基因综合项目工程原理.doc

基因工程原理内容提纲1. 基因工程又称基因操作、重组DNA技术，是P. Berg等于1972年创立。基因工程技术涉及基本过程涉及“切、连、转、选”。该技术有两个基本特点分子水平上操作和细胞水平上表达。 2. 基因工程中使用各种工具酶，涉及限制性内切核酸酶、DNA连接酶和其她某些参加DNA合成与修饰酶类。 3. 限制性内切核酸酶是基因工程中最重要工具酶，属于水解酶类。依照限制性内切核酸酶作用特点，被分为三大类。类限制性内切核酸酶是基因工程中最惯用酶，该类酶分子量小，专一性强,切割方式有平切和交错切，作用时需要Mg+作辅助因子，但不需要ATP和SAM。第一种被分离类酶是Hind 。 4. 连接酶是一类用于核酸分子连接形成磷酸二酯键核酸酶，有DNA连接酶和RNA连接酶之分。基因工程中使用连接酶来自于原核生物，有两种类型DNA连接酶E.coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶。基因工程中使用重要是T4DNA连接酶，它是从T4噬菌体感染E.coli中分离一种单链多肽酶，既能进行粘性末端连接又能进行平末端连接。 5. 载体是能将分离或合成基因导入细胞DNA分子，有三种重要类型质粒DNA、病毒DNA、科斯质粒，在这三种类型基本上，依照不同目，浮现了各种类型改造载体。 6. DNA重组连接办法大体分为四种：粘性末端连接、平末端连接、同聚物接尾连接、接头连接法。粘性末端连接法是最惯用DNA连接办法,是指具备相似粘性末端两个双链DNA分子在DNA连接酶作用下，连接成为一种杂合双链DNA。平末端连接是指在T4 DNA连接酶作用下，将两个具备平末端双链DNA分子连接成杂种DNA分子。同聚物加尾连接就是运用末端转移酶在载体及外源双链DNA3端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工粘性末端，外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC)，然后在DNA连接酶作用下，连接成为重组DNA。这种办法可合用于任何来源DNA片段，但办法较繁，需要核酸外切酶、S1核酶、末端转移酶等协同作用。将人工合成或来源于既有质粒一小段DNA分子(在这一小段DNA分子上有某种限制性内切酶辨认序列)，加到载体或外源DNA分子上，然后通过酶切制造黏性末端办法称为接头连接法。 7. 基因文库分为基因组文库、cDNA文库等，是指在一种载体群体中，随机地收集着某毕生物DNA各种克隆片段，抱负地包括着该物种所有遗传信息。 8. DNA重组分子在体外构建完毕后，必要导入特定受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接变化其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子转化。当前惯用诱导感受态转化办法是CaCl2 法（图3-20），此外也可以用基因枪等办法转化外源DNA。 9. 重组体筛选有遗传学办法、核酸杂交筛选法等。 10. 基因工程技术是当代生物技术核心，当前在工业、农业和医疗中已经显示了巨大应用前景，并形成了一大批生物技术产业。基因工程是以分子遗传学为理论基本，以分子生物学和微生物学当代办法为手段，将不同来源基因(DNA分子)，按预先设计蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以变化生物原有遗传特性，获得新品种，生产新产品；或是研究基因构造和功能，揭示生命活动规律。 基因工程技术诞生于20世纪70年代初，它是一门崭新生物技术科学，它创立和发展使生命科学产生了一次重大奔腾，证明并实现了基因可操作性，使人类从简朴地运用天然生物资源走向定向改造和创造具备新品质生物资源时代。 基因工程技术诞生至今已经获得了辉煌成就，成为当今生命科学研究领域中最有生命力和最引人注当前沿学科之一，基因工程也是当今新产业革命一种重要构成某些。第一节 基因工程技术诞生 基因工程又称基因操作(gene manipulation)，重组DNA(recombinant DNA)技术，是70年代发展起来遗传学一种分支学科。一、基因工程技术诞生 1972年，P. Berg等在PNAS上刊登了题为“将新遗传信息插入SV40病毒DNA生物化学办法：具有噬菌体基因和 E.coli 半乳糖操纵子环状 SV40DNA”，标志着基因工程技术诞生。 SV40病毒是猿猴病毒，是一种直径为450球形病毒，分子量为28106道尔顿。SV40DNA是环状双链构造，全长5243个碱基对，编码三个衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和一种T抗原。SV40DNA上有一种限制性内切酶E.coR切点。 Berg等一方面用化学办法构建了一种二聚体环状SV40DNA(图3-1)。 图3-1 重组SV40二聚体构建(引自 Berg et. al,1972)当时所用连接办法是同聚物谱尾法，重组体鉴定重要是通过电子显微镜比较分子量大小。 当获得二聚体SV40DNA后，Berg等就证明了环状DNA被内切酶切成线性DNA后可以重新环化，并且可以同此外分子重组。于是她们进行第二步实验就是从 dvgal DNA中制备具有 E.coli 半乳糖操纵子DNA，用上述同样办法进行重组连接，并获得成功。 Berg等工作是人类第一次在体外给遗传物质动手术，标志着一种新时代到来，为此她获得了1980年诺贝尔化学奖。二、基因操作基本过程 和特点基因工程操作可用图3-2表达 图3-2 基因工程基本过程(引自Old & Primrose,1980)它所涉及过程可用“分(合成)、切、连、转、选、鉴”六个字表达。分(合成)指DNA制备，涉及从生物体中分离或人工合成。分离制备或合成制备DNA办法均有诸各种。切即在体外将DNA进行切割，使之片段化或线性化。 连即在体外将不同来源DNA分子重新连接起来，构建重组DNA分子。 转即将重组连接DNA分子通过一定办法重新送入或细胞中进行扩增和表达。 选从转化全群体中将所需要目克隆挑选出来； 鉴就是进行对筛选出来重组体进行鉴定，由于有些重组体并非是所需要，必须通过度析鉴定。 基因工程有两个基本特点分子水平上操作和细胞水平上表达。遗传重组是生物进化推动力，自然界中发生遗传重组重要是靠有性生殖。基因工程技术诞生使人们可以在试管里进行分子水平上操作，构建在生物体内难以进行重组，然后将重组遗传物质引入相应宿主细胞，让其在宿主细胞中进行工作。这事实上是进行无性繁殖，即克隆，因此基因工程普通有称为基因克隆。第二节 限制性内切核酸酶 外科医生给患者动手术需要手术刀，基因工程师们给DNA分子(基因)动手术需要分子手术刀，这就是工具酶。基因工程中使用工具酶诸多，涉及限制性内切核酸酶、DNA连接酶和其她某些参加DNA合成与修饰酶类，最重要是限制性内切核酸酶。基因工程上把那些具备辨认双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链构造核酸内切酶统称为限制性内切核酸酶。一、限制性内切核酸酶发现1952年Luria、Human在T偶数噬菌体、1953年weigle、Bertani在 噬菌体对大肠杆菌感染实验中发现了细菌限制和修饰现象。正是对限制和修饰现象进一步研究，导致限制性内切核酸酶发现。噬菌体在某一特定细菌宿主中生长能力，取决于它最后在其中繁殖细菌是什么菌株。 例如，将A噬菌体从一株大肠杆菌转移到此外一株，其生长效率往往会削弱，对这两个菌株滴 定度可差好几种数量级。第二个菌株释放噬菌体能百分之百再感染同类菌株，但是若先将它们感染本来宿主菌，再将释放子代噬菌体重新感染第二个菌株时，感染率要大大下降。此种现象即为宿主控制限制作用(hostControlled restriction)。用放射性同位素标记噬菌体进行实验成果表白，在受感染宿主细胞中，噬菌体生长限制伴有噬菌体DNA迅速降解，然而，用作繁殖噬菌体感染宿主菌株并不导致类似噬菌体DNA降解。如果某一细菌细胞具备一种能选取性降解来自侵染病毒(或其她来源)核酸酶，那么，它必要能将这种外来DNA同它自己DNA区别开来，之因此可以如此，乃是通过稍 为宿主控制修饰作用(host-controlled modification)。 因而，限制(restriction)作用是指细菌限制性核酸酶对DNA分解作用，限制普通是指对外源DNA侵入限制。修饰(modification)作用是指细菌修饰酶对于DNA碱基构造变化作用(如甲基化)，经修饰酶作用后DNA可免遭其自身所具备限制酶分解。到20世纪60年代中期，科学家推测细菌中有限制修饰系统(restrictionmodification system R-M system)。该系统中有作用于同一DNA两种酶，即分解DNA限制酶和变化DNA碱基构造使其免遭限制酶分解修饰酶，并且，这两种酶作用于同一DNA相似部位。普通说来，不同种细菌或不同种细菌菌株具备不同限制酶和修饰酶构成限制-修饰系统。 1968年，Meselson从Ecoli K株中分离出了第一种限制酶EcoK，同年Linn和Aeber从 Ecoli B株中分离到限制酶EcoB。遗憾是，由于EcoK和EcoB这两种酶辨认和切割位点不够专一，在基因工程中意义不大。 1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种限制性酶，可以特异性地切割 DNA，这个酶日后命名为Hind，这是第一种分离到类限制性内切核酸酶。由于此类酶辨认序列和切割位点特异性很强，对于分离特定DNA片段就具备特别意义。二、限制性内切核酸酶命名和分类（一）限制性内切核酸酶命名按照国际命名法，限制性内切核酸酶属于水解酶类。由于限制性酶数量众多，并且越来越多，并且在同一种菌中发现几种酶。为了避免混淆，1973年Smith 和Nathans对内切酶命名提出建议，1980年，Roberts对限制性酶命名进行分类和系统化。限制性酶采用三字母命名原则，即属名 + 种名 + 株名个一种首字母，再加上序号，将限制性内切核酸酶命名要点列于表3-1。表3-1 限制性内切核酸酶命名要点条目要点基本原则3-4个字母构成，方式是:属名+种名+株名+序号首字母取属名第一种字母，且大写第二字母取种名第一种字母，小写第三字母取种名第二个字母，小写；若种名有词头，且已命名过内切酶，则取词头后第一字母代替第四字母若有株名，株名则作为第四字母，与否大小写，依照本来状况而定顺序号若在同一菌株中分离了几种限制性内切核酸酶，则按先后顺序冠以I、II、III,.等如：EcoK：Escherichia coliK (大肠杆菌K株)（二） 限制性内切核酸酶分类 限制性内切核酸酶作用特点，将它们分为三大类。1. I类限制性内切核酸酶 I类限制性内切核酸酶分子量较大，普通在30万道尔顿以上，普通由三个不同亚基所构成。例如限制性酶EcoB是由R(135kD)，M(62kD)和S(55kD)三种亚基构成复合酶，这三个亚基分别由不同基因编码。全酶总分子量为449kD,共5个亚基，其中R亚基和M亚基各两分子。 类酶不但是一种核酸内切酶，同步在酶分子上还具备甲基化酶和ATPase活性，因此是具备各种酶活性复合酶类。作用时除了需要Mg+作辅助因子外，还规定ATP和S腺苷甲硫氨酸(SAM)存在。类酶具备特异辨认序列，大概15个碱基对。 类酶虽然可以在一定序列上辨认DNA分子，并能同DNA分子作用，因其辨认DNA后，要朝一种方向或两个方向移动一段距离(普通为1000个碱基左右)，并且要形成一种环才干切割DNA(图3-3)，因此辨认位点和切割位点不一致，产生片段较大。 图3-3 I类酶作用方式 (引自Lewin,1997)2. 类限制性内切核酸酶类限制性内切核酸酶也是基因工程中不惯用酶，分子量和亚基构成类似于类酶，作用方式基本同类酶。如EcoP1是由两个亚基构成，一种亚基(M亚基)负责位点辨认和修饰。另一种亚基(R亚基)具备核酸酶活性(图3-5)。切割DNA时需要ATP,Mg2+,也能被SAM激活，但并非必须。 图3-4 类限制性内切核酸酶(引自Lewin,1997)3. 类限制性内切核酸酶此类酶分子量较小. 普通在2-4万道尔顿，普通由2-4个相似亚基所构成。它们作用底物为双链DNA，很少数类酶也可作用于单链DNA，或DNA/RNA杂种双链。此类酶专一性强，它不但对酶切点邻近两个碱基有严格规定，并且对更远碱基也有规定，因而，类酶既具备切割位点专一性，也具备辨认位点专一性，普通在辨认序列内切割。切割方式有平切和交错切，产生平末端DNA片段或具备突出粘性末端DNA片段(5或3粘性末端)。作用时需要Mg+作辅助因子，但不需要ATP和SAM。类酶与相应甲基化酶在蛋白亚基上尚未发既有什么关系，第一种被分离类酶是Hind 。 三. 类限制性内切核酸酶性质1. 辨认序列特异性在3类限制性内切核酸酶中，类限制性内切核酸酶特异性最强。 大多数类限制性内切核酸酶辨认序列是回文序列。如BamHI和BglI都是辨认六个碱基DNA序列(图3-5)，都是完全回文序列。这段序列有两个基本特性，第一是可以中在间划一种对称轴，两侧序列两两对称互补配对，第二个特点是两条互补链5到3序列构成相似，即将一条链旋转1800，则两条链重叠。 图3-5 类限制性内切核酸酶辨认回文序列（引自D.Voet & Vote J.G.1995）2. 限制性内切核酸酶切割频率与速度切割频率是指限制性内切核酸酶在某DNA分子中预测切点数。由于DNA是由四种类型单核苷酸构成，假定DNA碱基构成是均以，而限制性内切核酸酶辨认位点是随机分布，那么对于任何一种限制性内切核酸酶切割频率，理论上应为1/4n，n表达该限制性内切核酸酶辨认碱基数。如辨认4个碱基限制性内切核酸酶，其切割频率应为每256个碱基有一种辨认序列和切点(1/44=1/256)，辨认5个碱基限制性内切核酸酶，其切割频率应为每1024个碱基有一种辨认序列和切点，余下类推。事实上因DNA分布是不均一,且有大量重复序列,加上内切酶切点具备GC倾向,因此实际频率偏低。犹如是辨认6个碱基限制性内切核酸酶，切割频率相差很大EcoRI 4000;BamHI:6000;SalI:8000;HpaII:200。 依照限制性内切酶切割DNA所产生产物末端，发现限制性内切酶对DNA切割有两种方式，即平切和交错切。所谓平切，就是限制性内切酶在DNA双链相似位置切割DNA分子，这样产生末端就是平末端。交错切就是限制性内切酶在DNA双链不同位置切割DNA，产生DNA片段末端不是平齐(图3-6)。 图3-6 平末端与黏性末端(Hartl,1991)类限制性内切酶切割产物有平末端和粘性末端(cohesive end)。粘性末端是指DNA分子两端具备彼此互补一段突出单链某些，这一小段单链某些和同一分子另一端或其他分子末端单链某些如果互补话，则能通过互补碱基之间配对，形成双链。并在DNA连接酶作用下，使同一DNA分子两端连接成环状,或使两个分子连成一大线状分子。不同限制性内切酶切割DNA产生三种不同类型末端(表3-3)。 表 3-3 某些限制性内切酶及产生末端 5-粘性末端3粘性末端平末端酶辨认序列酶辨认序列酶辨认序列Taq IT/CGAPst ICTGCA/GAlu IAG/CTCla IAT/CGATSac IGAGCT/CFnuDCG/CGMbo I/GATCSph IGCATG/CDpn IGA/TCBglA/GATCTBde IGGCGC/CHae GG/CCBamHIG/GATCCApa IGGGCC/CPvu CAG/CTGBcl IT/GATCAKpn IGGTAC/CSma ICCC/GGCHindA/AGCTTNae IGCC/GGCNco IC/CATGGHpa IGTT/AACXma IC/CCGGGNru ITCG/CGAXho IC/TCGAGBal ITGG/CCAEcoR IG/AATTCMst ITGC/GCASal IG/TCGACMha TTT/AAAXba IT/CTAGAEcoRGAT/ATC基因分子手术是相称复杂过程，除了需要限制性内切酶外，还需要其她某些工具酶涉及连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸酶、末端修饰酶等，对DNA或RNA进行各种各样修饰。其中最重要是连接酶。第三节 基因工程载体载体(vector，vehicle) 本意就是媒介体，基因工程上载体是能将分离或合成基因导入细胞DNA分子，称为克隆载体。基因工程中有三种重要类型载体质粒DNA、病毒DNA、科斯质粒，其中质粒DNA是最惯用载体，但运载能力低，柯斯质粒是质粒和噬菌体DNA结合体，运载能力最高(图3-7)。在这三种类型基本上，依照不同目，浮现了各种类型改造载体。图3-7 三种类型载体(引自Greene,1998 )一、质粒载体质粒(plasmid)是染色体以外遗传物质，它是双链闭合环状DNA分子，其大小可从1kb到200kb左右，可以在宿主内运用宿主酶系统进行复制。质粒是基因工程重要载体。(一)质粒概念19461947年间，Lederberg和Tatum发现了细菌接合现象，这是细菌有性繁殖方式。 此后不久，便弄清了这种接合是两种不同交配型(接合型)，遗传信息总是从供体(雄性)转移到 受体(雌性)。当两种不同交配型细菌互相辨认和接合后来，雄性细胞致育因子，通过细胞表面构造传递到雌性细胞，这种致育因子日后称为F因子。1952年，Lederberg指出，细菌F因子与高等生物细胞质中染色体外遗传单元极为相似，并正式提出了“质粒”这一名称，以区别于染色体遗传单元。普通来讲，质粒是细胞中可以独立复制复制子，并在细胞分裂时能稳定传递给子代细胞。虽然质粒对细胞生存没有影响，但质粒DNA上也有某些编码基因，赋予宿主细胞某些特性。 自发现能赋予细菌性别特性F因子后来，又在大肠杆菌中发现了一种可以编码抗菌物质大肠杆菌素Col质粒，涉及ColB，ColV，ColE等。由这些因子产生抗菌物质称细菌素(bacleriocin)，是细菌所合成一种蛋白质，对于同种或近缘种具备毒性。合成细菌素能力和对于细菌素抗性，都由染色体外遗传因子所控制。在1959一1960年间，日本科学家在研究用强效抗生素治疗菌痢患者时，发现病原菌志贺氏 菌具有使其同步能抗几种抗生素基因，并且，这种抗药性基因能以和F因子非常相似方式 转移给其她肠道细菌，这就是抗药因子(R因子)。抗药因子(resistance factor)事实上是控制细菌抗药性一种质粒，能在细菌间转移，由抗药性转移因子和抗药性基因两某些构成。每个抗药因子上常具备几种抗药性基因。 （二）质粒DNA基本性质大多数质粒DNA是是环状双链DNA分子。如果两条链都是完整环，这种质粒DNA分子称为共价闭合环状DNA(covalently closed circular，CCC DNA)。CCC DNA有两种构型，超螺旋DNA( supercolied DNA，SC DNA)和松弛DNA(Relaxed DNA),分别是由DNA促旋酶(DNA gyrase) 和拓朴异构酶(topoisomerase)作用成果。如果质粒DNA中有一条链是不完整，那么这种DNA分子就称为开环(open circles,OC DNA)，开环DNA普通是由内切酶或机械剪切导致图3-8)。从细胞中分离质粒DNA时，质粒DNA经常会转变成超螺旋构型。图3-8 质粒DNA三种构型(引自Old & Primrose,1980)溴化乙啶(ethidium bromide，EtBr)是一种扁平分子，可以插入到DNA分子碱基对之间，引起双螺旋某些解旋，从而变化了DNA体积和密度。图3-9 相对分子质量相似构型不同质粒DNA琼脂糖凝胶电泳（引自 Old & Primrose，1980） 由于不同构型DNA插入EB量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中迁移率也不同，CCC DNA泳动速度最快，OC DNA泳动速度最慢，L DNA居中(图3-9)，因此很容易通过凝胶电泳和EB染色办法将不同构型DNA分别开来。（三） 质粒分类依照质粒拷贝数将质粒分为松弛型质粒和严紧型质粒。质粒拷贝数(plasmid copy numbers)是指细胞中单一质粒份数同染色体数之比值,惯用质粒数/每染色体来表达。不同质粒在宿主细胞中拷贝数不同，松弛型质粒(relaxed plasmid)复制只受自身遗传构造控制，而不受染色体复制机制制约，因而有较多拷贝数。普通可达1015个/每染色体。并且可以在氯霉素作用下进行扩增，有质粒扩增后，可达到3000/每染色体(ColE1，可由24个达到1000至3000个)。此类质粒多半是分子量较小，不具传递能力质粒。基因工程中使用多是松弛型质粒。严紧型质粒(stringent plasmid)在寄主细胞内复制除了受自身复制机构控制外，还受染色体严紧控制，因而拷贝数较少，普通只有12个/每染色体。这种质粒普通不能用氯霉素进行扩增。严紧型质粒多数是具备自我传递能力大质粒。质粒复制特性是受复制子控制。基因工程中使用质粒多数是松弛性质粒载体。（四）载体条件就克隆一种基因(DNA片段)来说，最简朴质粒载体也必须涉及三个某些(图3-10)复制区，具有复制起点；选取标记，重要是抗性基因；克隆位点，便于外源DNA插入。就复制特性来讲，规定载体必须有独立复制起点，最佳是松弛型复制，这样便于得到大量拷贝。有时需要有各种复制起点，可以在不同宿主细胞中复制，扩大宿主范畴。具备适当克隆位点，便于外源DNA插入。克隆位点事实上限制性酶切位点，最佳是具备各种限制性内切酶单切点，这样适应性强，克隆以便，如果一种酶在载体上有各种切点，就会限制该切点使用。具备可检测选取标记，也是一种重要基本条件，这种选取标记最佳是可以赋予宿主易于检测表型。选取标记就是常说报告基因(report genes)，涉及抗生素抗性标记，以及某些生化表型标记。此外，一种抱负质粒载体必须具备低分子量，由于小分子质粒DNA易于操作，不容易被损伤，也容易被分离纯化。普通说小分子量质粒分子拷贝数比较高，酶切位点也少。图3-10 质粒载体基本构造二、杂合载体 除了质粒载体外，噬菌体DNA也可作为载体，但是都是改造过，自然病毒DNA不能作为载体。当前在基因工程中使用载体大多是质粒和噬菌体杂合载体。 （一）柯斯质粒(cosmid)载体cosmid 是英文 cos site-carrying plasmid 缩写，本意是带有粘性末端位点质粒，因而，柯斯质粒是人工建造具有DNAcos序列和质粒复制子特殊类型质粒载体。柯斯质粒构建普通都是运用质粒复制子、选取标记，加上cos位点序列及与包装关于序列，构建科斯质粒可以较好地用于基因克隆(图3-11)。图3-11 柯斯质粒载体克隆(引自Lodish et al,1986)初期构建科斯质粒载体有某些局限性，如克隆位点较少，抗性标记单一，容栽能力不大，日后进行了某些改进，克服了这些局限性。柯斯质粒具备如下特点：1. 具备质粒复制子。当前构建柯斯质粒大多具备pMB1复制子或ColE1复制子，因此进入寄主细胞后可以象质粒同样进行复制，并且可以被氯霉素扩增。 2. 具备质粒载体抗生素抗性基因选取标记。如果在这些标记中有克隆位点话可用插入失活法进行筛选。例如上面构建MuA-3就具备四环素抗性基因。 3. 具备噬菌体包装和转导特性。由于柯斯质粒具备DNAcos位点和相应包装序列，因而在克隆了恰当大小外源DNA后来可以被包装进入噬菌体蛋白颗粒，并能进行转染。转导能力比纯质粒大3个数量级。进入寄主细胞后，又可以自我环化。但它不能同寄主染色体DNA整合，也不会产生子代噬菌体裂解寄主。 4. 溶载能力大。这是柯斯质粒最大长处。被克隆DNA大小具备上限和下限，这是由于柯斯质粒最后是被包装到噬菌体颗粒，它最后大小应在噬菌体基因组75%-105%之间。由于载体分子普通在5kb左右，因此克隆最大片段在45kb;如果载体分子量为15kb话，克隆最小片段为19kb。因而柯斯质粒适合构建真核生物基因库，而不适合克隆原核生物基因。 （二）pUC载体系列构建美国加州大学Vieira和Messing运用pBR322和M13载体长处，构建了一种更小载体，称为 pUC7（图3-12），并在此基本上发展了pUC载体系列。 图3-12 pUC载体构建(引自Winnacker,1987)pUC载体具备诸多长处多克隆位点；松弛复制；有氨苄青酶素抗性；可通过化学显色筛选。当前最惯用pUC载体是pUC18(图3-13),它分子量小，具备多克隆位点和易于选取分子标记，并且是松弛型复制，在正常状况下，它拷贝数可达上千个，因此不需要用氯霉素进行扩增。图3-13 pUC18质粒载体图谱二、基因文库技术基因文库(Gene Library)是指在一种载体群体中，随机地收集着某毕生物DNA各种克隆片段，抱负地包括着该物种所有遗传信息(图3-18)。因而，基因文库是人工构建某毕生物基因“活期储蓄所”，依照构建办法不同,分为基因组文库、cDNA文库等。依照基因库含量,又分为全库和特异性库,全库具有某毕生物所有遗传信息,而特异性库是不完整,如差示库。初期将通过构建基因文库来筛选所需克隆办法称为鸟枪法。 图3-18 基因文库技术（J.J.Greene & Rao V.B.,1998）第三节 体外重组一、体外重组办法 DNA重组连接办法大体分为四种：粘性末端连接、平末端连接、同聚物接尾连接、接头连接法。1. 粘性末端连接法 粘性末端连接(Cohesive end ligation)是指具备相似粘性末端两个双链DNA分子在DNA连接酶作用下，连接成为一种杂合双链DNA(图3-14)。粘性末端可由辨认回文序列内切酶所产生，或是用末端转移酶来制备。 凡是辨认回文序列内切酶切割DNA产生末端都是粘性末端，只有用同一种酶切割产生相似粘性末端才干通过末端单链碱基配对并在DNA连接酶作用下进行连接。 图3-14 黏性末端连接法（引自 Snyder & Champness ，1977） 粘性末端连接法是最惯用DNA连接办法，酶切片段基本不需作什么解决就可以用于连接，既经济又省时。由于大多数限制性内切酶都可以产生粘性末端，操作以便。此外,通过粘性末端连接重组体，其外源片段很容易回收，只要用本来酶切割重组体就可以了。此外，也可以通过双酶切来获得黏性末端，并可进行定向重组连接（图3-15）。 图3-15 双酶切进行定向重组连接（引自 Snyder & Champness ，1977）平末端连接(blunt end ligation)是指在T4 DNA连接酶作用下(可加入适量RNA连接酶)，将两个具备平末端双链DNA分子连接成杂种DNA分子。平末端连接效率比粘性末端连接效率低得多,因此普通在连接反映体系中要适量添加增进大分子凝聚凝聚剂,以提高平末端DNA连接效率。惯用是PEG8000，加入后，可以起到两个作用：一是可将平末端连接效率提高1-3个数量级；二是变化连接产物分布，抑制分子内连接，增进分子间连接，得到连接产物重要是重组体。平末端连接不利之处是连接效率低，需要大量连接酶，有时为了提高连接效率，普通要补加RNA连接酶。连接后，缘由限制性内切酶内切酶切点要消失，因此不易回收插入外源DNA片段。 3. 同聚物加尾法 所谓同聚物加尾(homopolymer tails joining)连接就是运用末端转移酶在载体及外源双链DNA3端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工粘性末端，外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC)，然后在DNA连接酶作用下，连接成为重组DNA。这种办法可合用于任何来源DNA片段，但办法较繁，需要核酸外切酶、S1核酶、末端转移酶等协同作用（图3-16）。同聚物接尾法事实上是一种人工粘性末端连接法，具备诸多长处:一方面不易自身环化,这是由于同一种DNA两端尾巴是相似，因此不存在自身环化。由于载体和外源片段末端是互补粘性末端，因此连接效率较高。用任何一种办法制备DNA都可以用这种办法进行连接，因此是一种通用体外重组办法。 图3-16 同聚物尾连接法(引自Old & Primrose,1980)1. 基因组DNA文库所谓基因组文库(genomic DNA Library)，就是用基因工程办法,人工构建具有某毕生物基因组DNA各种片段克隆群。普通以改造噬菌体DNA或柯斯质粒作为载体，涉及下列过程(图3-19)：高分子量染色体DNA制备， 体外重组连接， 包装蛋白制备，重组体体外包装，将重组DNA导入寄主细胞，筛选。建造基因组文库不但可以大量扩增含量很少单拷贝构造基因，也可以克隆调控基因，有助于研究基因构造、功能和调控机理。基因组文库同遗传学上所讲基因库是完全不同概念。基因库(gene pool)是指在行有性生殖某一群体中，能进行生殖个体所含总遗传信息。在基因组文库构建中，由于使用载体不同，分为噬菌体载体和柯斯质粒载体构建基因组文库、YAC文库、BAC文库。图3-19 基因组文库技术(引自Griffiths et al.1996)2. cDNA文库 同mRNA互补DNA称为cDNA。mRNA为模板合成cDNA可以用于基因克隆化，也可用这种办法制备特异性杂交探针。cDNA文库是以某毕生物总mRNA为模板，在无细胞系统中，在反向转录酶作用下，一方面合成一互补DNA，即第一链，破坏RMA模板后，再以第一链为模板合成第二链，得到双链DNA称为cDNA基因。选用适合载体，将合成cDNA基因重组导入寄主细胞，经筛选得到cDNA基因克隆群称为cDNA文库( completement DNA Library) (图3-20)。由于cDNA技术合成是不含内含子功能基因，因而是克隆真核生物基因一种通用办法。 图3-20 cDNA文库构建(引自Old & Primrose,1980)由于细胞内基因在表达时间上并非是统一,具备发育阶段性和时间性,有些则需要特殊环境条件。因此,cDNA文库是不也许构建得十分全,也就是说任何一种cDNA文库都不也许包括某毕生物所有编码基因。因此在构建cDNA文库时应依照研究目不同而选用不同生物材料作为RNA分离出发材料,有些甚至要通过特殊诱导解决以提高所需DNA丰度。第五节 重组DNA转移、筛选与鉴定 转化是基因工程操作中一项十分重要工作。DNA重组分子在体外构建完毕后，必要导入特定受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接变化其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子转化(transformation)。重组体筛选有两层涵义,一是将携带有外源插入DNA片段克隆挑选出来,二是将将携带有特定外源插入片段重组体挑选出来。鉴定则是对筛选重组体进行最后鉴别。一、重组DNA转化 可以接受转化作用细菌生理状态叫感受态。细菌感受态是在恰当生长条件下获得一种生理特性。要强调是：感受态是关于转化因子被吸取生理状态，而不是关于转化因子进入细胞后能否被接受生理状态。处在感受态受体细菌，其吸取转化因子能力为普通细菌生理状态千倍以上，并且不同细菌间感受态差别往往受自身遗传特性、菌龄、生理培养条件等诸多因素影响。在自然条件下，大多数类型细菌不浮现感受态，也不发生转化。然而可以通过某些化学诱导办法来制备感受态，用这种办法得到感受态就称为人工诱导感受态细胞。当前惯用诱导感受态转化办法是CaCl2 法（图3-21），此外也可以用基因枪等办法转化外源DNA。图3-21 钙诱导转化二、重组体遗传学筛选法所谓遗传学办法(genetic selection)重要是依照受体细胞接受了重组DNA分子后所发生遗传表型变化直接选取重组体办法。遗传表型变化涉及抗药性、缺陷基因功能互补表型及噬菌斑变化等。这些表型变化，有些是载体提供表型特性，有些则是插入序列提供表型特性。选取办法重要是依照平板上可见表型变化，用于选取平板涉及普通抗生素平板、插入失活抗生素平板、插入表达抗生素平板、显色平板等，由于这些办法都是直接从平板上筛选,因此又称为平板筛选法。（一） 插入失活筛选法从原理上讲，当外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内位点后，使这个基因丧失了原有功能叫插入失活(insertional inactivation) 。图3-22 插入失活原理图3-23 聚合酶链反映（引自 Watson et al，1992） 1.抗性基因插入失活筛选法依照抗生素抗性基因插入失活原理而设计插入失活法是重组体惯用筛选办法。如非重组pBR322质粒DNA上四环素和氨苄青霉素抗性基因都是正常，表型为AprTcr。带有这种质粒受体菌可以在加有四环素和氨苄青霉素双抗性平板上生长。但是，如果在该质粒四环素抗性基因内插入外援片段，就会导致四环素抗性基因失活，变成AprTcs，携带这种质粒宿主菌可以在氨苄青霉素平板上生长，而不能在四环素抗性平板上生长(图3-22)。2. 蓝白斑筛选法依照抗生素抗性基因插入失活原理而设计插入失活法需要进行菌落平板影印复制，才可以将所需重组体挑选出来，大大增长了筛选工作量。日后，人们设计了以-半乳糖苷酶产生作为颜色筛选标记载体，简化了筛选程序，提高了敏捷度。 此类载体系统涉及M13噬菌体、pUC质粒系统、pEGM质粒系统。它们共同特点是载体上携带一段细菌lacZ基因，它编码-半乳糖苷酶一段146个氨基酸-肽，载体转化受体菌为lacZM15基因型。这样，载体同宿主通过互补，具备完整-半乳糖苷酶活性。如果在载体lacZ基因中插入外源DNA，导致lacZ基因失活，不能合成-肽，失去同宿主互补，不能形成有功能-半乳糖苷酶，失去分解X-gal能力。在X-gal平板上，含阳性重组体细菌为物色菌落(质粒载体)或无色噬菌斑(M13噬菌体载体)；非重组体转化细菌为蓝色菌落或蓝色噬菌斑。显色反映筛选办法比较简朴，但是-半乳糖苷酶合成需要诱导。实验中起诱导作用是安慰诱导物-IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖苷)，作用底物是X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)。普通是将X-gal和IPTG混合后，涂布在固体平板表面。(二) PCR法聚合酶链反映(polymerase chain reaction，PCR)是一种体外扩增特定DNA序列 新技术，这种DNA体外扩增是通过同 DNA双链互补两个引物在DNA聚合酶 作用下，进行引物延伸来完毕。在反映系统中，需要有：模板(具有特定序列 DNA分子)。两个寡聚核苷酸引物，这 两个引物可同双链DNA分子互补链杂交，并且位于靶DNA欲扩增区两侧。 耐热DNA聚合酶。4种脱氧核糖单核苷酸。然后通过不同温度循环进行DNA扩增(图323)。这一技术是Kary Mullis在1985年创造，并于1993年获得诺贝尔化学奖。PCR应用十分广泛，并且可通过