定用许多寡核苷酸片段装配成完整基因过程。（三）固相亚磷酸三酯法操作环节：第八章 DNA体外重组与基因转移体外重组：靠DNA连接酶将恰当切割DNA即目基因与 其载体共价连接。一 体外连接DNA片段办法： 用DNA连接酶连接具备互补粘性末端DNA片段。 用T4 DNA连接酶直接将平末端DNA片段连接起来，或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具备平末端DNA加上poly (dA) - poly (dT)尾巴后，再用DNA连接酶将它们连接起来。 先在DNA片段末端加上化学合成衔接物或接头，使之形成粘性末端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。3. 亚克隆 ：把DNA片段从某一类型载体无性繁殖到另一类型载体过程称为亚克隆。用细菌碱性磷酸酶或小牛肠碱性磷酸酶酶切后质粒，碱性磷酸酶能水解5-磷酸基团产生 5-OH。4.衔接物是指用化学办法合成一段由10 12 bp构成，具备一种或数个特定限制酶辨认和切割序列平末端双链寡核苷酸短片段。2. 衔接物进行平末端链接程序：用连接酶将衔接物连接到外源片段两端-用限制酶酶切成粘性末端-连接酶连接（2）DNA接头： 它是一类人工合成一头具备某种限制酶粘性末端另一头为平末端特殊双链寡核苷酸短片断。1. 定向克隆：使外源DNA片段定向插入到载体分子克隆方案。3.定向克隆连接方式： 经酶切后得到黏端连接（粘-粘连接） 外源DNA与载体DNA一侧为黏端，另一侧为平末端（粘-平连接）（三）平-粘端连接法 添补法：对5突出黏端补齐： 用klenow酶补齐后，用碱性磷酸酶解决防止自身环化。 消除法：对3突出末端削平：用T4 DNA聚合酶35外切酶活性削平（四） 平-平端连接法用核酸连接酶给平末端加入一小段DNA序列后，成为粘端 ，再用DNA连接酶进行连接。办法：（3）同聚物加尾法末端脱氧核苷酸转移酶： 能催化5脱氧核苷三磷酸进行53方向聚合伙用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子3-OH末端。它不需要模板，可以用具有3-OH DNA片段为引物，在3-OH端加入核苷酸达几百个。 它作用底物可以是具备3-OH末端单链DNA,也可以是具备 3-OH突出末端双链DNA四 细胞转化：指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株DNA，而导致性状特性发生遗传性变化生命过程。五大肠杆菌是基因工程重要实验菌株，用CaCl2溶液解决大肠杆菌，诱导其呈现感受态。 六.转化：感受态E.coli细胞捕获和表达质粒载体DNA分子生命过程。 转染：感受态E.coli细胞捕获和表达噬菌体载体DNA分子生命过程。1. 宿主菌规定： 感受态细胞； 需经一定办法解决后，具备接受外源DNA能力E.coli。 限制性内切酶缺陷型，外源DNA进入受体菌不至于被降解； DNA重组缺陷型，可以并保持外源DNA在受体内完整性； 符合安全原则，不适于非培养条件下生存。七 体外包装转染法:使用体外包装体系特殊转导技术将外源重组DNA分子导入寄主细胞办法。2. 受体细菌感受态感受态：是细菌吸取转化因子生理状态。办法：CaCl2解决，增长细胞膜通透性，便于基因进入细胞。二、 外源目基因向真核细胞转入（一）借助载体基因转移 惯用重组动植物病毒或反转录病毒。(二）脂质体导入法 重要用于动物细胞或植物原生质体。（三）血影细胞介导法 哺乳动物红细胞（四）电穿孔转移法 重要用于叶绿体或线粒体基因工程操作（五）基因枪法 重要用于植物细胞转染（六）微注射法 重要用于动物细胞或植物原生质体，第九章重组体鉴定与文库筛选一插入失活效应:将外源基因片段插入到载体后，会使某些选取记号基因（报告基因）失活现象。1.抗药性记号插入失活选取法 外源DNA片段插入到载体Tetr 基因，使其失活； 将该重组子转化给大肠杆菌Amps Tets 菌株，并涂布在Amp琼脂平板上，可获得该质粒和重组子寄主细胞均可长成菌落； 将Amp琼脂平板上菌落原位影印在Tet琼脂上生长，对比这两个平板菌落生长状况，凡在Amp平板上生长而在Tet平板上不能生长菌落，即带有重组体质粒阳性克隆； 挑出阳性克隆，扩增分离带有外源DNA插入片段重组体质粒。第十章 外源基因表达一外源基因在大肠杆菌中表达对的表达基本条件 外源基因不能带有间隔序列，因而必要用cDNA或全化学合成基因，而不能用基因组DNA； 必要运用原核细胞强启动子和SD序列等调控元件控制外源基因表达； 外源基因与表达载体连接后，必要形成对的开放阅读框架； 通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指引宿主菌酶系统合成外源蛋白； 运用宿主菌调控系统，调节外源基因表达，防止外源基因表达产物对宿主菌毒害。（1） 原核表达系统惯用强启动子：lac(乳糖启动子)、trp(色氨酸启动子)、PR (噬菌体右向启动子) 、PL (噬菌体左向启动子) 、tac (乳糖和色氨酸启动子)二影响翻译效率因素：SD序列与rRNA 16 S亚基3端序列互补限度；AUG(ATG)是首选起始密码子。 SD序列与翻译起始密码子之间距离； SD序列是与核糖体16S rRNA互补结合位点，该序列至少具有AGGAGG序列中4个碱基； 起始密码子之后一种核苷酸对mRNA与核糖体结合有影响； 基因末端转录终结区影响。三 分泌表达：可通过基因工程办法（构建分泌型载体）分泌到大肠杆菌细胞膜外周质中，为随后目表达产物纯化提供了便利。（四）融合蛋白 是指蛋白质N端由原核DNA序列或其她DNA序列编码，C端由真核DNA完整序列编码；蛋白质有一条短原核多肽或具备其她功能多肽和真核蛋白质结合在一起，称为融合蛋白。2、融合蛋白与单独表达外源蛋白相比具备长处稳定性好含原核细胞多肽，是避免细菌蛋白酶破坏最佳办法；表达效率高；较易于分离纯化。（五）大肠杆菌表达系统特点长处：原核生物大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。 基因组构造简朴，便于基因操作和分析。多数原核生物细胞内具有质粒或噬菌体，便于构建相应表达载体。 生理代谢途径及基因表达调控机制比较清晰。缺陷：不具备真核生物蛋白质加工系统，表达产物无特定空间构相。 内源蛋白酶会降解表达外源蛋白，导致表达产物不稳定。（六） 运用融合蛋白形式在大肠杆菌中表达长处(1) 外源基因被连接到可供融合蛋白C端编码序列之后，不需此外设计SD序列。(2) 融合蛋白较稳定，不易被细菌蛋白酶水解。（3）表达分泌蛋白防止宿主菌对表达产物降解，减轻宿主细胞代谢负荷及恢复表达产物天然构象最有力办法。(4) 通过融合蛋白为蛋白纯化提供便利。可运用针对原核某些单抗进行亲和层析，便于纯化。(5) 通过融合表达方式促使产物以包涵体形式表达，产物表达量较高。(6) 通过融合表达使产物以可溶性方式表达。四、提高克隆基因在大肠杆菌中表达效率途径1、外源基因需要满足条件通过表达载体将外源基因导入寄主，并指引寄主酶系统合成外源蛋白；外源基因不含内含子； 外源基因必要与表达载体连接成对的阅读框架； 运用宿主菌调控系统，防止外源基因表达产物对宿主菌毒害。2、提高外源基因表达水平办法： 提高翻译水平（1）调节SD序列与ATG之间距离 （2）用点突变办法变化某些碱基（3）增长mRNA稳定性提高表达蛋白稳定性 ：（1）表达融合蛋白 （2）采用某种突变菌株 （3）表达分泌蛋白 一、 与原核表达体系相比，真核细胞表达系统特点是什么？ 真核细胞可辨认并切除外源基因内含子，从而成功表达目多肽，不必想原核细胞表达体系那样从mRNA制备cDNA； 真核基因在真核细胞中表达时，其SD序列与16S rRNA 3末端互补限度较高，对翻译水平调节有利； 在真核细胞内，由外源基因表达蛋白质可被糖基化，成为糖蛋白，有助于保持或提高免疫原性； 外源基因导入真核细胞效率较低，其在染色体DNA上整合是随机和自发，当前无法控制整合位置和恰当拷贝数； 真核细胞培养规定较高，大量生产比较困难，成本也高。