猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定.pdf

D0I:10.16656/.issn.1673-4696.2024.0017文章编号：16 7 3-4696(2024)02-0217-09中图分类号：S852.659.2文献标志码：A网络首发时间：2 0 2 3-10-2 62024,54(02):217-225中国兽医科学2024,54(02)ChineseVeterinaryScience猪圆环病毒2 型Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定张英婕1,周文锋1,邹亚文1，白一涵1，蒋一凡,湛洋1,王乃东1，杨毅1,杜红梅3,王东亮*1,2（1.湖南农业大学动物医学院兽用蛋白质工程疫苗湖南省重点实验室兽用疫苗逆向创制湖南省工程研究中心，湖南长沙410 12 8；2.湖南大学生物学院，湖南长沙410012;3.常德市畜牧水产事务中心，湖南常德415003)摘要：本研究旨在制备猪圆环病毒2 型(PCV2)Cap蛋白单克隆抗体(mAb),为PCV2免疫学诊断方法的建立和应用提供特异性抗体。首先通过原核大肠杆菌表达系统表达PCV2Cap蛋白，将纯化后的Cap蛋白在体外组装成病毒样颗粒(VLPs),以VLPs作为免疫原免疫BALB/c小鼠，使用杂交瘤细胞技术筛选能稳定分泌抗PCV2Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。进一步制备单抗腹水并纯化，通过Western-blot和IFA方法对单克隆抗体的特异性进行鉴定。采用逐步截取法合成45条覆盖PCV2Cap蛋白全长的短肽，并通过间接ELISA鉴定单克隆抗体识别的表位区域。利用两株mAbs对人工感染PCV2的猪肺脏组织进行免疫组化(IHC)检测鉴定。结果表明，成功筛选两株识别PCV2Cap蛋白单克隆杂交瘤细胞株，分别命名为1A6和1A8，其中1A6重链为IgG2b亚型,1A8重链为IgG1亚型，轻链均为k链，纯化后的抗体效价均达1：6 56 10 0。IFA结果显示，两株mAbs均能与PCV2感染的PK-15细胞发生特异性反应；Western-blot结果显示，两株mAbs均与PCV2Cap蛋白发生特异性反应，且不与PCV3和PCV4Cap蛋白发生交叉反应；所获抗体均识别PCV2Cap蛋白C端2 11-2 2 5aa肽段;IHC检测结果表明，两株mAbs均能与感染PCV2的临床样品发生特异性免疫反应。本研究成功获得了两株单克隆抗体1A6和1A8,均能识别PCV2Cap蛋白，具有良好的特异性，为PCV2免疫学诊断方法的建立及Cap蛋白生物学功能研究提供了重要生物材料。关键词：猪圆环病毒2 型；Cap蛋白；原核表达系统；病毒样颗粒；单克隆抗体Preparation and identification of monoclonal antibodies of porcinecircovirus type 2 capsid proteinZHANG Yingjie,ZHOU Wenfeng,ZOU Yawen,BAI Yihan,JIANG Yifan,ZHAN Yang,WANG Naidong,YANG Yil,DU Hongmeif,WANG Donglangl.2(1.Research Center of Reverse Vaccinology of Hunan Province/Hunan Provincial Key Laboratory of Protein Engineering in AnimalVaccines,College of Veterinary Medicine,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China;2.College of biology,HunanUniversity,Changsha 410012,China;3.Changde Animal Husbandry and Fishery Center,Changde 415003,China)Abstract:This study aims to prepare monoclonal antibody(mAb)to capsid(Cap)protein of porcinecircovirus type 2(PCv2),and to the develop and apply immunological diagnostic methods.First,PCv2 Cap protein was expressed in Escherichia coli,and the purified Cap protein was assembledinto virus-like particles(VLPs)in vitro.BALB/c mice were immunized with VLPs.Hybridoma cell technology收稿日期：2 0 2 3-0 8-12；修回日期：2 0 2 3-10-2 3基金项目：国家自然科学基金项目（32 17 2 8 44)；湖南省自然科学基金项目（2 0 2 3JJ40134）；湖南省技术攻关“揭榜挂帅 项目(2021NK1030)作者简介：张英婕（1999-），女，湖南石门人，硕士生，研究方向为分子病毒学,E-mail:；*通讯作者：王东亮，博士，主要从事分子病毒学研究，E-mail：d o n g l i a n g w a n g s t u.h u n a u.e d u.c n。218第54卷中国兽医科学was used to screen hybridoma cell lines that could secrete monoclonal antibodies against PCv2 Capprotein statically.Monoclonal ascites were further prepared and purified,and the specificity ofmonoclonal antibodies was identified by Western-blot and IFA methods.Forty-five short peptidescovering the full length of PCv2 Cap protein were synthesized by stepwise interception method,andthe epitope regions recognized by monoclonal antibodies were identified by indirect ELISA.Twostrains of mAbs were used to detect and identify PCv2 in lung tissues of clinically infected pigs byimmunohistochemistry(IHC).Two mAbs(1A6 and 1A8)were obtained,and mAb 1A6 and 1A8 belong to IgG2b andIgGl subclass,respectively,both had k light chain.The titers of these two mAbs were 1:656 100,respectively.IFA results showed that both mAbs could react specifically with PCv2-infected PK-15cells.Western-blot results showed that both strains of mAbs reacted specifically with PCv2 Capprotein,and did not cross-react with PCV3 and PCV4 Cap protein.Both mAbs could recognize the 21l-225 aapeptide at C-terminal of PCV2 Cap protein.IHC results showed that both mAbs could specificallyrecognize PCV2-infected clinical samples.In this study,2 mAbs(1A6 and 1A8)were successfully obtained,both of which can recognize Pcv2 Cap with good specificity,providing important biological materialsfor the establishment of PCv2 immunological diagnostic method and the study of biological functionof PCV2 Cap protein.Key words:porcine circovirus type 2;Cap protein;prokaryotic expression system;virus-like par-ticle;monoclonal antibody*Corresponding author:WANG Dongliang,E-mail:dongliangwangstu.hunau,猪圆环病毒(porcine circoviruses,PCVs)为圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)成员，是目前已知最小的动物病毒之一1。目前PCVs含有四个型，按照被发现的时间顺序分别命名为PCV1、PCV2、PCV3和PCV42。PCV1不具有致病性3,PCV3和PCV4的致病性还尚不清楚4。PCV2于上个世纪90 年代在患有断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的临床样品中首次发现报道5,是造成猪圆环病毒相关性疾病(porcine circovirus associated diseases,PCVADs)的主要病原体6 ,包括呼吸系统疾病(res-piratory disease)、肠道疾病(enteric disease)和繁殖障碍疾病(reproductive disease)等7 。PCV2感染可造成机体的免疫抑制，引起猪的亚临床症状，还常与其它病原体发生混合感染8 ,自PCV2在全球范围内流行暴发以来，给全球的养殖业造成了巨大的经济损失和严重的环境灾难9PCV2无囊膜,为单股负链的环状DNA病毒，基因组大小约为1.7 6 kb，编码11个开放阅读框(openreadingframes,ORFs)101,ORF1和ORF2为两个主要的ORFs,ORF1位于病毒正链，ORF2位于病毒负链，其中前者编码与病毒复制相关的Rep蛋白，而后者编码病毒唯一的核衣壳蛋白(capsid protein，Cap),60个Cap蛋白单体组成直径大小为17 2 0nm 的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)。Ca p蛋白免疫原性良好且不发生血清学交叉反应，是当前PCV2免疫学诊断的理想靶点之一。目前在疫苗生产中PCV2VLPs高效定量检测方法、PCV2致病分子机制研究等方面，都需要利用特异性强、灵敏高的抗PCV2抗体进行免疫学检测。因此，本研究通过原核大肠杆菌表达PCV2Cap蛋白制备VLPs,并进一步通过杂交瘤细胞技术获得抗PCV2Cap蛋白单克隆抗体，旨在为PCV2免疫学临床诊断方法的建立及Cap蛋白生物学功能研究提供重要生物材料。1材料与方法1.1试剂PK-15细胞系、SP2/0骨髓瘤细胞、PCV2毒株均为本实验室保存。DMEM培养基、16 40 完全培养基、胎牛血清和新生牛血清均购自Gibco公司。PCV2cap基因与多肽均合成于南京金斯瑞公司、BL21(DE3)感受态购自北京博迈德公司。His-tag抗体购自北京索莱宝公司；FITC标记驴抗家兔IgG、FIT C标记驴抗小鼠IgG、H RP标记的山羊抗小鼠IgG均购自Invitrogen公司。弗氏佐剂、IPTG、PEG 40 0 0、HAT/HT培养基均购自Sigma公司。mAb亚类鉴定试剂盒购自安特柏科技有限公司。镍柱填料、凝胶层析柱Sephacryl S-400和ProteinG柱均购自GE公司。6 周龄雌性BALB/c小鼠购自湖南斯莱克景达公司。人工感染PCV2的猪肺脏组织由本实验室219张英婕等：猪圆环病毒2 型Ca蛋白单克隆抗体的制备与鉴定第2 期保存。1.2重组质粒的构建将PCV2cap基因进行密码子优化和基因合成(GenBanknumber:AHC55218),并将基因片段与原核表达载体pET100D/TOPO进行连接，构建PCV2Cap蛋白重组质粒，PCV3、PCV4Ca p 蛋白重组质粒保存于本实验室，蛋白表达和纯化按本实验室发表的文献进行12 1.3PCV2VLPs的制备将纯化后的PCV2Cap蛋白移入7 0 0 0 D规格的透析袋内，然后把透析袋封口置于体外组装液中，4下透析48 h,进行VLPs的体外组装。1.4PCV2VLPs的组装特性鉴定取10 L透析后样品放置于碳涂层铜网膜上吸附10 min，滤纸吸干铜网膜上多余样品，避光使用1%磷钨酸溶液复染，使用透射电镜对VLPs的形态进行观察。将制备的VLPs通过凝胶层析柱SephacrylS-400进行组装效率鉴定，用BSA作为标准样品，观察VLPs被洗脱的体积大小及紫外吸收峰情况。VLPs的直径通过动态光散射仪进行测量。1.5间接免疫荧光试验（IFA）将PK-15细胞接种至48 孔细胞培养板,待细胞密度长至8 0%90%加入2 gPCV2VLPs,37条件下孵育30 min,弃去培养基,用PBST洗涤3次，加人2 0 0 L预冷的无水乙醇4固定15min，用PB-ST清洗，用0.1%Triton打孔10 min,用PBST清洗，再用3%BSA封闭30 min；弃掉封闭液，加入2 0 0 L家兔抗PCV2Cap蛋白多克隆抗体(1:10 0 0)孵育1h,用PBST清洗，再加入2 0 0 LFITC标记驴抗家兔的荧光二抗（1：2 0 0 0)避光孵育45min,用PBST清洗，用DAPI染核，在荧光显微镜下观察结果。将PK-15细胞接种至48 孔细胞培养板,待细胞密度长至6 0%7 0%接种PCV2病毒液,阴性对照组不接种病毒，接种病毒后第3天按照上述方法进行间接免疫荧光试验，一抗为单克隆抗体1A6和1A8（1：2 0 0 0），二抗为FITC标记驴抗小鼠的荧光二抗(1:2 0 0 0)。1.6小鼠免疫将制备的PCV2VLPs混合弗氏佐剂，选用6 周龄雌性BALB/c小鼠,采取皮下多点注射的方式免疫，每只2 0 g，免疫3次，每次间隔2 周，阴性对照组免疫PBS。首次免疫为弗氏完全佐剂与抗原乳化，加强免疫为弗氏不完全佐剂。三免后第14天进行尾静脉采血，测定小鼠的血清抗体效价，选取效价高的小鼠脾细胞进行细胞融合。细胞融合前5d,进行复腔加强免疫1次，注射的抗原剂量相同但不含佐剂。1.7间接ELISA检测取PCV2VLPs(5g/mL)为抗原，4过夜包被，1%BSA封闭3h,用PBST清洗，再分别加入稀释至1:30 0、1:90 0 1:2 7 0 0、1:8 10 0、1:2 430 0、1:72900、1：2 18 7 0 0、1：6 56 10 0 小鼠血清，阴性对照为免疫PBS的小鼠血清,37 孵育45min,用PBST清洗，加人HRP标记的山羊抗小鼠的IgG,37孵育30min，用PBST清洗，加人TMB显色液50 L，避光显色10 min，2 m o l/LH,SO 4终止反应，在酶标仪上读取D45o值，以P/N值大于2.1倍的最大血清稀释倍数为小鼠血清抗体效价。单抗腹水效价按上述方法测定，阴性对照为SP2/0腹水,阳性对照为免疫PCV2VLPs的小鼠血清1.8单克隆抗体的制备当小鼠血清抗体效价大于1：2 430 0 时进行细胞融合,取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞融合。按常规方法进行细胞融合、阳性杂交瘤细胞筛选及克隆。以PCV2VLPs为包被抗原对融合后的细胞上清进行ELISA检测，挑取OD值高的进行细胞亚克隆，采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞亚克隆3次，获得能稳定分泌抗PCV2Cap蛋白抗体的杂交瘤细胞株。将筛选到的杂交瘤细胞进行扩大培养，注射小鼠腹腔，采用常规的方法制备小鼠腹水，收集的腹水用ProteinG柱纯化单克隆抗体1.9Western-blot鉴定取纯化后的PCV2、PCV 3和PCV4Cap蛋白进行SDS-PAGE电泳，采用湿转印法将蛋白转至PVDF膜上，用3%BSA室温封闭3h，抗His-tag抗体（1：30 0 0）、单克隆抗体1A6和1A8(1：2 0 0 0)为一抗，室温孵育1h,用PBST清洗，加人HRP标记的山羊抗小鼠的IgG,室温孵育1h,用PBST清洗，进行显色拍照1.10单克隆抗体亚类的鉴定根据商品化抗体亚类鉴定试剂盒的说明书进行试验。1.11抗原表位鉴定试验中所需多肽由实验室保存，其合成参考PCV2Cap蛋白氨基酸序列,从N端向C端逐步截取,每条多肽长度设计为15aa，步移5aa即相邻多肽间重叠10aa(第45条多肽由第44条多肽步移4aa后合成),每条多肽的纯度95%，依次编号为P1、P2、P3P44、P45。取P1P45号多肽(10 g/mL)以及上述PCV2VLPs(1g/mL)为抗原4过夜包被，用5%脱脂奶粉溶液封闭3h，一抗孵育1A6和1A8(1:100)，220第54卷中国兽医科学PBS组的小鼠血清作为阴性对照，二抗孵育HRP标记的山羊抗小鼠的IgG，使用TMB显色液显色，2mol/LH,SO4终止反应，读取D450值。1.12生物信息学分析所有PCVs Cap蛋白序列在NCBIGenBank数据库（http：/w w w.n c b i.n l m.n i h.g o v/）下载，使用ESPript3.0在线工具(http:/espriptibcp.fr/ESPript/ESPript/)对氨基酸序列进行比对分析。1.13mAbs在免疫组化(IHC)中的初步应用制备人工感染PCV2的猪肺脏组织的石蜡切片，将切片进行脱蜡和水化，再进行抗原修复、阻断内源性过氧化物酶及血清封闭等操作。将获得的mAbs(1：10 0 0)作为一抗,山羊抗小鼠HRP-IgG作为二抗，经DAB显色、苏木素复染，脱水、封片后置于显微镜下进行结果观察2结果2.1PCV2Cap的表达和纯化将诱导表达后离心收集的菌液进行裂解，经过超声破碎、离心、收获可溶性上清进行镍柱亲和层析纯化后，成功获得PCV2Cap蛋白（大约2 7 ku），大小与预期蛋白分子量大小一致（图1A）,且纯化后的Cap蛋白能被His-tag抗体特异性识别（图1B），以上结果表明,PCV2Cap蛋白成功表达和纯化。M1M1AB180 ku170 ku140ku130 ku100 ku75ku三100ku60 ku70ku55ku45ku40 ku35ku35ku25ku25ku15 ku15 ku图1纯化的PCV2Cap蛋白SDS-PAGE分析（A）及West-ern-blot验证(B)Figure 1 SDS-PAGE and Western-blot analysis of puri-fied PCV2 Cap proteinM：蛋白质分子质量标准；1:PCV2Cap蛋白。M:Protein molecular weight Marker;l:PCV2 Cap protein.2.2PCV2VLPs的组装及特性鉴定电镜结果显示,PCV2Cap蛋白VLPs成功组装，直径大小约为17 2 0 nm（图2 A），动态光散射试验结果显示测量的颗粒直径大小为17.4nm（图2B）,与PCV2病毒颗粒大小一致，组装的颗粒数量所占比例达10 0%。排阻色谱结果显示,BSA样品在7 0 mL体积被洗脱下来，PCV2VLPs在体积为42 mL被洗脱下来,且紫外吸收峰单一，表明所制备的PCV2VLPs组装效率和纯度很高（图2 C）。将制备的PCV2VLPs侵染生长良好的PK-15细胞，IFA结果显示（图3），在PK-15细胞核周围有大量的特异性绿色荧光，而阴性对照组的细胞周围无特异性绿色荧光，表明制备的PCV2VLPs能人侵 PK-15细胞,与野生型病毒特性一致。2.3PCV2VLPs免疫小鼠的血清抗体效价测定血清抗体效价测定结果显示，三免后5只小鼠血清抗体效价均在1：2 18 7 0 0 以上（图4），取效价最高的1号小鼠的脾脏进行后续细胞融合试验2.4间接免疫荧光试验鉴定IFA结果显示（图5），单克隆抗体1A6和1A8均可与感染PCV2的PK-15细胞产生特异性的绿色荧光,而与不接种病毒的正常PK-15细胞（阴性对照)不发生反应，与阳性对照抗PCV2Cap多克隆抗体(PcAb)组结果一致。2.5Western-blot鉴定Western-blot结果显示，单克隆抗体1A6和1A8均能特异性识别PCV2Cap蛋白（图6 A、B)。为进一步验证1A6和1A8与PCV2Cap蛋白反应的特异性,将表达纯化后的PCV3和PCV4Cap蛋白分别与1A6和1A8进行Western-blot试验，抗His-tag抗体作为阳性对照。结果显示,PCV3和PCV4Cap蛋白均能被His-tag抗体特异性识别（图6 C），1A 6 和1A8均不与PCV3和PCV4Cap蛋白反应（图6 A、B），表明所制备的单克隆抗体1A6和1A8具有良好的特异性。2.6单克隆抗体亚类和纯化鉴定单克隆抗体经亚类鉴定显示1A6属于IgG2b亚类,1A8属于IgG1亚类，轻链均为k链。采用ProteinG亲和层析法对1A6和1A8腹水进行纯化（图7），SDS-PAGE分析结果可见纯化后IgG的重链（55ku）和轻链（2 5ku）。采用间接ELISA方法测定纯化后1A6和1A8抗体效价均达到1：6 56 10 0（图8），表明筛选到的两株单克隆抗体均具有良好的亲和力2.7单克隆抗体识别表位鉴定将合成的短肽与制备的mAb进行间接ELISA。mAb1A6和1A8均识别短肽P43和PCV2VLP（图9），初步鉴定出一个被两株单抗均识别的线性表位221张英婕等：猪圆环病毒2 型Ca蛋白单克隆抗体的制备与鉴定第2 期AB40T301000.1110100100010000Size(d,nm)CUV1_280nmCanGUV1_280nmLOCmAUmAU844388850505080R88988BSA(70 ml)PCV2 VLPs(42 ml)10-10-10ml20ml0204060801001201401601800102030405060708090100110 120130140150160 170180图2PCV2VLPs的组装鉴定Figure 2Identification of PCV2 VLPs assemblyA:PCV2VLPs电镜检测；B:PCV2VLPs动态光散射检测；C:排阻色谱鉴定BSA和PCV2VLPs。A:Transmission electron microscopy(TEM)of PCV2 VLPs;B:Dynamic light scattering of PCV2 VLPs;C:Identification of BSA and PCV2 VLPs by sizeexclusion chromatography.AB图3间接免疫荧光试验鉴定PCV2VLPs入侵PK-15细胞Figure33Entry of PCV2VLPs intoPK-15cells identifiedby indirect immunofluorescence assay.A：正常PK-15细胞；BPCV2VLPs入侵PK-15细胞。A:Normal PK-15 cells;B:Entry of PCV2 VLPs into PK-15 cells.3.072.522.031.541.05Control0.50.070010024 30072.900218700抗体稀释滴度Antibodydilution图4PCV2VLPs免疫小鼠的血清抗体效价测定Figure 4Determination of serum titer in PCV2 VLPs im-munizedmice(2112 2 5a a),其氨基酸序列为“2 11YNIRITMYVQF-REFN225”。通过序列分析发现（图10），该表位区域在PCVsCap蛋白中不保守,PCV2P43线性表位与PCV3和PCV4的同源性分别为2 0%和6 0%。因此，本试验获得的两株mAb与PCV3和PCV4Cap蛋白不发生特异性反应,与Western-blot(图6 A、6 B)所得结论一致2.8IHC鉴定选用人工感染PCV2的猪和阴性猪的肺脏组织分别进行IHC检测。结果显示（图11）,2 株单克隆抗体均能特异性的与感染PCV2的猪肺脏组织发生反应，而与阴性猪的肺脏组织不发生反应,表明单克隆抗体1A6和1A8可以应用于IHC的检测。3讨论PCV2传播范围极其广泛，对全球的生猪养殖产生了严重影响,疫苗接种能有效预防猪圆环病毒病13。2006年，首个PCV2商业化疫苗上市，疫苗的接种为临床上防控PCV2的流行和传播起到了重要作用。早期的疫苗为全病毒培养制备的灭活疫苗,随后以PCV2Cap蛋白为抗原的亚单位疫苗相继上市，而在疫苗生产与检验中通常使用免疫学的方法进行评估与检测，如间接免疫荧光和抗原夹心ELISA222第54卷中国兽医科学FITCDAPIMergeNCPcAb1A61A8图5单克隆抗体的间接免疫荧光鉴定（比例尺10 0 m)Figure 5 Dentification of monoclonal antibodies by indirect immunofluorescence assayA1A6B1A8CHis-tagM123M123M1123180ku180 ku180ku140ku140ku140ku100ku100ku100 ku75ku75ku75ku60ku60 ku60 ku45ku45ku45 ku35ku35ku35 ku25ku25ku25ku图6 单克隆抗体1A6和1A8的特异性鉴定Figure 6 Specificity identification of monoclonal antibodies 1A6 and 1A8M：蛋白质分子质量标准；1:PCV2Cap蛋白；2:PCV3Cap蛋白；3:PCV4Cap蛋白。M:Protein molecular weight Marker;1:PCV2 Cap protein;2:PCV3 Cap protein;3:PCV4 Cap protein.等14-15。因此,制备能够特异性识别PCV2 Cap蛋白且具有高亲和力的mAb至关重要。而VLPs与天然病毒粒子构象相似,具有十分良好的免疫原性,其表面展示的抗原表位能够以多价的形式呈递至B细胞表面的BCR(Bcell receptor）,这种多价抗原呈递通过交联多个BCRs从而刺激B细胞产生更强烈的免疫应答，进而产生更高亲和力的特异性抗体16 。本研究采用原核大肠杆菌表达系统高效制备PCV2VLPs，结果显示VLPs的直径大小为17.4nm，与野生型病毒粒子大小相符合，且在体外能够高效人侵PK-15细胞，表明所制备的PCV2VLPs具有与野生型病毒粒子相似的特性。以PCV2VLPs为抗原免疫小鼠制备单克隆抗体。间接免疫荧光结果显示，获得的两株单克隆抗体1A6和1A8均能与PCV2病毒发生特异性反应，其抗体效价均达1：6 56 10 0,表明所获得的两株单克隆抗体与PCV2Cap蛋白具有良好的反应特性和较高的亲和力，后期可用于PCV2疫苗抗原检验方法的建立与应用。PCV2感染会造成淋巴细胞耗竭，引起机体的免疫抑制,临床上PCV2通常与其他病原体发生混合感染。因此,PCV2免疫学诊断方法的精准性对猪圆环病毒病的防控工作而言十分必要。随着新一代测序技术的发展和应用,近年来新型猪圆环病毒(PCV3和PCV4)陆续被发现报道,PCV2还与PCV3、PCV4存223张英婕等：猪圆环病毒2 型Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定第2 期M12180ku140ku100ku75ku60 ku45ku35ku25ku15 ku图7 单克隆抗体1A6和1A8的纯化鉴定Figure 7 SDS-PAGE analysis of purified monoclonal anti-bodies 1A6 and 1A8M：蛋白质相对分子质量标准；1：纯化的单克隆抗体1A6;2：纯化的单克隆抗体1A8。M:Protein molecular weight Marker;l:Purified monoclonal antibody1A6;2:Purified monoclonal antibody 1A8.3.0PBS1A62.5-1A82.0-1.5-1.0-0.5-0.01:3001:9001:2.7001:81001:24.3001:72.9001:2187001:656 100抗体稀释滴度Antibodydilution图8单克隆抗体效价测定Figure 8Determination of monoclonal antibody titer在混合感染,为临床上PCV2的精准诊断带来了新的挑战。Cap蛋白氨基酸序列比对分析显示,PCV2与PCV3Cap蛋白同源性约为30%,而PCV2与PCV4Cap蛋白同源性约为45%。前期我们通过Cap蛋白结构序列和抗原性预测分析，发现PCV2与PCV3Cap蛋白不具有血清学交叉反应17 。随后我们分别1A61A83.0-2.52.01.51.0-0.50.0-肽 Peptide图9单克隆抗体识别的线性表位Figure 9 Mapping of the linear epitopes for mAbs binding102039100119129#TEPCV2-022428586FRSBLGQIPGGGGDROGPCV2-AA73529GGGDRPCV2-DS043740MTYPPCV2-AFW89968MTYPEPCV2-AFC55218PCVI-0228595PCV4-0TS94178NPIRSPCV1-0TS94182MPIRSGIPCV3-0YE91634PCV3-AYA44222VIS2AOOPCV3-1YA44220R1SPCV3-ODB45772MRP4313914015160170180190200230PCV2-0mA28586VMSRYTKVLDSTIDYFOPRNERLOTSRTAFENSKYDODKDPPLRP.PCV2-AAF35295VEDSTIDYFOPNNNXDPPLKPPCV2-0S043740VLDGTIDYTOPRNIKOPPLNPKPCV2-AFW89968SRYETKPVLDRTIDYTOPIRKDPPLBPEPCV2-ARC55218SRYETKEVDRTIDYIKDPPLNPKPCV-0DN2859SODPSGETETLREVYPXOCPCV4-OTSS4178SPYRTPKODP.SGRTRTLRFOPHIVNYPKOGPCVG-0TS94182ODP.SGETNTLRTVWYPROCSAVETEREODPSGETEVNXPXOGPCV3-OVES1634SBYFTEKPELAGTTSAREPCV3-AYA44222SRYTREKRILAGTTSARPPCV3-AYA44220ZLAGTTSAMPCV3-0D45772RYETTKILAGTESA图10PCVsCap蛋白序列比对Figure 10Sequence alignment of PCVs Cap protein第54卷224中国兽医科学1A61A8NCPCV2图11两株mAbs在IHC中的应用鉴定Figure 11Preliminary application of two mAbs in IHC使用PCV2和PCV4VLPs制备的特异性多克隆抗体验证三者之间的血清学交叉反应,结果表明三者之间均不存在血清学交叉反应12 。为进一步探究单克隆抗体1A6和1A8与PCV2、PCV3和PCV4Cap蛋白反应的特异性，我们将纯化的PCVsCap蛋白分别与1A6和1A8进行Western-blot试验。结果显示1A6和1A8仅能特异性识别PCV2Cap蛋白，表明所获得的单克隆抗体1A6和1A8与PCV2Cap蛋白具有良好的特异性,免疫组化结果显示,两株mAbs与感染PCV2的猪肺脏组织发生反应特异性良好，可用于PCV2免疫学的临床诊断方法建立。4丝结论本研究成功制备了PCV2VLPs两株单克隆抗体(1A6和1A8),结果表明两株单抗与PCV2Cap蛋白具有良好的反应性和特异性，识别抗原表位区域为2112 2 5a a,且均不与PCV3和PCV4Cap蛋白发生交叉反应,在免疫组化(IHC)初步应用中特异性良好，可用于后期PCV2免疫学临床诊断方法的建立和应用。参考文献(References)1SEGAL S J,KEKARAINEN T,CORTEY M.The natural his-tory of porcine circovirus type 2:from an inoffensivevirus to a devastating swine disease?J.Veterinary Mi-crobiology,2013,165(1-2):13-20.2SUN w,DU Q,HAN Z,et al.Detection and genetic char-acterization of porcine circovirus 4(PCV4)in Guangxi,China J.Gene,2021,773:145384.3CAO L,SUN W,LU H,et al.Genetic variation analysis ofPCV1 strains isolated from Guangxi province of Chi-na in 2015JJ.BMC Veterinary Research,2018,14(1):43.4MAI J,WANG D,ZOU Y,et al.High co-infection status ofnovel porcine parvovirus 7 with porcine circovirus 3in sows that experienced 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