博落回不同部位四种生物碱的含量差异分析.pdf

第 7 卷第 4 期2023 年 12 月现 代 牧 业MODERN ANIMAL HUSBANDRYVol.7 No.4Dec.2023收稿日期:2023-07-25基金项目:河南省重点研发与推广专项(科技攻关)项目(202102110096);河南牧业经济学院教育教学改革研究项目(2021-XJLX-132)。作者简介:朱丽飞(1988),女,河南焦作人,讲师,博士。通信作者:李利红(1972),女,河南焦作人,教授,博士。博落回不同部位四种生物碱的含量差异分析朱丽飞,王文青,曲书昊,王小莉,魏志华,李利红(河南牧业经济学院 动物医药学院,河南 郑州 450046)摘要:建立可同时测定博落回中血根碱等四种生物碱类有效成分的 HPLC 方法,评价博落回不同部位生物碱有效成分含量的差异。采用 Waters-Symmetry C18 色谱柱(5 m,4.6 mm250 mm),以乙腈-0.1%磷酸为流动相,梯度洗脱,流速为 1.0 mL/min,波长 284 nm,进样量 5 L,柱温 30。结果显示,血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱、别隐品碱四种生物碱在一定浓度范围内线性关系良好,平均回收率范围分别在 98.88%99.73%、97.97%99.20%、95.18%99.86%、95.76%100.48%。博落回的根、茎、叶中四种生物碱有效成分含量差异较大,根和叶中四种生物碱的含量远大于茎,说明根和叶是博落回合成生物碱类次级代谢产物的主要部位。叶中血根碱、白屈菜红碱的含量是根中含量的 2 倍。综上所述,建立的 HPLC 法具有简单、稳定、准确的特点,为博落回的合理有效利用提供参考。关键词:博落回;生物碱;不同部位;HPLC;含量差异中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:2096-2975(2023)04-0037-08The content differences of four alkaloids in different parts of Macleaya cordata (Willd.)R.Br.ZHU Lifei,WANG Wenqing,QU Shuhao,WANG Xiaoli,WEI Zhihua,LI Lihong(College of Veterinary Medicine,Henan University of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou Henan 450046)Abstract:The purpose of this research is to establish an HPLC method for the simultaneous determination of four alkaloid active ingredients in Macleaya cordata(Willd.)R.Br.,and to evaluate the content differences of alkaloids in different parts of Macleaya cordata(Willd.)R.Br.The chromatographic conditions were showed as follows:the column was Waters-Symmetry C18(5 m,4.6 mm250 mm),the mobile phase was acetonitrile-0.1%phosphoric acid,the elution method was gradient elution,the flow rate was 1.0 mL/min,the UV detection wavelength was 284 nm,the sample volume was 5 L,and the column temperature was 30.The result showed that protopine,allocryptopin,sanguinarine and chelerythrine all possessed good linear relationship.The average recoveries of protopine,allocryptopin,sanguinarine and chelerythrine were 98.88%99.73%、97.97%99.20%、95.18%99.86%、95.76%100.48%,respectively.The content of the four alkaloids in the roots,stems and leaves was significantly different,and the content of the four alkaloids in the roots and leaves was much higher than that in the stems,indicating that the roots and leaves were the main parts of the secondary metabolites of alkaloids from Macleaya cordata(Willd.)R.Br.The content of sanguinarine and chelerythrine in leaves was 2 times that in roots.In summary,the established HPLC method was simple,stable and accurate,and provided a reference for the rational and effective use of Macleaya cordata(Willd.)R.Br.Key words:Macleaya cordata(Willd.)R.Br.;alkaloids;different parts;HPLC;content differences73朱丽飞,等:博落回不同部位四种生物碱的含量差异分析 博落回(Macleaya cordata(Willd.)R.Br.)是罂粟科博落回属多年生直立草本植物,全草入药。博落回活性成分包括生物碱类与非生物碱类,生物碱类有效成分主要是血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱、别隐品碱等,具有抗菌、消炎等多种生物活性,已广泛应用于畜禽养殖1,2,如博落回提取物3、博落回注射液4。博落回生物碱类在博落回的不同部位均有分布,且不同生物碱在植株不同部位的含量分布存在差异5,6。为全面了解博落回生物碱类有效成分在各部位的分布,作者采用 HPLC 法测定博落回根、茎、叶中 4 种生物碱(血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱、别隐品碱)的含量,系统地评价博落回各部位生物碱类有效成分的差异,为博落回的合理利用和质量控制提供参考。1 材料1.1 药材与试剂 博落回的根、茎、叶均产自河南三门峡卢氏,经河南牧业经济学院魏志华老师鉴定为博落回根、茎、叶;对照品血根碱、白屈菜红碱、别隐品碱、原阿片碱均购自上海源叶生物科技有限公司;甲醇(色谱纯,天津市四友精细化学品有限公司);乙腈(色谱纯,安徽天地高纯溶剂有限公司);磷酸、浓盐酸(分析纯,天津市风船化学试剂有限公司)。1.2 仪器 E2695-Waters 高效液相色谱仪(沃特世科技上海有限公司);KQ-200KDE 超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司);XY-100 高速多功能粉碎机(浙江省永康市象珠松青五金厂);BSA224S 分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司);TGL-16C高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂);SHZ-95B循环水多用真空泵(巩义市予华仪器有限公司)。2 方法2.1 色谱条件 色谱柱:Waters-symmetry C18(5 m,4.6 250 mm);检测器:2489 UV-Vis;检测波长:284 nm;流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸(B),梯度洗脱见表 1;流速:1.0 mL/min;进样量:5 L;柱温:30。表 1 梯度洗脱程序表时间/min 流速/(mL/min)流动相 A/%流动相 B/%0125755125751216040151257520125752.2 药材处理博落回根、茎、叶晒干后,分别经高速多功能粉碎机粉碎,过 60 目筛,备用。2.3 溶液的配制2.3.1 对照品溶液的制备 分别精密称定对照品血根碱 9.90 mg、白屈菜红碱 11.70 mg、原阿片碱 10.40 mg、别隐品碱9.20 mg,置于 10 mL 的容量瓶中,加 45 mL 甲醇-1%盐酸(50:50)溶液,超声溶解,放冷后用甲醇-1%盐酸(5050)溶液定容、混匀,分别得到血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱、别隐品碱浓度为 990、1170、1040、920 g/mL 的单一对照品储备液。分别精密量取四种生物碱的对照品储备液1 mL,置于 10 mL 容量瓶中,用甲醇-1%盐酸(50 50)溶液定容至刻度,得到混合对照品溶液。每1 mL 含血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱、别隐品碱的含量分别为 99、117、104、92 g/mL 的混合对照品溶液。2.3.2 供试品溶液的制备分别取博落回根、叶部位粉末约 0.2 g、茎部位粉末约 1 g,精密称定,置于 100 mL 具塞锥形瓶中,分别加入50 mL 的甲醇-1%盐酸(5050)溶液,称定重量,超声提取1 h,用甲醇-1%盐酸(5050)溶液补足失重,离心 5 min,取上清液,0.45 m 滤膜过滤,即得各供试品溶液。3 结果3.1 系统适用性试验 分别精密吸取血根碱等四种对照品溶液、混合对照品溶液、博落回根部样品溶液各 5 L,按 2.1项色谱条件测定,得到色谱图(图 1-图 6)。记录得到分离度、理论塔板数、灵敏度、拖尾因子等参数,结果如表 2 所示。原阿片碱、别隐品碱、血根碱、白83朱丽飞,等:博落回不同部位四种生物碱的含量差异分析屈菜红碱的保留时间分别为 3.657、3.930、4.910、7.380 min。供试品溶液中四种生物碱的保留时间与对照品基本一致,且与相邻色谱峰基本分离,理论塔板数以别隐品碱计大于 4000。注:1 为原阿片碱,下同 图 1 原阿片碱对照品溶液色谱图注:2 为别隐品碱,下同图 2 别隐品碱对照品溶液色谱图注:3 为血根碱,下同图 3 血根碱对照品溶液色谱图注:4 为白屈菜红碱,下同图 4 白屈菜红碱对照品溶液色谱图图 5 混合对照品溶液色谱图 图 6 博落回根部样品溶液色谱93朱丽飞,等:博落回不同部位四种生物碱的含量差异分析表 2 系统适用性试验结果生物碱保留时间/min理论塔板数分离度信噪比拖尾因子原阿片碱3.6577076.8054.8119281026.8320241.151996别隐品碱3.9304437.4551.409858455.101661血根碱4.9105235.3314.0130241570.7929281.599341白屈菜红碱7.3805795.6662.4612721434.0133501.9003153.2 线性关系考察 分别精密量取原阿片碱、别隐品碱、血根碱、白屈菜红碱对照品储备液适量,逐步稀释配制一系列各对照品标准溶液。原阿片碱浓度梯度为 416、208、104、52、20.8、10.4、5.2、2.08 g/mL;别隐品碱浓度 梯 度 为 357、184、92、46、18.4、9.2、4.6、1.84 g/mL;血根碱浓度梯度为 99.0、49.5、19.8、9.90、4.95、1.98 g/mL,白屈菜红碱浓度梯度为117、58.5、23.4、11.7、5.85、2.34 g/mL。精密吸取各对照品标准溶液 5 L,按 2.1 色谱条件平行测定两次,峰面积取平均值。以峰面积 A 为纵坐标,以浓度 c(g/mL)为横坐标建立标准曲线,结果如表 3所示。结果表明,原阿片碱、别隐品碱、血根碱、白屈菜红碱线性关系良好。表 3 线性关系考察结果生物碱回归方程线性范围/(g/mL)r原阿片碱y=5491.4x-3226.32.084160.9999别隐品碱y=3803.1x-8174.91.843570.9997血根碱y=12673x-2071.61.98990.9972白屈菜红碱y=15403x+102172.341170.99843.3 精密度试验在 2.1 色谱条件下将混合对照品溶液连续进样6 次,分别计算原阿片碱、别隐品碱、血根碱、白屈菜红碱峰面积的相对标准偏差(RSD),结果如表 4 所示。原阿片碱、别隐品碱、血根碱、白屈菜红碱的精密度 RSD 分 别 为 0.075%、0.092%、0.098%、0.082%,表明仪器精密度良好。表 4 精密度试验结果生物碱峰面积 A123456RSD/%原阿片碱5704895705925704905704175704145716180.075别隐品碱3422783427023426883421083426823420980.092血根碱1466903146355814666841464059146657314657460.098白屈菜红碱1990934198688019914151989801199069519897880.0823.4 稳定性试验在 2.1 色谱条件下将混合对照品溶液分别在1 h、2 h、4 h、12 h、24 h 进样,分别计算原阿片碱、别隐品碱、血根碱、白屈菜红碱峰面积的相对标准偏差(RSD),结果如表 5 所示。原阿片碱、别隐品碱、血根碱、白屈菜红碱的 RSD 值分别为 1.54%、1.43%、1.10%、1.10%,表明样品稳定性良好。表 5 稳定性试验结果进样时间1 h2 h4 h12 h24 h原阿片碱峰面积/A591042593108574291576135590423RSD/%1.54别隐品碱峰面积/A346542349533344699348622357670RSD/%1.43血根碱峰面积/A)14647121471553148806214987371501674RSD/%1.10白屈菜红碱峰面积/A19910581999852202455620411132036572RSD/%1.1004朱丽飞,等:博落回不同部位四种生物碱的含量差异分析3.5 重复性试验精密称定博落回茎部粉末 6 份,每份 1 g,按2.3.2 项方法处理,各吸取 5 L 按 2.1 项色谱条件进样测定,分别计算原阿片碱、别隐品碱、血根碱、白屈菜红碱峰面积的相对标准偏差(RSD),结果如表 6 所示。原阿片碱、别隐品碱、血根碱、白屈菜红碱的重复性 RSD 分别为 2.43%、1.86%、1.71%、3.66%,结果表明该方法重复性良好。表 6 重复性试验结果生物碱编号样品质量/g峰面积/A浓度/(mg/mL)含量/(mg/g)RSD/%原阿片碱11.00861036450.02141.05962.4321.00081060110.02181.091530.99101006490.02081.048241.01481002220.02071.019451.0043999680.02061.027561.00501020210.02101.0472别隐品碱11.0086916510.02501.23721.8621.0008945460.02571.283030.9910925770.02521.270841.0148912910.02491.225251.0043906450.02471.223061.0050924410.02521.2514血根碱11.00865006910.05032.49241.7121.00085002890.05022.509830.99104921130.04942.493441.01484892150.04912.420651.00435002410.05022.500861.00504835250.04862.4159白屈菜红碱11.00864174120.02041.00943.6621.00084192440.02041.021830.99104183930.02041.029741.01484002280.01950.960851.00433899280.01900.970161.00503973150.01940.96293.6 加样回收试验精密称定博落回叶部粉末 9 份,每份 1 g,分别按高、中、低 3 个梯度加入四种生物碱对照品溶液适量,每个梯度 3 份,按照 2.3.2 方法制备溶液,在2.1 项色谱条件测定,计算回收率和 RSD(表 7)。结果表明血根碱、白屈菜红碱、别隐品碱、原阿片碱的平均 回 收 率 范 围 分 别 在 98.88%99.73%、97.97%99.20%、95.76%100.48%、95.18%99.86%,RSD 范围分别是 0.65%1.67%、0.69%1.52%、1.11%2.43%、0.61%1.60%,说明该方法准确度良好。3.7 样品含量测定将 2.3.2 配制的供试品溶液按 2.1 项色谱条件测定,每个样品平行测定 2 次,记录峰面积,计算博落回根茎叶中四种生物碱的含量,结果如表 8 所示。结果表明,博落回根、茎、叶中血根碱的含量分别为4.644、1.893、9.717 mg/g;博落回根、茎、叶中白屈菜红碱的含量分别为4.491、1.295、10.423 mg/g;博14朱丽飞,等:博落回不同部位四种生物碱的含量差异分析落回根、茎、叶中别隐品碱的含量分别为 20.192、1.294、4.986 mg/g;博落回根、茎、叶中原阿片碱的含量分别为 5.878、0.943、9.361 mg/g。综上所述,血根碱、白屈菜红碱和原阿片碱在博落回叶中含量最高,别隐品碱在根中含量最高。表 7 加样回收试验结果生物碱编号称样量/g原有量/mg加入量/mg测得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%血根碱低-10.20011.9444 0.9900 2.9325 99.81 98.880.74低-20.20051.9483 0.9900 2.9185 98.01 低-30.20031.9463 0.9900 2.9246 98.82 中-10.20141.9570 1.9800 3.9765 101.99 99.731.67中-20.20041.9473 1.9800 3.9115 99.20 中-30.20041.9473 1.9800 3.8878 98.01 高-10.20011.9444 2.9700 4.8750 98.67 99.470.65高-20.20031.9463 2.9700 4.9005 99.47 高-30.20101.9531 2.9700 4.9310 100.27 白屈菜红碱低-10.20012.0856 1.1700 3.2232 97.23 97.970.69低-20.20052.0898 1.1700 3.2468 98.89 低-30.20032.0877 1.1700 3.2318 97.78 中-10.20142.0992 2.3400 4.3840 97.64 98.570.70中-20.20042.0888 2.3400 4.4129 99.32 中-30.20042.0888 2.3400 4.3996 98.75 高-10.20012.0856 3.5100 5.6281 100.92 99.201.52高-20.20032.0877 3.5100 5.5003 97.23 高-30.20102.0950 3.5100 5.5855 99.45 别隐品碱低-10.20010.9977 0.4600 1.4321 94.43 95.76 1.11 低-20.20050.9997 0.4600 1.4465 97.14 低-30.20030.9987 0.4600 1.4390 95.71 中-10.20141.0042 0.9200 1.9373 101.43 100.48 2.43 中-20.20040.9992 0.9200 1.9455 102.86 中-30.20040.9992 0.9200 1.8929 97.14 高-10.20010.9977 1.3800 2.3251 96.19 98.18 1.67 高-20.20030.9987 1.3800 2.3524 98.09 高-30.20101.0022 1.3800 2.3859 100.27 原阿片碱低-10.20011.8731 1.0400 2.8703 95.88 96.59 0.61 低-20.20051.8769 1.0400 2.8896 97.37 低-30.20031.8750 1.0400 2.8786 96.50 中-10.20141.8853 2.0800 3.9453 99.04 95.18 1.60 中-20.20041.8759 2.0800 3.8831 96.50 中-30.20041.8759 2.0800 3.8558 95.18 高-10.20011.8731 3.1200 4.9462 98.50 99.86 1.56 高-20.20031.8750 3.1200 4.9651 99.04 高-30.20101.8816 3.1200 5.0653 102.04 24朱丽飞,等:博落回不同部位四种生物碱的含量差异分析表 8 博落回根、茎、叶中四种生物碱含量测定结果部位样品质量/g峰面积/A含量/(mg/g)平均含量/(mg/g)血根碱根 10.20132353224.6534.644根 20.20052334464.634茎 11.00204838131.9131.893茎 21.00504750551.873叶 10.20545043969.7289.717叶 20.20535029279.705白屈菜红碱根 10.20132887044.4914.491根 20.20052875824.491茎 11.00204080021.2891.295茎 21.00504129821.301叶 10.205466871110.40710.423叶 20.205367040610.439别隐品碱根 10.201329925920.07920.192根 20.200530148220.305茎 11.0020909891.3011.294茎 21.0050902141.287叶 10.2054681684.8874.986叶 20.2053712085.084原阿片碱根 10.20131267965.8815.878根 20.20051261235.874茎 11.00201006330.9440.943茎 21.00501007770.942叶 10.20542063719.2919.361叶 20.20532094069.4304 讨论4.1 色谱条件的确立参考质量标准的色谱条件7,作者先采用乙腈-0.2%三乙胺溶液(磷酸调节 pH 2.5)为流动相进行梯度洗脱,结果血根碱和白屈菜红碱峰分叉、拖尾,调整梯度洗脱程序,分叉并没有改善。根据罗忠勇等8方法,采用乙腈-0.5%三乙胺溶液(磷酸调节 pH 2.5)为流动相,血根碱和白屈菜红碱峰分叉或拖尾现象并未改善。因此结合多项研究数据9-11,选取乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)为流动相体系,考察等度洗脱(2575)和梯度洗脱(见 2.1)的影响,发现等度洗脱时,白屈菜红碱仍出现峰分叉现象,而梯度洗脱时,原阿片碱和别隐品碱基本分离(分离度 1.4),血根碱和白屈菜红碱峰形改善,未出现分叉情况。因此最终选定 2.1 色谱条件。4.2 博落回不同部位生物碱含量差异分析博落回根、茎、叶中四种生物碱有效成分含量差异较大,血根碱、白屈菜红碱、别隐品碱、原阿片碱在根茎叶中的排序分别是叶根茎、叶根茎、根叶茎、叶根茎(图 7)。根和叶中四种生物碱的含量远大于茎,说明根和叶是博落回合成生物碱类次级代谢产物的主要部位。除别隐品碱外,血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱在叶中的含量要高于根,尤其是血根碱和白屈菜红碱,叶中含量是根中含量的 2 倍。34朱丽飞,等:博落回不同部位四种生物碱的含量差异分析图 7 博落回根、茎、叶中四种生物碱含量差异比较生物碱类次生代谢产物在植物的不同药用部位中富集的生物碱量会有所不同。作者结合文献,通过优化色谱条件,建立了简单、稳定、准确的HPLC 方法,可同时测定博落回中血根碱等四种生物碱的含量,评价了博落回根茎叶不同部位四种生物碱有效成分含量的差异,为博落回的合理利用提供参考。参考文献:1 曾泽,张华琦,桂干北,等.博落回的活性成分、生物学作用及其在动物生产中的应用J.饲料研究,2023,46(08):120-124.2 Lin L,Liu Y C,Huang J L,et al.Medicinal plants of the genus Macleaya(Macleaya cordata,Macleaya microcarpa):A review of their phytochemistry,pharmacology,and toxicologyJ.Phytotherapy Research,2018,32(01):19-48.3 何晓芳,何康,韦春秀,等.博落回提取物的生物学特性及其在畜禽养殖中的研究进展J.饲料研究,2023,46(06):133-136.4 江龙.博落回注射液的安全性评价及药效学研究D.长沙:湖南农业大学,2016.5 李小莹,周峰,张民达,等.HPLC 同时测定博落回不同生长时期不同部位中 3 种生物碱含量J.饲料研究,2020,43(04):84-87.6 苏海兰,郑梅霞,陈宏,等.野生与种植博落回各部位生物碱含量分析 J.福建农业科技,2021,51(02):32-36.7 中华人民共和国农业农村部.博落回散质量标准与说明书范本Z.农业农村部令2020246 号.北京:农业农村部,2020-04-19.8 罗忠勇,曾建国,黄敬,等.RP-HPLC 法测定小果博落回中 7 种异喹啉类生物碱J.中草药,2010,41(07):1188-1190.9 刘秀斌,黄嘉璐,郑亚杰,等.博落回和小果博落回不同部位中生物碱类成分的比较J.中国现代中药,2017,19(10):1382-1386.10 Sai C,Wang J,Li B,et al.Isolation and identification of alkaloids from Macleaya microcarpa by UHPLC-Q-TOF-MS and their cytotoxic activity in vitro,antiangiogenic activity in vivoJ.BMC Chemistry,2020,14(01):5.11 郭宇鸽,曾建国,谈满良,等.博落回叶与小果博落回叶中 4 种生物碱的含量比较J.中南药学,2011,9(11):829-832.(责任编辑:孙彦婷)44