肿瘤坏死因子样细胞凋亡弱诱导物_成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白14轴及下游核因子κB通路的关键因子mRNA及蛋白表达差异与老年肥胖的相关性.pdf

临床研究肿瘤坏死因子样细胞凋亡弱诱导物/成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白 14 轴及下游核因子 B 通路的关键因子 mRNA 及蛋白表达差异与老年肥胖的相关性赵艳姣,卓娅买买提乌斯满,刘金玲,王红梅(新疆维吾尔自治区人民医院综合保健内科二病区,乌鲁木齐 830000)【摘 要】目的 研究老年人外周血单个核细胞(PBMC)中肿瘤坏死因子样细胞凋亡弱诱导物(TWEAK)/成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白 14(Fn14)轴及下游核因子 B(NF-B)通路的关键因子 mRNA 及蛋白表达差异与老年人中心性肥胖的相关性。方法 2017 年 9 月至 2018 年 5 月在新疆农牧区常住居民横断面流行病学调查数据库中随机抽取 80 例研究对象,根据是否为中心性肥胖分为对照组(n=40)和中心性肥胖组(n=40),提取空腹外周血中 PBMC,采用待实时荧光定量聚合酶链反应、Western blotting 方法检测 TWEAK、Fn14、IB 激酶(IKK)、IB 激酶(IKK)、NF-Bp65 的 mRNA、蛋白表达。采用SPSS 26.0 软件进行数据分析。根据数据类型,组间比较分别采用 t 检验及2检验。相关性分析采用双变量 Pearson 相关分析法。结果 中心性肥胖组外周血 PBMC 中的 Fn14、IKK、IKK 的 mRNA 表达高于对照组(P0.05)。中心性肥胖组的 Fn14、IKK、IKK 蛋白表达水平高于对照组(P0.05)。双变量 Pearson 相关性分析显示,上述因子的 mRNA 表达水平,TWEAK 与 Fn14 呈正相关(r=0.472;P0.01),Fn14 与 IKK、IKK 均呈正相关(r=0.262,0.275;P0.05);IKK、IKK 与 NF-Bp65 均呈正相关(r=0.747,0.692;P0.05).The protein 18中华老年多器官疾病杂志 2024年2月28日 第23卷 第2期 Chin J Mult Organ Dis Elderly,Vol.23,No.2,Feb 28,2024expression levels of Fn14,IKK and IKK in the central obesity group were higher than those in the control group(P0.05).Bivariate Pearson correlation analysis showed that mRNA expression of the above factors was positively correlated with TWEAK and Fn14(r=0.472;P0.01),Fn14 was positively correlated with IKK and IKK(r=0.262,0.275;P0.05),and that IKK and IKK were positively correlated with NF-Bp65(r=0.747,0.692;P0.01).Conclusion Central obesity in the elderly in the agricultural and pastoral areas of Xinjiang is related to the high expression of Fn14,IKK,IKK and mRNA in peripheral blood PBMC.TWEAK/Fn14 may be involved in the occurrence and development of human obesity by regulating IKK to activate NF-B inflammatory pathway.【Key words】aged;central obesity;TWEAK;Fn14;NF-B pathwayThis work was supported by National Natural Science Foundation of China(82160276),Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region(2021D01C162)and In-hospital Project of Xinjiang Uygur Autonomous Region Peoples Hospital(20200207).Corresponding author:Wang Hongmei,E-mail:whmdoctor 肥胖是由能量摄入较高或体力活动较少等因素引起的体内能量正平衡,是多种慢性病的严重危险因素。Yamada 等1发现老年人群中心血管疾病、高脂血症和糖尿病的患病率随体质量指数(body mass idex,BMI)增加而增加,且肥胖组的值相对较大。老年肥胖的并发症较多,严重危害身体健康。肥胖的病因涉及多方面,包括由促炎细胞因子水平升高介导的低度慢性炎症状态,与脂肪组织产生并释放各种促炎和抗炎因子有关,如脂肪因子瘦素、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-,TNF-)、白 细 胞 介 素-6(interleukin-6,IL-6)等细胞因子2。肿瘤坏死因子样细胞凋亡弱诱导物(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis,TWEAK)属于肿瘤坏死因子超家族促炎细胞因子,被认为与多种疾病相 关,TWEAK/成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白14(fibroblast growth factor-induced early reactive protein 14,Fn14)轴也可能参与肥胖的炎症失衡。TWEAK 与 Fn14 结合可激活下游信号通路,如核因子-B(nuclear factor-kappa B,NF-B)通路,这些通路涉及细胞增殖和分化3。众所周知,NF-B信号通路是多种疾病炎症的核心调节因子。虽然TWEAK/Fn14 轴和 NF-B 通路分别被证实在肥胖的发病中具有重要地位,但二者在肥胖发生中的相互作用尚缺乏依据。本研究通过病例-对照研究来分析 TWEAK/Fn14 轴及激活 NF-B 通路的关键因子表达差异与老年人中心性肥胖的相关性。1 对象与方法1.1 研究对象 2017 年 9 月至 2018 年 5 月在新疆农牧区常住居民中采用多级随机抽样方法进行流行病学调查,共 2100 名居民参与,其中不配合 222 名,数据不完整 40 名,最终完成调查居民 1838 名。其中中心性肥胖 836 名,无肥胖 1 002 名,按照 1 1比例由计算机随机生成的数字分为中心性肥胖组(n=40)和无肥胖组(n=40)。调查时,由经过统一培训的专职人员收集性别、年龄、身高、体质量指数、腰围、收缩压、舒张压、民族、学历、婚育史等信息。本研究经新疆自治区人民医院医学伦理委员会认定符合医学伦理(伦理审查号:KY2021031027),所有参与者签署知情同意书。中心性肥胖的诊断标准:根据中国居民肥胖防治专家共识4,无肥胖为男性腰围90 cm、女性腰围85 cm;中心性肥胖为男性腰围90 cm、女性腰围85cm。纳入标准:年龄60 岁;能独立行走,未使用辅具。排除标准:认知障碍;言语障碍;精神疾病;疾病急性发作期;重要器官功能衰竭;近期手术史;服用激素类药物;感染性疾病;恶性肿瘤及肺结核等消耗性疾病。1.2 方法1.2.1 标本采集及检测指标每位研究对象采集空腹静脉血至少 5 ml,放入乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝管中,轻轻颠倒810 次,充分混匀;立即进行梯度离心,分离血清与外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),血清样本测定血清谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)、谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)、肌酐(creatinine,Cr)、总胆固醇(total cholesterol,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)含量。将分离好的PBMC 添加 1 ml Trizol 试剂,储存于-80 冰箱,待实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测 mRNA 表达;另外一部分 PBMC 直接储存于-80冰箱,用于Western blotting 检测蛋白表达。1.2.2 PCR 检 测 采 用 PCR 检 测 PBMC 中TWEAK、Fn14、IB 激酶-(inhibitor of kappa B kinase-,IKK)、IB 激酶-(inhibitor of kappa B kinase-,IKK)、NF-Bp65 的 mRNA 表达。使用primer5 软 件 设 计 TWEAK、Fn14、IKK、IKK、28中华老年多器官疾病杂志 2024年2月28日 第23卷 第2期 Chin J Mult Organ Dis Elderly,Vol.23,No.2,Feb 28,2024NF-Bp65 基因引物序列,详见表 1;反应体系包括Evagreen 2qPCR master mix 10l、上游引物0.6l、下游引物 0.6l、cDNA 2l、RNase-free water6.8l,总反应体积为20l。PCR 条件:预变性95 10min、1 个循环,变性 95 15 s,退火/延伸 60 60 s,共 40 个循环。通过 SYBR 法进行荧光定量检测,采用 2-ct的方法计算基因的相对表达量。表 1 荧光定量 mRNA 检测引物信息Table 1 Primer information for fluorescent quantitative mRNA detectionPrimer Amplified directionSequence(5 to 3)Product sizeTWEAKForwardCCACTCTCCACCTCACTAGC151bpTWEAKReverseTCTTAGTGCCTGAAGTGGGGFn14ForwardGATCCAGTGACAATGTGCCC195bpFn14ReverseGCAACCAGACACCTTGGAAGIKKForwardTGTACCAGCATCGGGAACTT151bpIKKReverseTCAGGAACATCACAGGCCTTIKKForwardAATCTCGCCTTCTTCCAGCT181bpIKKReveresTGAGCTGCTGAGACATGGAANF-Bp65ForwardCTACGACCTGAATGCTGTGC162bpNF-Bp65ReverseCTGCCAGAGTTTCGGTTCACTWEAK:tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis;Fn14:fibroblast growth factor-induced early reactive protein 14;IKK:inhibitor of kappa B kinase-;IKK:inhibitor of kappa B kinase-;NF-Bp65:nuclear factor-kappa-B p65.1.2.3 Western blotting 采用 Western blotting 检测TWEAK、Fn14、IKK、IKK、NF-Bp65 蛋 白 表 达情况。将细胞样本经胰酶消化后,加 300 l 裂解液充分混匀。4 放置 1 h,12 000 转/min,4,离心 15 min,收集上清。80 V 恒压使溴酚蓝至分离胶处,恒压 100 V,90 min。十二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳结束,将聚偏二氟乙烯(polyvinyli-dene fluoride,PVDF)膜在甲醇中浸泡 10 s,蒸馏水中漂洗 1 min,然后将聚丙烯酰胺凝胶、滤纸及处理过的 PVDF 膜在 Transfer buffer 中浸泡 10min,制备转膜“三明治”。转膜后将 PVDF 膜水洗 3 次,10 min/次。用含 5%脱脂奶粉封闭液封闭转印膜1 h,然后 TBST 洗 3 次,10 min/次。随后进行一抗和二抗的孵育。将显色液混合,加 2 ml 至膜上,化学发光仪检测、拍照。1.3 统计学处理 采用 SPSS 26.0 统计软件进行数据分析。计量资料用均数标准差(xs)表示,采用 t 检验;计数资料用例数(百分率)表示,采用2检验。相关性分析采用双变量 Pearson 相关分析法。P0.05 为差异有统计学意义。2 结 果2.1 两组临床特征比较 两组间年龄、舒张压(diastolic blood pressure,DBP)及性别构成差异有统计学意义(P0.05;表 3)。表 2 中心性肥胖组及对照组临床资料比较Table 2 Comparison of clinical information between central obesity group and control group(n=40)ItemCentral obesity groupControl groupt/2 P valueAge(years,xs)72.157.1976.9710.29-2.4320.018Gender(male/female,n)20/2031/96.5450.011Nationality(Han/Uygur,n)23/1723/170.0001.000Education leveln(%)0.8020.370 High school or below17(42.5)21(52.5)College and above 23(57.5)19(47.5)SBP(mmHg,xs)138.2020.43137.1519.110.2370.813DBP(mmHg,xs)78.1812.6472.2013.032.0820.041AST(U/L,xs)20.966.7721.6617.23-0.2420.809ALT(U/L,xs)21.8213.2620.9019.970.2440.808Cr(mol/L,xs)64.9013.1476.1340.55-1.6650.103TG(mmol/L,xs)1.360.521.380.68-0.1770.860HDL-C(mmol/L,xs)1.160.251.240.69-0.7400.461LDL-C(mmol/L,xs)2.030.822.060.89-0.1240.902Smokingn(%)12(30.0)10(25.0)0.2510.617Alcohol drinkingn(%)9(22.5)8(20.0)0.0750.785Hypertensionn(%)24(60.0)32(80.0)3.8100.051Diabetes mellitusn(%)12(30.0)7(17.5)1.7260.189Coronary heart diseasen(%)18(45.0)17(42.5)0.0510.822SBP:systolic blood pressure;DBP:diastolic blood pressure;AST:aspartate aminotransferase;ALT:alanine aminotransferase;Cr:creatinine;TG:triglyceride;HDL-C:high-density lipoprotein cholesterol;LDL-C:low-density lipoprotein cholesterol.1mmHg=0.133kPa.38中华老年多器官疾病杂志 2024年2月28日 第23卷 第2期 Chin J Mult Organ Dis Elderly,Vol.23,No.2,Feb 28,20242.2 两组外周血 PBMC 各基因 mRNA 含量比较 中心性肥胖组外周血 PBMC 中的 Fn14、IKK、IKK 基因 mRNA 含量高于对照组,且差异有统计学意义(P0.05;表 4)。2.3 两组外周血 PBMC 各因子的蛋白表达水平比较 与对照组相比,中心性肥胖组外周血 PBMC 中的 Fn14、IKK、IKK 蛋白表达水平升高,且差异有统计学意义(P0.05;表 5,图 1)。2.4 TWEAK/Fn14 及各基因间双变量 Pearson相关性分析 外周血 PBMC 中 TWEAK 与 Fn14 的 mRNA 水平呈正相关(P0.01),与 IKK、IKK 水平无相关性;而 Fn14 的 mRNA 水平与 IKK、IKK 的水平均呈正相关(P0.05);IKK、IKK 的 mRNA 水平与NF-Bp65 的水平也均呈正相关(P0.01;表 6)。3 讨 论 肥胖会引起老年人多器官免疫系统的改变,使脂肪组织、肝脏、胰岛等呈低度慢性炎症5。实际上肥胖与脂肪组织升高有关,脂肪组织生长可能是每个成熟脂肪细胞的脂质负荷增加或数量增多,亦或是两者兼有。脂肪组织除储存能量外,也是一种内分泌细胞,会产生多种炎症分子,称为脂肪细胞因子,如 TNF-、IL-6、瘦素等6,因促炎因子升高导致体内长期处于低度慢性炎症状态。TWEAK 是 TNF 超家族的型膜蛋白,其膜结合形式(a membrane anchored form,mTWEAK)和可溶性变体(a cleaved soluble form,sTWEAK)都有生物活性,均可结合受体 Fn14,进而控制许多生物活动7。Fn14 是 TWEAK 的特异性受体,在细胞外结构域与 TWEAK 相互作用,通过肿瘤坏死因子受体相关因子结合位点与该因子家族蛋白相结合而传导TWEAK 信号。TWEAK 在成人组织中广泛表达,如单核细胞、骨骼肌和脂肪细胞等。研究表明在肥胖者的皮下和内脏脂肪组织中 TWEAK 及 Fn14 的水平升高8,但也有研究表明9TWEAK 和相应的激动性抗体具有防止脂肪组织生长的潜力。Ponce-de-Leon 等10发现皮下或内脏脂肪与 TWEAK 呈负相关。本研究提示中心性肥胖组人外周血 PBMC中的 Fn14 基因 mRNA 含量及蛋白表达水平明显高于对照组,且差异有统计学意义;而中心性肥胖组TWEAK 基因 mRNA 含量及蛋白表达水平虽高于对照组,但差异无统计学意义。Fn14 作为 TWEAK 的受体,在 本 研 究 中 二 者 呈 正 相 关(r=0.472,P0.01)。Gomez-Martin 等11在肥胖者中检测到sTWEAK 水平降低,其原因有两种可能:一种是在炎症因子刺激下 Fn14 表达增加,从而增加了 sTWEAK的可用性,这可能导致血清 sTWEAK 的外周减少12;另一种假设提出了分化簇 163(cluster of diffe-rentiation 163,CD163)的参与,CD163 是一种单核细胞-巨噬细胞表面受体,已被认为是 sTWEAK 的清道夫受体。可溶性 CD163(a soluble form CD163,sCD163)是一种巨噬细胞特异性血清标志物,炎症条件下升高,在体外可促进 sTWEAK 降解13。因此,sTWEAK 的减少可能与 sCD163 的存在有关。本研究中老年中心性肥胖组与对照组之间 TWEAK表达差异无统计学意义可能与 sTWEAK 的减少有关。表 4 外周血 PBMC 中基因 mRNA 表达水平分析Table 4 mRNA expression levels in peripheral blood PBMC(n=40,xs)GroupTWEAKFn14IKKIKKNF-Bp65Central obesity1.3040.5853.4142.0922.2181.2782.0921.1221.5151.211Control 1.1330.5621.1400.6551.2940.9021.2530.7971.3861.122t1.339-5.9953.7353.859-0.433P value0.1850.0010.0010.0010.665PBMC:peripheral blood mononuclear cell;TWEAK:tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis;Fn14:fibroblast growth factor-induced early reactive protein 14;IKK:inhibitor of kappa B kinase-;IKK:inhibitor of kappa B kinase-;NF-Bp65:nuclear factor-kappa-B p65.表 5 血清分离 PBMC 中各蛋白表达水平分析Table 5 Analysis of protein expression levels in serum isolated PBMC(n=40,xs)GroupTWEAKFn14IKKIKKNF-Bp65Central obesity0.4150.0440.4710.0690.7200.1150.5040.0750.8690.042Control0.3720.0440.2480.0530.4550.1210.3180.0540.8800.073t 1.9487.2574.4885.741-0.360P value0.0720.0010.0010.0010.724PBMC:peripheral blood mononuclear cell;TWEAK:tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis;Fn14:fibroblast growth factor-induced early reactive protein 14;IKK:inhibitor of kappa B kinase-;IKK:inhibitor of kappa B kinase-;NF-Bp65:nuclear factor-kappa-B p65.48中华老年多器官疾病杂志 2024年2月28日 第23卷 第2期 Chin J Mult Organ Dis Elderly,Vol.23,No.2,Feb 28,2024图 1 Western blotting 检测各蛋白表达Figure 1 Protein expression band diagramTWEAK:tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis;Fn14:fibroblast growth factor-induced early reactive protein 14;IKK:inhibitor of kappa B kinase-;IKK:inhibitor of kappa B kinase-;NF-Bp65:nuclear factor-kappa-B p65.表 6 外周血 PBMC 中各基因 mRNA 含量相关性分析Table 6 Correlation analysis of gene mRNA content in peripheral blood PBMC(r)VariableTWEAKFn14IKKIKKNF-Bp65TWEAK1.000-Fn14 0.472 1.000-IKK-0.0710.2621.000-IKK-0.0710.2621.000-NF-Bp65-0.228-0.0720.747 0.692 1.000TWEAK:tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis;Fn14:fibroblast growth factor-induced early reactive protein 14;IKK:inhibitor of kappa B kinase-;IKK:inhibitor of kappa B kinase-;NF-Bp65:nuclear factor-kappa-B p65.-:no datum.P0.05,P0.01.TWEAK 与 Fn14 结合已被证明可激活多种细胞内信号通路,包括 NF-B 通路。NF-B 是一种普遍存在的转录因子,与增殖、分化、凋亡、炎症等相关。活化的 NF-B 可促进大多数炎症细胞因子分泌14。NF-B 作为二聚体发挥作用,在细胞中最常见形式是 p50/p65 和 p50/p50,其次是 p50/c-Rel 和p52/RelB,取决于细胞类型和激活刺激物。NF-B通路是通过 IKK 复合物激活的,该复合物主要由两个催化亚基 IKK、IKK 和一个寡聚调节亚基 IB激酶-(inhibitor of kappa B kinase-,IKK)组成15。在生理条件下,NF-B 位于细胞质中,与抑制剂 IB 结合而无活性。据报道 IKK-是多种促炎因子激活 NF-B 通路的必要亚基。在刺激先天免疫受体(如 Toll 样受体)或细胞因子受体(如 Fn14受体)后,IKK 被激活并磷酸化 IB 蛋白,导致 IB失活后与 NF-B 解离,诱导 NF-B 从细胞质转移到细胞核,进而激活基因转录16,此为 NF-B 经典途径激活。相比之下,替代途径需激活上游 NF-B 诱导激酶(NIK 或 MAP3K14)和 IKK,并将 p100 亚基蛋白水解加工成 p5217。研究证实通过 IKK 抑制剂可下调脂肪组织中 IKK/NF-B 通路,以减弱肥胖的慢性炎症状态18。Romo 等19发现肥胖释放的细胞外基质可使 IKK、IKK 的 mRNA 和蛋白质水平增加,并激活 NF-B 通路发挥促炎作用。然而Tsaousidou 等20证明表达刺豚鼠相关肽的神经元中的 IKK2 激活不会导致肥胖。本研究发现,与对照组相比,中心性肥胖组 PBMC 中 IKK、IKK 基因mRNA 含量及蛋白表达水平明显升高(P0.05);Fn14 的 mRNA 水平与 IKK、IKK 的水平均呈正相关(r=0.262、0.275;P0.05);IKK、IKK 与 NF-Bp65 基因 mRNA 含量呈正相关(r=0.747、0.692;P0.01);提示 TWEAK/Fn14 可能与 NF-B 激活相关。考虑到 NF-B 转录因子广泛分布于不同类型的细胞中,发挥作用的二聚体类型较多,且具体取决于细胞类型和激活刺激物,故该研究 NF-Bp65 蛋白表达水平减低可能与脂肪细胞中的表达较其他细胞(如骨骼肌细胞、肝细胞等)较低相关,但仍需进一步验证。综上,本研究通过探讨 TWEAK/Fn14 及激活下游 NF-B 通路的关键炎症因子表达与老年中心性肥胖的关系,发现新疆农牧区常驻老年人中心性肥胖与外周血 PBMC 中 Fn14、IKK、IKK 的蛋白、mRNA 的高表达相关,TWEAK/Fn14 可能通过调节IKK 激活 NF-B 通路,参与老年中心性肥胖的进展。但该研究为横断面研究,只能探究其相关性,且样本量较少,未来需扩大样本量进一步开展前瞻性研究进行验证,并开展细胞及动物实验研究相关机制。【参考文献】1 Yamada T,Kimura-Koyanagi M,Sakaguchi K,et al.Obesity and risk for its comorbidities diabetes,hypertension,and dyslipidemia in 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