生物化学与分子生物学技术原理--6市公开课一等奖百校联赛特等奖课件.pptx

绪论n生物化学与分子生物学定义n与其它学科关系n发展简史n实际应用第1页 什么是生物化学？什么是生物化学？简单说，简单说，生物化学是生命化学生物化学是生命化学。生生物物化化学学是是用用化化学学理理论论和和方方法法作作为为主主要要伎伎俩俩，硕硕 士士 物物 体体 基基 本本 物物 质质 结结 构构（如如Carbohydrates,Lipids,Proteins andNucleicacid)、性性质质及及其其生生命命活活动动改改变变规规律律（生生命命活活动动如如：生生长长、生生殖殖、代代谢谢、运运动动等）等）第2页是硕士物体是硕士物体化学组成与性质（化学组成与性质（静态生化，静态生化，Static Biochemistry)，以及机体内所，以及机体内所进行进行化学改变化学改变(Dynamic Biochemistry)科学。科学。第3页分子生物学是研究核酸、蛋白质等全部生物大分子形态、结构特征及其主要性、规律性和相互关系科学。分子生物学分子生物学(molecular biologymolecular biology)是生物化学主要是生物化学主要组成部分。组成部分。第4页生物化学与分子生物学 同相关学科关系n生物化学与分子生物学是生物学最深层次；n生物化学与分子生物学是化学最高层次；n生物化学与分子生物学为农学、医学和食品科学提供理论依据和研究伎俩；n物理学、信息科学和数学为生物化学与分子生物学提供研究伎俩。第5页 与生物化学关系与生物化学关系与生物化学关系与生物化学关系最为亲密最为亲密最为亲密最为亲密研究方向侧重点研究方法研究方法研究方法研究方法分子生物学分子生物学分子生物学分子生物学生物大分子结构与功效、分子间信息传递生物化学与遗生物化学与遗生物化学与遗生物化学与遗传学传学传学传学生物化学生物化学生物化学生物化学大分子代谢转化生物化学与化生物化学与化生物化学与化生物化学与化学以及生理学学以及生理学学以及生理学学以及生理学 但存在一定但存在一定但存在一定但存在一定差异差异差异差异第6页分子生物学三大标准分子生物学三大标准1)1)组成生物大分子单体是相同组成生物大分子单体是相同共同核酸语言共同核酸语言 共同蛋白质语言共同蛋白质语言2)生物遗传信息表示中心法则相同生物遗传信息表示中心法则相同 DNARNAproteincharacter3)生物大分子单体排列（核苷酸、氨基酸）不一样生物大分子单体排列（核苷酸、氨基酸）不一样 不一样高级结构不一样高级结构 不一样生物大分子之间互作不一样生物大分子之间互作不一样物种特征不一样物种特征第7页准备和酝酿阶段准备和酝酿阶段n 时间：时间：19世纪后期到世纪后期到20世纪世纪50年代初。年代初。n两点重大突破：两点重大突破：n确定了蛋白质是生命主要基础物质；确定了蛋白质是生命主要基础物质；n确定了生物遗传物质基础是确定了生物遗传物质基础是DNA。第8页当代分子生物学建立和发展阶段n时间：从时间：从50年代初到年代初到70年代初，年代初，n1953年年Watson和和CrickDNA双螺旋结构模型作双螺旋结构模型作为当代分子生物学诞生里程碑。为当代分子生物学诞生里程碑。n主要进展包含：主要进展包含：n遗传信息传递中心法则建立遗传信息传递中心法则建立n对蛋白质结构与功效深入认识对蛋白质结构与功效深入认识第9页 初步认识生命本质并开始改造生命深入发展阶段n时间：时间：70年代后至今年代后至今n基因工程技术作为新里程碑，标志着人类深入认基因工程技术作为新里程碑，标志着人类深入认识生命本质并能动改造生命新时期开始。识生命本质并能动改造生命新时期开始。第10页生物化学中关键技术生物化学中关键技术n电泳（电泳（19231923）生物大分子分离、分析生物大分子分离、分析n超离心（超离心（19251925）蛋白质、细胞亚器官）蛋白质、细胞亚器官 分离；分子量确实定分离；分子量确实定n同位素标识（同位素标识（19341934）物质代谢路径、生）物质代谢路径、生物大分子结构测定物大分子结构测定n层析（层析（1944 1944）生物大分子分离纯化生物大分子分离纯化nX-X-光衍射、光衍射、NMRNMR：生物大分子结构测定生物大分子结构测定第11页超速离心超速离心（1920S1920S）电泳电泳（1930S1930S）电镜（电镜（1930S1930S）同位素示踪同位素示踪 （1940S1940S）柱层析（柱层析（1940S1940S）X X射线衍射射线衍射（1950S1950S）氨基酸分析氨基酸分析与测序（与测序（1950S1950S）核酸杂交（核酸杂交（1960S1960S）核苷酸测序核苷酸测序（1970S1970S）重组重组DNADNA技术技术（1970S1970S）DNADNA合成（合成（1980S1980S）单克隆抗体组织化学单克隆抗体组织化学（1980S1980S）聚合酶链式反应聚合酶链式反应（1980S1980S）分分子子生生物物学学惯惯用用技技术术第12页1901-111111项生理医学诺贝尔奖中，项生理医学诺贝尔奖中，6969项（项（62%62%）颁给了生物化学与分子生物学领域颁给了生物化学与分子生物学领域第13页发展历程发展历程分子生物学中重大成就与突破者分子生物学中重大成就与突破者Nobel Prize取得者取得者组成了分子生物学发展主要内容组成了分子生物学发展主要内容里程碑里程碑 1910 1910 科赛尔科赛尔 Kossel Kossel（德）（德）蛋白质、细胞及细胞核化学蛋白质、细胞及细胞核化学研究（研究（首先分离到首先分离到A、T和组氨酸和组氨酸）第14页 1958 莱德伯格莱德伯格 Lederberg（美）（美）噬菌体转导噬菌体转导比德尔比德尔 Beadle&泰特姆泰特姆 Tatum（美）（美）One gene-one enzyme红色面包霉突变体红色面包霉突变体Beadle TatumLederberg 第15页 1959 奥乔亚奥乔亚 Ochoa(美籍西班牙裔美籍西班牙裔)科恩伯格科恩伯格 Kornberg（美）（美）Ochoa Kornberg 细菌多核苷酸磷酸化酶，成功地合细菌多核苷酸磷酸化酶，成功地合 成了成了RNARNA，基因（，基因（DNADNA）RNARNA蛋白质蛋白质 实现了实现了DNADNA分子在试管内（细菌无细分子在试管内（细菌无细 胞提取液）复制胞提取液）复制第16页 1962 Watson（美）（美）Crick（英）（英）Wilkins（新西兰）（新西兰）经过经过DNADNA分子分子X X射线衍射研射线衍射研究证实究证实 DNA Double Helix Model第17页DNADNA双螺旋发觉深刻意义双螺旋发觉深刻意义双螺旋发觉深刻意义双螺旋发觉深刻意义nn确立了核酸作为信息分子结构基础确立了核酸作为信息分子结构基础确立了核酸作为信息分子结构基础确立了核酸作为信息分子结构基础;nn提出了碱基配对是核酸复制、遗传信提出了碱基配对是核酸复制、遗传信提出了碱基配对是核酸复制、遗传信提出了碱基配对是核酸复制、遗传信息传递基本方式；息传递基本方式；息传递基本方式；息传递基本方式；nn最终确定了核酸是遗传物质基础；最终确定了核酸是遗传物质基础；最终确定了核酸是遗传物质基础；最终确定了核酸是遗传物质基础；nn为认识核酸与蛋白质关系及其在生命为认识核酸与蛋白质关系及其在生命为认识核酸与蛋白质关系及其在生命为认识核酸与蛋白质关系及其在生命中作用打下了最主要基础。中作用打下了最主要基础。中作用打下了最主要基础。中作用打下了最主要基础。第18页 1962 肯德鲁肯德鲁 Kendrew 佩鲁茨佩鲁茨 Perutz（英国）（英国）Kendrew Perutz 测定了肌红蛋白及血红蛋白高级结构（三级）测定了肌红蛋白及血红蛋白高级结构（三级）成为硕士物大分子结构先驱成为硕士物大分子结构先驱第19页 1965 雅各布雅各布 Jacob 莫诺莫诺 Monod（法国）（法国）Jacob Monod 提出并证实了提出并证实了Operon作为调整细菌细胞代谢分子机制作为调整细菌细胞代谢分子机制首次提出首次提出mRNAmRNA分子存在分子存在第20页 1969 Nirenberg（美）（美）Holly Khorana尼伦伯格尼伦伯格Nirenberg克拉纳克拉纳Khorana 霍利霍利Holley 破译了遗传密码破译了遗传密码酵母酵母phetRNAphetRNA核核苷酸序列并证实苷酸序列并证实了全部了全部tRNAtRNA三级三级结构相同性结构相同性第一个合成了核第一个合成了核酸分子，并人工酸分子，并人工复制了酵母基因复制了酵母基因第21页 1975 Temin，Baltimore(美美)&Dulbecco特明特明Temin巴尔摩巴尔摩Baltimore发觉了逆转录酶（以发觉了逆转录酶（以RNARNA为模板，逆转录生成为模板，逆转录生成DNA RNADNA RNA肿瘤病毒）肿瘤病毒）杜尔贝克杜尔贝克 Dulbecco第22页桑格桑格 Sanger吉尔伯特吉尔伯特 Gilbert伯格伯格 Berg 1980 Sanger（英）（英）Gilbert&Berg（英）（英）酶法核苷酸测酶法核苷酸测序设计者序设计者化学测序法设计者化学测序法设计者DNADNA重组，在细菌中表重组，在细菌中表达胰岛素达胰岛素DNADNA重组技术元老重组技术元老Sanger还因为测定了牛胰岛素一级结构而取得还因为测定了牛胰岛素一级结构而取得1958年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。第23页 1984 Kohler（德）（德）Milstein（美）（美）Jerne（丹麦）（丹麦）科莱尔科莱尔Kohler米尔斯坦米尔斯坦Milstein杰尼杰尼 Jerne发展了单克隆抗体发展了单克隆抗体(Monoclonal Antibodies McAb)(Monoclonal Antibodies McAb)技术，技术，完善了极微量蛋白质检测技术完善了极微量蛋白质检测技术第24页 1988 麦克林托克麦克林托克 McClintock(美美)可移动遗传因子可移动遗传因子（jumping gene or mobile element）McClintock5050年代初发觉年代初发觉8888年获奖年获奖第25页 1989 奥尔特曼奥尔特曼 Altman（加）（加）切赫切赫 Cech（美）（美）核酶即核糖核酸质酶核酶即核糖核酸质酶（Ribozyme）发觉者（即一些发觉者（即一些RNARNA含有酶含有酶功效）功效）SidneyAltman ThomasR.Cech 第26页 1989 BishopVarmus（美）（美）正常细胞一样带有原癌基因正常细胞一样带有原癌基因 1993 Roberts Sharp（美）（美）断裂基因断裂基因（splitting gene）Mullis（美）（美）PCR仪创造者仪创造者 Smith 基因定点突变基因定点突变 1994 Gilman Rodbell 发觉发觉G G蛋白在细胞信号传导中作用蛋白在细胞信号传导中作用 1995 Lewis（美）、（美）、NussleinVolhard（德）、（德）、Wieschaus（美）（美）2020世纪世纪40407070年代先后独立年代先后独立判定了控制果蝇体节发育基因判定了控制果蝇体节发育基因第27页n1990.10：被誉为生命科学“阿波罗登月计划”n 人类基因组计划（HGP）开启。n1998.5：美国科学家克里格文特创建塞莱拉遗传企业，目标是投入亿美元，到年绘制出完整人体基因组图谱，与国际HGP展开竞争。n1999.12.1：国际HGP联合研究小组宣告，他们完整地破译出人体第22对染色体遗传密码。n2000.3.14：当初美国总统克林顿和英国首相布莱尔发表联合申明，呼吁将人类基因组研究结果公开，方便世界各国科学家都能自由地使用这些结果。n2000.5：国际HGP完成时间预计从原定年6月提前至6月。n2000.6.26：科学家公布人类基因组“工作框架图”。n2001.2：国际HGP(美、英、日、德、法和中国)科学家和美国塞莱拉企业分别宣告完成绘制人类基因组测序草图。分别在15日出版Nature和16日Science公布。人类基因组计划人类基因组计划人类基因组计划人类基因组计划(Human Genome Project)Human Genome Project)第28页“WhatsHumanGenomeProject?”“OnebaseOnedollar!”-byataxidriver(andataxpayer)第29页humanArabidopsis拟南芥拟南芥Thermotoga maritimaEscherichia coli大肠杆菌大肠杆菌Buchnerasp.APSRickettsia prowazekiiUreaplasma urealyticumBacillus subtilisDrosophila melanogasterThermoplasma acidophilumPlasmodium falciparumHelicobacter pylori mouseCaenorhabitis elegansratBorrelia burgorferiBorrelia burgorferiAquifex aeolicusNeisseria meningitidis Z2491Mycobacterium tuberculosis 全基因组已经测序一些生物全基因组已经测序一些生物第30页生物化学与分子生物学意义生物化学与分子生物学意义 1.生物化学是各门生物科学基础，也是揭开生命生物化学是各门生物科学基础，也是揭开生命奥秘主要基础。奥秘主要基础。2.生物化学在工业上广泛应用生物化学在工业上广泛应用比如：食品工业中酱油 大豆蛋白 曲霉水解 氨基酸 美拉德反应 酱油啤酒生产：啤酒生产：大麦芽大麦芽+大米大米 麦芽糖、葡萄糖麦芽糖、葡萄糖+氨基酸氨基酸 啤酒酵母（啤酒酵母（7 7天）天）乙醇、糖、乙醇、糖、双乙酰双乙酰 低温发酵（低温发酵（2020天）天）啤酒啤酒第31页生物有效物质提取生物有效物质提取制药工业：链激酶、尿激酶、氨基酸、核甘酸（所谓基因营养物）、SOD、紫杉醇等。生物制品：疫苗 皮革工业：角质酶脱毛 生物化学不但为这些生产过程建立了科学基础并生物化学不但为这些生产过程建立了科学基础并为其技术改造创造了条件为其技术改造创造了条件第32页与农业方面有亲密联络与农业方面有亲密联络 举例举例n作物病理研究作物病理研究 a.a.玉米大斑病（每年损失玉米大斑病（每年损失20-40%20-40%产量）产量）抗病蛋白抗病蛋白 b.b.水稻白叶枯病（损失水稻白叶枯病（损失20-30%20-30%产量）产量）n奶牛产奶量与营养关系奶牛产奶量与营养关系 中国奶牛中国奶牛 普通普通4-54-5吨吨/年产年产 国外奶牛国外奶牛 8-108-10吨吨/年产年产 食量自动化，营养个体化食量自动化，营养个体化第33页重组重组DNA技术应用技术应用第34页1 2 1 2野生型转基因抗真菌病转基因草坪草抗真菌病转基因草坪草抗棉铃虫棉花抗棉铃虫棉花抗虫水稻抗虫水稻第35页全球转基因农作物销售额及预测第36页生物工程生物工程n作物防虫（转基因棉花、转基因西红柿）n生物制药（转基因动物-人血白蛋白）n作物育种（转基因水稻-抗除草剂）第37页A tobacco plant expressing the gene for firefly luciferase.Lightwasproducedaftertheplantwaswateredwithasolutioncontainingluciferin,thesubstrateforthelight-producingluciferaseenzyme(seeBox132).Dontexpectglow-in-the-darkornamentalplantsatyourlocalplantnurseryanytimesoon.Thelightisactuallyquiteweak;thisphotographrequireda24-hourexposure.Therealpointthatthistechnologyallowstheintroductionofnewtraitsintoplantsisneverthelesselegantlymade.烟草表示萤火虫烟草表示萤火虫荧光素基因荧光素基因第38页表示抗虫基因西红表示抗虫基因西红柿柿第39页Glyphosate-resistant soybean plants.ThephotographsshowtwoareasofasoybeanfieldinWisconsin.(a)Withoutglyphosatetreatment,thispartofthefieldisoverrunwithweeds.(b)Glyphosateresistantsoybeanplantsthriveintheglyphosate-treatedsectionofthefield.Glyphosatebreaksdownrapidlyintheenvironment.Agriculturaluseofengineeredplantssuchastheseproceedsonlyafterconsiderabledeliberation,balancingtheextraordinarypromiseofthetechnologywiththeneedtoselectnewtraitswithcare.Bothscienceandsocietyasawholehaveastakeinensuringthattheuseoftheresultantplantshasnoadverseimpactontheenvironmentoronhumanhealth.转草甘膦基因大豆第40页Cloning in mice.Thegeneforhumangrowthhormonewasintroducedintothegenomeofthemouseontheright.Expressionofthegeneresultedintheunusuallylargesizeofthismouse.表示人生长激素表示人生长激素老鼠老鼠第41页喷洒工程菌去除石油污染美国美国 GE GE 企业结构成功含有巨大烃类分解能力企业结构成功含有巨大烃类分解能力工程菌，并获专利，用于去除石油污染。工程菌，并获专利，用于去除石油污染。第42页生化与司法判定生化与司法判定司法判定是健全法制中一个必需工作步骤，它包含了法律上要判定一切事、屋和人。n受伤与死亡现象中生化 a.DNA含量随死亡时间而下降 b.心肌丁二酸脱氢酶、细胞色素氧化酶 随死亡时间而上升 c.精子DNA第43页DNA指纹技术应用指纹技术应用JJ亲子判定亲子判定亲子判定亲子判定（VNTRVNTR）第44页亲子判定风靡意亲子判定风靡意大利（大利（几十万）几十万）当代家庭当代家庭“情流感情流感”第45页J 犯罪分析犯罪分析 血液、唾液、头发、血液、唾液、头发、血液、唾液、头发、血液、唾液、头发、精液和其它出现在犯精液和其它出现在犯精液和其它出现在犯精液和其它出现在犯罪现场样品成为嫌疑罪现场样品成为嫌疑罪现场样品成为嫌疑罪现场样品成为嫌疑犯被监禁或释放强有犯被监禁或释放强有犯被监禁或释放强有犯被监禁或释放强有力证据力证据力证据力证据 误差率在百万分之误差率在百万分之误差率在百万分之误差率在百万分之误差率在百万分之误差率在百万分之一以下，结果非常准一以下，结果非常准一以下，结果非常准一以下，结果非常准一以下，结果非常准一以下，结果非常准确。确。确。确。确。确。第46页JJ DNA DNA DNA DNA身份证身份证身份证身份证 DNA DNA DNA DNA DNA DNA 指纹技术让你能拥有一张独一无二真正意义上个人识指纹技术让你能拥有一张独一无二真正意义上个人识指纹技术让你能拥有一张独一无二真正意义上个人识指纹技术让你能拥有一张独一无二真正意义上个人识指纹技术让你能拥有一张独一无二真正意义上个人识指纹技术让你能拥有一张独一无二真正意义上个人识别身份证。别身份证。别身份证。别身份证。别身份证。别身份证。个人个人DNADNA基因身份证基因身份证第47页第一章：生物大分子提第一章：生物大分子提取、沉淀和离心分离取、沉淀和离心分离第48页第一节 生物大分子提取生物大分子提取 蛋白质（包含酶），核酸，脂类，糖类等生物大分子制备分四个阶段：一.选择材料和预处理 二.细胞破碎及细胞组分分离 三.提取和纯化 四.浓缩，干燥和保留 第49页一一.选择材料及预处理选择材料及预处理 动物，植物，微生物都可作为制备生物大分子原材料，所选取材料主要依据试验目标来确定。有效成份有效成份是指欲纯化某种单一生命大分子物质。而有效成份以外其它物质则统称杂质。第50页1.动物组织：选材：必须选择有效成份含量丰富且易分离脏器组织为原材料。脱脂：脏器中含量较高脂肪，轻易氧化酸败，造成原料变质影响纯度操作和制品率。保留：对预处理好材料，若不马上进行试验，应冷冻保留。a.冰冻：剥去脂肪和筋皮等结缔组织，短期保留：10冰箱内；长久保留：70低温冰箱内。b.干燥：对于像脑垂体一类小组织，可置丙酮液中脱水，干燥后磨粉储存备 用；对于含耐高温有效成份（如：肝素）肠粘膜，可在沸水蒸煮处理，烘干后能长久保留。第51页2.植物材料：选材：注意植物品种和生长发育情况不一样，其中所含生物大分子量改变很大，另外与季节性关系亲密。a.a.提取核提取核DNADNA：选取黄化苗（生长710天小麦，水稻），预防叶绿体DNA干扰 b.b.提取提取RNARNA：依据试验目标选取生长幼嫩组织为好。保留：冷冻采样后尽快放于420冰箱内。DNA,RNA 采样后，N2速冻，至70冰箱。对RNA样，如不马上使用，冷冻保留尤为主要。第52页3.微生物：选材：应注意它生长久，在微生物对数生长久，酶和核酸含量较高，能够取得高产量，以微生物为材料时有两种情况：a.a.利用微生物菌体分泌到培养基中代谢产物和胞外酶等。普通用离心法搜集上清液，上清液只能在低温下短期保留 b.b.利用菌体含有生化物质，如：蛋白质，核酸和胞内酶等。需破碎菌体细胞分离，湿菌体可低温短期保留，冻干粉可在4保留数月。3.第53页二二.确定测定方法确定测定方法 在效成份在原材料中含量较低，纯化是使其纯度增高过程，所以，提取和分离每个步骤均要测定有效成份含量。测定方法要专一、准确、灵敏和简便。使用较多测定方法有分光光度法、荧光分析法、生物活性(如酶活力、激素活性)测定、电泳分析等，有时可用电化学法和免疫分析法。第54页三三.细胞破碎细胞破碎1.机械破碎：(1)研磨法：剪碎动物组织如鼠肝、兔肝等置研钵中，用研磨棒研碎。为了提升研磨效果，可加入一定量石英砂。用匀浆器处理，也能破碎动物细胞。细菌和植物组织细胞破碎均可用此法。第55页(2)组织捣碎器法：用捣碎器(转速8000-10000r/m)处理30-45s可将植物和动物细胞完全破碎。不过在捣碎期间必须保持低温，捣碎时间不易太长，以防温度升高引发有效成份变性。现在多用细胞破碎仪。(3)超声波法：借助声波震动力破碎细胞壁和细胞器有效方法。多用于微生物细胞破碎，常采取间歇处理和降低温度方法进行。第56页(4)压榨法：是一个温和、彻底破碎细胞方法。用30MPa左右压力迫使几十毫升细胞悬液经过一个小孔(细胞直径孔)，致使其被挤破、压碎。(5)冻融法：将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下(或40左右)快速融化。如此重复冻融屡次，细胞可在形成冰粒和增高剩下胞液盐浓度同时，发生溶胀、破碎。第57页2.溶涨和自溶：溶涨：细胞膜为天然半透膜，在低渗溶液如低浓度稀盐溶液中，因为存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，引发细胞膜发生胀破现象称溶胀。比如红血球置清水中会快速溶胀破裂并释放出血红素。自溶：细胞结构在本身所含有各种水解酶如蛋白酶和酯酶等作用下，发生溶解现象称自溶。应用此法时要尤其小心操作，因为水解酶不但可使细胞壁、细胞膜破坏，同时也可将一些有效成份在自溶时分解。3.化学处理：用脂溶性溶剂(如丙酮、氯仿、甲苯)或表面活性剂(如十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠)处理细胞时，可将细胞壁、细胞膜结构部分溶解，进而使细胞释放出各种酶类或DNA等物质，并造成整个细胞破碎。第58页4.生物酶降解：生物酶(如溶菌酶)有降解细菌细胞壁功效。在用此法处理细菌细胞时，先是细胞壁消解，随之而来是因渗透压差引发细胞膜破裂，最终造成细胞完全破碎。比如从一些细菌细胞提取质粒DNA时，不少方法都采取了加溶菌酶(来自蛋清)破坏细胞壁步骤。当有些细菌对溶菌酶不敏感时，可加巯基乙醇（ME）或者8mol/L尿素，以促进细胞壁消化。另外，也可加入蛋白酶K来提升破壁效果。第59页四四.抽提抽提1.抽提含义：抽提通常是指用适当溶剂和方法从原材料中把有效成份分离出来过程。经过处理原材料中有效成份可用缓冲液、稀酸、稀碱、或有机溶剂（如丙酮、乙醇）等抽提，有时还可用蒸馏水抽提。普通理想抽提液应具备下述条件：对有效成份溶解度大，破坏作用小；对杂质不溶解或溶解度很小；起源广泛、价格低廉、操作安全等。第60页2.抽提影响因子 在抽提阶段，pH值、金属离子、溶剂浓度和极性等因子，可显著影响有效成份性质和数量。所以选择抽提液必须考虑这些原因。（1）pH值：改变溶质解离状态。对蛋白质或酶等含有等电点两性电解质物质，普通选择抽提液pH值应在偏离等电点稳定范围内。通常碱性蛋白质选取低pH值溶液抽提，酸性蛋白质选取高pH值溶液抽提。第61页(2)溶剂极性和离子强度：有些生物大分子在极性大、离子强度高溶液中稳定；有些则在极性小、离子强度低溶液中稳定。比如提取刀豆球蛋白A时，用0.15mol/L甚至更高浓度NaCl溶液，都可使其从刀豆粉中溶解出来，稳定存在。而抽提脾磷酸二酯酶时，则需用0.2 mol/L蔗糖水溶液。一个物质溶解度大小与溶剂性质亲密相关（相同相溶原理）；离子强度经过影响溶质带电性也影响溶质溶解度。降低极性：在水溶液中加蔗糖，甘油，二甲亚砜，二甲基甲酰氨。第62页 提升离子强度：在水溶液中加中性盐（KCl,NaCl,NH4Cl,(NH4)2SO4）普通离子强度较低中性盐溶液可促进蛋白溶解（盐溶），高离子强度中性盐可引发蛋白质沉淀，析出（盐析）。高离子强度使DNA溶解度增加；低离子强度使RNA溶解度增加（核酸分离依据）。惯用盐溶液是NaCl溶液，浓度以0.15mol/L为宜。不过在提取核蛋白或细胞器中蛋白质时，为促使蛋白质与核酸、蛋白质与细胞器分离，则宜用高浓度(0.5-2.0mol/L)盐溶液。第63页(3)水解酶：细胞破裂后，许多水解酶释放出来。水解酶与欲抽提蛋白质或核酸接触时，一旦条件适宜，就会发生反应，造成蛋白质或核酸分解，而使试验失败。为此，必须采取加入抑制剂，调整抽提液pH、离子浓度或极性等方法，使这些酶丧失活性。如：提取，纯化胰岛素时，为阻止胰蛋白酶活化，采取68乙醇溶液（pH2.5-3.0,用草酸调整），在1315抽提3h，可得到较高回收率。因为68乙醇可使胰蛋白酶暂时失活，草酸可除去蛋白酶激活剂Ca2+，酸性环境也抑制酶蛋白活性。RNA提取需预防RNase水解作用，RNase活性很高第64页(4)(4)温度温度：普通认为蛋白质或酶制品在低温(如0左右)时最稳定。比如：在生产人绒毛膜促性腺激素(HCG，糖蛋白)制品时，一定要在低温下进行。当温度低于8时，从200千克孕妇尿中可提取约100克HCG粗品(活力为160u/mg)；当温度高于20时，从400千克孕妇尿中都提取不到100克粗品，而且活力很低。另外，高温下制备HCG粗品极难深入纯化至3500u/mg，原因是高温会使HCG受到微生物和/或糖苷酶破坏。普通提升温度，溶解度增加，但易使大分子物质变性失活。小分子物质：5070；生物大分子：010，最好控制在04第65页（5）搅拌：搅拌能促使欲抽提物与抽提液接触，并能增加溶解度。不过，普通宜采取温和搅拌方法，速度太快时轻易产生泡沫，造成一些酶类变性失活。（6）氧化：普通蛋白质都含相当数量巯基，该基团经常是酶和蛋白质必须基团，若抽提液中存在氧化剂或氧分子时，会使巯基形成份子内或分子间二硫键，造成酶(或蛋白质)失活(或变性)。在提取液中加入巯基乙醇，半胱氨酸。还原性谷胱甘肽等还原剂，可预防巯基发生氧化，使蛋白，酶失活。第66页（7）金属离子：蛋白质巯基还能和金属离子如铅、铁或铜作用，产生沉淀复合物。这些金属离子主要起源于制备缓冲液试剂中。处理方法：用无离子水或重蒸水配制试剂；在配制试剂中加入1-3mmol/LEDTA(金属离子络合剂)。（8）抽提液与抽提物百分比：在抽提时，抽提液与抽提物百分比要适当，普通以51为宜。如抽提液过多，则有利于有效成份提取，但不利于纯化工序进行。第67页第二节第二节 沉淀分离技术沉淀分离技术 沉淀法也称溶解度法，其纯化生物大分子原理是依据物质结构差异（如蛋白质分子表面疏水基团和亲水基团百分比差异）来改变溶液一些性质（如pH值、极性、离子强度、金属离子等），使抽提液中有效成份溶解度发生改变，从而到达从抽提液中分离有效成份目标。蛋白质和核酸在组成、结构及性质等方面有显著差异，所以制备这两种大分子时，所用试剂和操作方法也不完全相同。第68页一一.蛋白质沉淀分离蛋白质沉淀分离（一）盐析沉淀法1.盐析原理 定义：普通在低盐浓度情况下，蛋白质溶解度随盐浓度升高而增加，这种现象称为盐溶；而当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质溶解度又伴随盐浓度升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析作用。在同一浓度盐溶液中，不一样蛋白质溶解度不一样，借此可到达彼此分离目标。第69页第71页2.盐选择：蛋白质盐析通常采取中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等，其中应用最广是硫酸铵。硫酸铵是一中性盐，对蛋白质有相当好安定作用。硫酸铵在水中溶解度大而温度影响小(25时溶解度为4.1mo l/L，即767g/L;0时溶解度为3.7mol/L，即697g/L)，而且价廉易得，不易引发蛋白质变性，分离效果比其它盐好。不过用硫酸铵盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子会干扰蛋白氮测定，故有时也要用其它盐来进行盐析。磷酸钾和硫酸钠盐析系数Ks较大，但因为在较低温度下溶解度太低,受温度影响大，故应用不广泛。第72页3.硫酸铵浓度计算与调整方法:通常硫酸銨添加以百分饱和度來表示(不是浓度百分比)，比如大部分蛋白质可在 80%硫酸銨飽和度下沉淀。因为硫酸銨加入体积很大，会改变最终总体积，极难由浓度百分比來計算，所以使用百分饱和度作为沉淀蛋白质度量。用硫酸铵进行盐析时，蛋白质溶液中硫酸铵浓度调整方法主要有二种：（1）加入饱和溶液法 要求：蛋白质溶液体积不大，所需调整硫酸铵浓度不高 V=VV=V0 0(S(S2 2-S-S1 1)/)/（1-S1-S2 2）V:所需加进饱和硫酸铵溶液体积；V0:原溶液体积；S2：所需到达硫酸铵饱和度；S1:原溶液硫酸铵饱和度。饱和硫酸铵配制方法：在一定量水中加入过量硫酸铵，加热至5060，趁热滤去沉淀，再在0或室温平衡12天，有固体析出时达100饱和度。第73页(2)加入固体盐法 要求：饱和度高，不增大溶液体积 t=G(St=G(S2 2-S-S1 1)/)/（1-AS1-AS2 2）S2，S1:分别代表所需到达硫酸铵饱和度和原溶液硫酸铵饱和度；t：将1L S1饱和度溶液提升到S2饱和度时所需加进硫酸铵克数；G,A：常数，与温度相关。实际使用时，t可直接查表得到。（注意：0，25两张表，室温用25）第74页第75页4.影响蛋白质盐析原因：（1）蛋白质浓度 蛋白质浓度高时，欲分离蛋白质经常夹杂着其它蛋白质一起沉淀出来（共沉现象）。所以在盐析前要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2530g/L。（2）离子强度和离子类型影响 a.离子强度增加，溶解度下降，盐析易发生 b.不一样蛋白质盐析时所需离子强度不一样，可采取分步盐析，经过逐步增加离子强度，使不一样蛋白分步沉淀出来 c.离子强度相同时，高价离子，半径小离子盐析力强 第76页（3）pH影响 大多数蛋白质在等点电时，在盐溶液中溶解度最低。所以盐析时溶液pH值调到等电点效果最好。（4）温度影响 a.在低离子强度或纯水中，温度升高，溶解度增加；b.在高盐溶液中，温度升高，溶解度降低。普通在室温下进行盐析;温度敏感蛋白质在低温4进行;也有个别酶在低温时失活，高温有活性,如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在25比0时溶解度低，更轻易盐析。第77页5.盐析时注意事项：（1）添加硫酸铵纯度要高，添加后，要放30min以上使其充分溶解，且要不停搅拌，预防局部过浓，发生共沉淀；（2）同一溶液中欲分离几个蛋白质时，可采取分段盐析方法。盐析通常与等电点沉淀法配合使用。（3）选择好温度，普通在室温下进行；（4）蛋白浓度不易过高，普通2530g/L；低浓度盐析，可用离心分离；高浓度盐析（7080），用过滤（因为粘度大，离心操作慢）；盐析沉淀得到蛋白质含量较高，纯品需经脱盐处理，如透析，凝胶过滤等。第78页（二）等电沉淀法：利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不一样蛋白质含有不一样等电点一这特征，对蛋白质进行分离纯化方法称为等电点沉淀法。第79页（三）有机溶剂沉淀法：作用机理：（1）降低水溶液介电常数，使溶质溶解度降低；（2）破坏大分子周围水膜，使溶解度降低。利用不一样蛋白质在不一样浓度有机溶剂中溶解度不一样而使蛋白质分离方法，称为有机溶剂沉淀法。经常使用有机溶剂是乙醇和丙酮。优点：比盐析法析出沉淀轻易过滤或离心分离，分辨力比盐析法好，溶剂也轻易除去。第80页缺点：有机溶剂沉淀法易使蛋白质和酶变性，所以操作必须在低温条件下进行。蛋白质和酶沉淀分离后，应马上用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度，防止变性。有机溶剂沉淀法普通与等电点沉淀法联合使用。即操作时溶液pH值应控制在欲分离蛋白质等电点附近。第81页注意：（1)低温操作（2）样品浓度过大，易变性，共沉淀作用大，分离效果差；过小，易产生变性，回收率低。（3）样品稳定结构范围内，选择溶解度最低处pH，即与等电点共沉淀结合使用。（4)注意离子强度，离子种类影响。第82页（四）选择性变性沉淀法：选择一定条件使溶液中存在一些杂蛋白变性沉淀而不影响所需蛋白质方法称为选择性变性沉淀法。比如：利用加热，改变pH或加进一些重金属离子等使杂蛋白变性沉淀而除去。应用此法，应对欲提纯蛋白质和杂蛋白理化性质有较全方面了解。第83页（五）非离子多聚物沉淀法：聚乙二醇（PEG），葡聚糖，右旋糖苷硫酸钠等非离子多聚物能够沉淀蛋白质和细菌。沉淀机理：空间位置排斥效应。试剂溶解度大，在水中占据大部分空间，将需沉淀物相互靠近，增加碰撞机率。优点：（1）操作条件温和，不易引发变性；（2）含有极高沉淀效率；（3）沉淀后多聚物轻易除去。第84页二二.核酸提取与沉淀分离核酸提取与沉淀分离 核酸类化合物都溶于水而不溶于有机溶剂。所以核酸可用水溶液提取，而用有机溶剂沉淀法沉淀分离。从生物材料中分离出DNA和RNA，往往是以DNA-蛋白质（DNP）或RNA-蛋白质（RNP）复合物形式存在。所以，要制备初步纯化核酸时，首先要分离出DNP或RNP，再将复合物解聚，除去蛋白质，然后经过沉淀法得到核酸。DNP 在0.14mol/L氯化钠溶液中，RNP 溶解度相当大，而DNP溶解度仅为在水中溶解度1%；当氯化钠浓度到达1mol/L时候，RNP溶解度小，而DNP溶解度比在水中溶解度大2倍。所以常选取0.14mol/L氯化钠溶液提取RNP，而选取1mol/L氯化钠溶液提取DNP。DNP第85页1.DNP/RNP复合物解聚：主要采取加入去污剂、有机溶剂和蛋白水解酶等试剂来实现。去污剂：在破碎细胞溶液中，加入适量阴离子去污剂SDS、Triton X-100、Tween 40 和 NP-40 等，有利于膜蛋白和脂肪溶解，将DNP/RNP复合物解聚，进而释