高效液相色谱法教学课件【全】省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

高效液相色谱法高效液相色谱法High Performance Liquid Chromatography （HPLC）第1页 序言序言:HPLC是是70年代以后发展最年代以后发展最快一个分析化学分支，现已快一个分析化学分支，现已成为成为生化、医学、药品、化生化、医学、药品、化学化工、食品卫生、环境保学化工、食品卫生、环境保护检测护检测等领域最惯用分离分等领域最惯用分离分析伎俩。析伎俩。第2页我国：我国：开始仅为少数研究试验室拥有，开始仅为少数研究试验室拥有，现很多生产、研究、质检部门都拥有。现很多生产、研究、质检部门都拥有。广泛应用于：广泛应用于：质量控制质量控制、分析化验分析化验、制备分离。制备分离。讲课目标：讲课目标：入门入门 教材：实用色谱法教材：实用色谱法（詹益兴（詹益兴 编著）编著）学习要求：学习要求：记好笔记，记好笔记，以课堂教学内容为主。以课堂教学内容为主。第3页课时安排：课时安排：第一章：高效液相色谱基本原理第一章：高效液相色谱基本原理 4课时课时第二章：高效液相色谱仪器装置第二章：高效液相色谱仪器装置 2课时课时第三章：液固、键合相色谱第三章：液固、键合相色谱 3课时课时第四章：离子交换色谱和离子对色谱第四章：离子交换色谱和离子对色谱 3课时课时 第五章：凝胶渗透色谱第五章：凝胶渗透色谱 1课时课时第六章：试验技术和辅助试验技术第六章：试验技术和辅助试验技术 1课时课时复习复习 1课时课时第4页参考书籍：参考书籍：1.色谱理论基础（卢佩章、戴朝政编）色谱理论基础（卢佩章、戴朝政编）2.高效液相色谱法高效液相色谱法（邹汉法、张玉奎、（邹汉法、张玉奎、卢佩章编著）卢佩章编著）3.高效液相色谱方法及应用高效液相色谱方法及应用（色谱技术丛书、化学工业出版社、（色谱技术丛书、化学工业出版社、于世林编著于世林编著)第5页11 概述概述一、色谱法一、色谱法 混合物最有效分离、分析方法。是一个分离技术。混合物分离过程：试样中各组分在 固液两相间不停进行着分配。一相固定不动，称为固定相。另一相是携带试样混合物流过固定 相液体，称为流动相。第一章第一章 高效液相色谱法基本原理高效液相色谱法基本原理第6页液相色谱仪液相色谱仪第7页n n高效液相色谱仪高效液相色谱仪流程图流程图第8页二、色谱法原理二、色谱法原理混合物中各组份在不互溶两相中混合物中各组份在不互溶两相中溶解、溶解、吸附吸附等化学性能存在差异；等化学性能存在差异；当两相相对运动时当两相相对运动时,各组分在各组分在两相中两相中 重复屡次进行平衡分配而到达相互重复屡次进行平衡分配而到达相互 分离。分离。第9页分离原理分离原理:分离是一个分离是一个物理物理过程。过程。固定相固定相(Stationary Phase)流动相流动相(Mobile Phase)进样进样(Injection)洗脱洗脱(Elution)相互作用相互作用(Interaction)第10页三、高效液相色谱法特点三、高效液相色谱法特点高压高压:以以液液体体作作为为流流动动相相，液液体体流流经经色色谱谱柱柱时时，受到阻力较大受到阻力较大 必须对流动相施加高压。必须对流动相施加高压。普通可到达普通可到达150300kgcm2，甚至可达甚至可达700kgcm2以上。以上。第11页高速高速:分析时间较经典液相色谱少得多（交分析时间较经典液相色谱少得多（交换速度快），一个复杂样品分析仅需几分换速度快），一个复杂样品分析仅需几分钟到几十分钟。钟到几十分钟。高效高效:气相色谱分离效能很高，高效液相色气相色谱分离效能很高，高效液相色谱柱效则更高（化学键合相），普通约可谱柱效则更高（化学键合相），普通约可达达 6000理论塔板米理论塔板米第12页高灵敏度高灵敏度 紫外检测器最紫外检测器最小小检检测量可达测量可达(10-9 g)；荧光检测器灵敏度可达荧光检测器灵敏度可达（10-11g）。所需试样极少；微升数量级所需试样极少；微升数量级高选择性高选择性 可可分分离离不不一一样样类类型型化化合合物物和和异异构构体体，也也可可分分析析在性质上极为相同化合物在性质上极为相同化合物(同位素、同分异构体、空间异构体、手性化合物）同位素、同分异构体、空间异构体、手性化合物）第13页高效液相色谱法高效液相色谱法特征特征:高压、高效、高速、高灵敏。高压、高效、高速、高灵敏。适用：适用：高沸点高沸点、热不稳定热不稳定样品样品 第14页四、四、HPLCHPLC与与GCGC区分区分 1分析对象区分分析对象区分 GC：适于能气化、热稳定性好、沸点低样适于能气化、热稳定性好、沸点低样 品，品，占有机物占有机物20%HPLC：适于溶解后能制成溶液样品适于溶解后能制成溶液样品.对分子量大、难气化、热稳定性差对分子量大、难气化、热稳定性差 样品均可检测样品均可检测。占有机物占有机物80%第15页2 2流动相区分流动相区分GCGC：流动相为惰性，组分与流动相无相互作用流动相为惰性，组分与流动相无相互作用 力，只与固定相有相互作用。力，只与固定相有相互作用。HPLCHPLC：流动相为液体，流动相与组分间有相互作用流动相为液体，流动相与组分间有相互作用 力，参加和影响色谱分离力，参加和影响色谱分离.对分离起主要作用。对分离起主要作用。3 3操作条件差异操作条件差异 GCGC：加温操作加温操作 HPLCHPLC：室温；高压室温；高压 说明：说明：气相、液相地位一样主要气相、液相地位一样主要 两种互补不足色谱方法两种互补不足色谱方法 灵敏度：灵敏度：气相气相液相液相 应用范围：应用范围：液相液相气相气相第16页五、色谱法分类五、色谱法分类吸附色谱吸附色谱(Absorption Chromatography)(Absorption Chromatography)组分对组分对固定相表面吸附力固定相表面吸附力不一样而分离不一样而分离分配色谱分配色谱(Partition Chromatography)(Partition Chromatography)组分在固定相和流动相中组分在固定相和流动相中溶解度溶解度不一样而分离不一样而分离离子交换色谱离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography)(Ion Exchange Chromatography)组份离子交换组份离子交换亲和力亲和力差异而分离差异而分离体积排除色谱体积排除色谱(Size Exclusion(Size Exclusion Chromatography)Chromatography)组分分子量大小不一样组分分子量大小不一样,对固定相对固定相渗透力渗透力不一样不一样而分离而分离第17页基本概念基本概念 一、色谱图一、色谱图 统计仪所统计统计仪所统计浓度对分离时间浓度对分离时间函数，称为函数，称为色谱色谱图。图。第18页色谱过程特点：色谱过程特点：浓度对分离时间呈浓度对分离时间呈高斯曲线高斯曲线型型色谱条件一定时，各组分都色谱条件一定时，各组分都有一有一特定特定时间在图谱中出现，时间在图谱中出现，称为组分保留时间。称为组分保留时间。柱效一定时，组分保留值柱效一定时，组分保留值越越小小，峰越，峰越窄；窄；保留值保留值越大越大，峰，峰越越宽宽。相邻峰保留时间相邻峰保留时间相差越大相差越大，越易越易分离分离。第19页二、色谱参数二、色谱参数 1.保保 留留 时时 间间-tR 从从进进样样开开始始到到柱柱后后出出现现样样品品浓浓度度极极大大值值所所需需时时间间，用用tR表示。表示。第20页2.2.分配系数分配系数K K在一定温度下，组分在两相间分配到达平衡时在一定温度下，组分在两相间分配到达平衡时浓浓度比度比（单位：（单位：g/mLg/mL），称为），称为分配系数分配系数K分配系数是色谱分离依据。分配系数是色谱分离依据。K值小，值小，先流出柱子；先流出柱子；K值大，值大，保留作用强，后保留作用强，后 流出柱子。流出柱子。第21页分配系数分配系数K K 讨论讨论 一定温度下，组分分配系数一定温度下，组分分配系数K K越大，出峰越慢；越大，出峰越慢；每个组份在各种每个组份在各种固定相固定相上分配系数上分配系数K K 不一样；不一样；选择适宜选择适宜固定相固定相可改进分离效果；可改进分离效果；各组分有不一样各组分有不一样K K 值是分离基础（差移速度）值是分离基础（差移速度）某组分某组分K K=0=0时，即不被固定相保留，最先流时，即不被固定相保留，最先流 出。出。第22页3.3.容量因子容量因子k k(capacity factor)(capacity factor)一定温度下，组分在两相间分配到达平衡时质一定温度下，组分在两相间分配到达平衡时质量比。量比。1.1.与与kk都是与都是与组分组分及及固定相固定相热力学性质有热力学性质有 关常数关常数,随随分离柱温度、柱压分离柱温度、柱压改变而改变改变而改变2.2.容量因子能够由试验测得。容量因子能够由试验测得。3.3.色谱保留作用：色谱保留作用：组分理化性质不一样组分理化性质不一样两相间两相间 分分配配量量不不一一样样柱柱内内保保留留时时间间不不一样一样第23页4.容量因子与保留时间关系容量因子与保留时间关系k太小太小-没有充分利用填料分离能力没有充分利用填料分离能力k太大太大-分析时间太长分析时间太长 k范围：范围：k 1/0（0溶剂强度溶剂强度使组分迁移快慢使组分迁移快慢 能力）能力）P310 表表3-10tR=to(1+k)第24页5.选择性系数选择性系数 可用来衡量两物质分离程度，用表示。第25页色谱理论需要处理问题？色谱理论需要处理问题？色谱分离过程热力学和动力学问题。色谱分离过程热力学和动力学问题。组分保留时间为何不一样？色谱峰为何变宽？组分保留时间为何不一样？色谱峰为何变宽？组分保留时间：组分保留时间：色谱过程热力学原因控制；色谱过程热力学原因控制；（组分和固定相结构和性质）（组分和固定相结构和性质）色谱峰变宽：色谱峰变宽：色谱过程动力学原因控制；色谱过程动力学原因控制；（两相中运动阻力，扩散）（两相中运动阻力，扩散）两种色谱理论：两种色谱理论：塔板理论和速率理论。塔板理论和速率理论。第26页1-3 色谱柱分离效率色谱柱分离效率一、塔板理论一、塔板理论 塔板理论认为塔板理论认为:一根柱子能够分为一根柱子能够分为n段，段，每段内组分在两相间快速到达平衡，每段内组分在两相间快速到达平衡，把每一段称为一块理论塔板。把每一段称为一块理论塔板。设柱长为设柱长为L，理论塔板高度为，理论塔板高度为H，则，则 H=L/为理论塔板数。为理论塔板数。第27页 理论塔板数一理论塔板数一N N色谱峰对称色谱峰对称 ：说明：说明：a.a.在给定操作条件下，在给定操作条件下，N N几乎相同几乎相同b.Nb.N为常量时，为常量时，t tw w 随随 t tR R 成正百分比改变成正百分比改变c.c.与柱长相关与柱长相关:比较不一样长度色谱柱柱效比较不一样长度色谱柱柱效 时，应该比较它们在相同柱长下时，应该比较它们在相同柱长下N N值。值。例例d.d.是一个理想状态是一个理想状态第28页 有拖尾峰时有拖尾峰时:可用半峰宽来表示可用半峰宽来表示N：N554(tR/W1/2)2 W1/2 -半半峰峰宽宽例例：测测得得tR=105mm、W1/2=4mm，求求得得N=3789，若若此此柱柱长长为为250mm,折折成成每每米米理理论论塔板数约为塔板数约为15200.第29页理论塔板高度理论塔板高度H物理意义：物理意义：组分在两相间到达一次平衡对应组分在两相间到达一次平衡对应 柱长柱长H H愈小愈小组分在两相间平衡分配次数越多组分在两相间平衡分配次数越多柱效柱效（不能说明分离一定实现）（不能说明分离一定实现）第30页说明：说明：大，固定相分离潜能大。大，固定相分离潜能大。（分离是否，还取决于其它色谱条件）（分离是否，还取决于其它色谱条件）一定色谱条件下，对一定色谱条件下，对k有差异组有差异组 分，则柱效愈高，分离效果愈好。分，则柱效愈高，分离效果愈好。第31页塔板理论特点和不足：塔板理论特点和不足：(1)(1)当当L L一定时，一定时，N N 越大越大(H H 越小越小)，被测组，被测组 分在柱内被分配次数越多，柱效越分在柱内被分配次数越多，柱效越 高，所得色谱峰越窄。高，所得色谱峰越窄。(2)(2)柱效不能表示被分离组分实际分离柱效不能表示被分离组分实际分离 效果：效果：如两组分分配系数如两组分分配系数K K 相同，相同，不论该色谱柱柱效多大，都无法不论该色谱柱柱效多大，都无法 分离。分离。第32页(3)(3)塔板理论塔板理论无法解释无法解释同一色谱柱在同一色谱柱在 不一样流动相流速下柱效不一样不一样流动相流速下柱效不一样 试验结果，也试验结果，也无法指出无法指出影响柱效影响柱效 原因及提升柱效路径。原因及提升柱效路径。第33页二二.峰扩展和速率方程式峰扩展和速率方程式1.1.峰峰扩扩展展-因因为为柱柱内内柱柱外外各各种种原原因因引引发发色色谱谱峰峰变变宽宽或或变变形形，从从而而造造成成色色谱谱柱柱效效降低降低峰扩展程度：取决于组分在柱内峰扩展程度：取决于组分在柱内 平衡分配次数平衡分配次数 例：例：引发峰扩展原因：引发峰扩展原因：柱内柱内、柱外、柱外第34页2.速率方程式速率方程式（范（范弟姆特方程式）弟姆特方程式）H H=A A+B B/u u+C u H H：理论塔板高度，理论塔板高度，u u：流动相流速流动相流速(cm/s)(cm/s)。减小减小A A、B B、C C 三项可提升柱效。三项可提升柱效。A A，B B，C C 三项各与哪些原因相关？三项各与哪些原因相关？第35页A A 涡流扩散项涡流扩散项 A A=2=2ddp p d dp p：固定相平均颗粒直：固定相平均颗粒直径径 ：固定相填充不均匀因子：固定相填充不均匀因子 固固定定相相颗颗粒粒越越小小d dpp，填填充充得得越越均均匀匀，A A，H H，柱柱效效。表表现现在在涡涡流流扩扩散散所所引引发发色色谱谱峰峰变变宽宽现现象象减减轻，色谱峰较窄。轻，色谱峰较窄。第36页B B/u u 分子扩散项分子扩散项 B B=2 =2 DD D D：试样组分分子扩散系数（：试样组分分子扩散系数（cmcm2 2ss-1-1）(1)(1)存在着浓度差，产生纵向扩散存在着浓度差，产生纵向扩散;(2)(2)扩散造成色谱峰变宽，扩散造成色谱峰变宽，H H()，分离变差，分离变差;(3)(3)B B/u u与流速相关：流速与流速相关：流速 滞留时间滞留时间 扩散扩散 (0.5ml/min)0.5ml/min)(4)(4)扩散系数扩散系数D D，B B 值值。液相中，分子扩散可忽略液相中，分子扩散可忽略第37页C C u u 传质项传质项 传质传质溶质分子在两相间浓度不一样，由浓溶质分子在两相间浓度不一样，由浓度度 高相不停迁移至浓度低相，直到高相不停迁移至浓度低相，直到 浓度到达平衡。浓度到达平衡。依据传质形式分：依据传质形式分：固定相传质固定相传质 移动相传质移动相传质 C=（Cs+Cm）第38页n固定相传质原因：固定相传质原因：进出固定相进出固定相速度速度不一样（固相，液相）不一样（固相，液相）减小办法：减小办法：使用薄固定相层使用薄固定相层 小颗粒填料小颗粒填料n移动相传质原因：迁移移动相传质原因：迁移 滞留滞留 减小办法减小办法 填装均匀紧密填装均匀紧密 使用小颗粒填料和表面使用小颗粒填料和表面 多孔性填料多孔性填料第39页第40页3.3.速率理论关键点速率理论关键点:(1)(1)柱柱内内峰峰扩扩展展与与涡涡流流扩扩散散、分分子子扩扩散散、传传质阻力相关。质阻力相关。(2)(2)经经过过选选择择适适当当固固定定相相粒粒度度、液液膜膜厚厚度度及流动相流速可提升柱效。及流动相流速可提升柱效。第41页(3)(3)为色谱分离和操作条件选择提供了为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。说明了流速和填料对柱效及理论指导。说明了流速和填料对柱效及分离影响。分离影响。选择最正确条件，才能使柱效到达最高。选择最正确条件，才能使柱效到达最高。第42页4.4.取得高柱效几个方法：取得高柱效几个方法：选取细颗粒填料选取细颗粒填料流动相流速低流动相流速低流动相粘度小流动相粘度小升高温度升高温度溶质扩散系数与其结构相关溶质扩散系数与其结构相关 大分子，扩散系数小大分子，扩散系数小 小分子，扩散系数大小分子，扩散系数大第43页5.5.影响分离原因与提升柱效路径影响分离原因与提升柱效路径 液液体体扩扩散散系系数数仅仅为为气气体体万万分分之之一一，在在高高效效液液相相色色谱谱中中,速速率率方方程程中中分分子子扩扩散散项项B/uB/u较较小小，可可忽忽略略不不计计，即即 H=A+C uH=A+C u 降降低低传传质质阻阻力力是是提提升升柱效主要路径。柱效主要路径。气相和液相区分气相和液相区分第44页分离度分离度(Rs)色谱分离目标：色谱分离目标：-合理时间内将样品中组分成功分离合理时间内将样品中组分成功分离分离度：表示分离情况一个度量分离度：表示分离情况一个度量分离度影响原因：分离度影响原因：保留值之差保留值之差色谱过程热力学原因；色谱过程热力学原因；峰宽度峰宽度色谱过程动力学原因。色谱过程动力学原因。第45页讨论：讨论：色谱分离中四种情色谱分离中四种情况：况：柱效较高，柱效较高，K K(分配系数分配系数)较大，完全分离。较大，完全分离。K K 不是很大，柱效较高，峰较窄，基本分离。不是很大，柱效较高，峰较窄，基本分离。柱效较低，柱效较低，K K 较大，但分离不好。较大，但分离不好。K K 小，柱效低，分离效果更差。小，柱效低，分离效果更差。第46页第47页一分离度数学表示式：一分离度数学表示式：R=0.8：两峰分离程度可达：两峰分离程度可达89%；R=1：分离程度：分离程度98%(到达定性定量分析最低要求到达定性定量分析最低要求)R=1.5：达：达99.7%（相邻两峰（相邻两峰到达基线分离到达基线分离）。）。第48页对浓度不一样组分而言：对浓度不一样组分而言：两个组分分离度会随浓度比增大而两个组分分离度会随浓度比增大而 减小减小 例：例：对多组分而言：对多组分而言：整个色谱分离分离度取决于整个色谱分离分离度取决于Rs最小值最小值两个峰。两个峰。第49页二分离度影响原因二分离度影响原因峰宽度峰宽度（峰宽越小，（峰宽越小，Rs越大）越大）峰宽窄主要反应了色谱分离峰宽窄主要反应了色谱分离动力学动力学特征特征两峰保留时间之差两峰保留时间之差（tR越大，越大，Rs越大）越大）反应了色谱分离反应了色谱分离热力学热力学特征特征分离度基本分离度基本关系式关系式：第50页四控制分离度方法四控制分离度方法改变改变k调整溶剂强度能够改变调整溶剂强度能够改变k增大增大-使用较弱溶剂使用较弱溶剂降低降低-使用较强溶剂使用较强溶剂正相色谱正相色谱-固定相极性大于移动相固定相极性大于移动相 （溶剂极性大（溶剂极性大溶剂强度大溶剂强度大洗脱能力强洗脱能力强小）小）反相色谱反相色谱-固定相极性小于移动相固定相极性小于移动相（溶剂极性大（溶剂极性大溶剂强度小溶剂强度小洗脱能力弱洗脱能力弱大）大）P307311第51页例例:流动相极性改变对组分流动相极性改变对组分k影响影响第52页更换色谱柱（改变更换色谱柱（改变N）办法：办法：a.选择长柱子选择长柱子(N=L/H)b.填料颗粒尽可能小填料颗粒尽可能小c.低流速低流速(溶质传质阻力小，峰扩展小溶质传质阻力小，峰扩展小)d.低溶剂粘度低溶剂粘度(提升柱效提升柱效)e.提升柱温提升柱温第53页改变选择性系数改变选择性系数（=1=1，不能实现分离不能实现分离)以下路径改进：以下路径改进：a.流动相流动相梯度洗脱梯度洗脱洗脱过程中，流动相组成随洗脱过程中，流动相组成随 时间改变而改变时间改变而改变 P279（适合用于极性范围宽样品）（适合用于极性范围宽样品）b.固定相固定相(换柱，改变填料）换柱，改变填料）c.温度温度（改变热力学参数）（改变热力学参数）第54页五五.分离度控制普通标准分离度控制普通标准:开始开始k值很小，若要增大值很小，若要增大Rs，则首先应将，则首先应将k调整至调整至1 k 10范围，这么，不用改变其范围，这么，不用改变其它条件，就可使它条件，就可使Rs增大。增大。开始开始k已在已在1 k 10范围，但范围，但Rs不大，不大，则必须增大则必须增大N来改进来改进Rs。k，N改变都不能增大改变都不能增大Rs时，再设法改变时，再设法改变第55页第二章第二章 仪器装置仪器装置 四大部件：四大部件：高压输液泵高压输液泵进样器进样器高效分离柱高效分离柱检测器检测器 第56页21 高压输液泵高压输液泵作用：作用：向色谱柱输送一个向色谱柱输送一个连续、恒定连续、恒定移动相。移动相。一、对泵系统要求一、对泵系统要求1.使用方便（易调整流量、过压保护等）使用方便（易调整流量、过压保护等）2.更换洗脱液轻易、死体积小更换洗脱液轻易、死体积小3.有最大工作压力有最大工作压力(20MPa，130MPa)4.一定流量范围（一定流量范围（直径小，流量小；速度快，流直径小，流量小；速度快，流 量大。量大。）（）（0.110ml/min)5.流量稳定性好流量稳定性好(流量噪声、流量波动、流量漂流量噪声、流量波动、流量漂 移移）6.流量精度高流量精度高第57页机械往复式柱塞泵机械往复式柱塞泵工作原理：工作原理：第58页特点：特点：能连续供给恒定体积移动相，不受整个色谱能连续供给恒定体积移动相，不受整个色谱系统中其余部分稍有改变影响。系统中其余部分稍有改变影响。死体积较小，约死体积较小，约0.1ml，更换溶剂方便，适，更换溶剂方便，适合用于合用于梯度洗脱。梯度洗脱。缺点：缺点：输出有输出有脉冲波动脉冲波动二个原因：二个原因：脱气不完全脱气不完全 泵周期性吸液泵周期性吸液影响检测灵敏度。（对紫外检测器影响不大）影响检测灵敏度。（对紫外检测器影响不大）第59页梯度淋洗装置梯度淋洗装置外梯度外梯度:利用两台高压输液利用两台高压输液泵，将两种不一样极性泵，将两种不一样极性溶剂按一定百分比送入溶剂按一定百分比送入梯度混合室，混合后进梯度混合室，混合后进入色谱柱。入色谱柱。内梯度内梯度:一台高压泵一台高压泵,经过经过百分比调整阀百分比调整阀,将两种将两种或各种不一样极性溶或各种不一样极性溶剂按一定百分比抽入剂按一定百分比抽入高压泵中混合。高压泵中混合。第60页泵系统发展趋势泵系统发展趋势高效：填料颗粒高效：填料颗粒分离效率分离效率柱压降柱压降 泵工作压力泵工作压力分析时间短：更加快流速分析时间短：更加快流速柱压降柱压降 (超快速分析）超快速分析）降低洗脱液用量降低洗脱液用量 (4.6mm1mm，流量降低，流量降低20倍倍)液相色谱多元洗脱系统液相色谱多元洗脱系统 P277280第61页22 色谱色谱柱柱组成：组成：精密管径不锈钢管、填料、柱接头精密管径不锈钢管、填料、柱接头要求：要求：柱管内壁非常光滑柱管内壁非常光滑 柱接头设计要确保系统中引入最小柱接头设计要确保系统中引入最小 死体积（柱前、柱后）死体积（柱前、柱后）能密封高压液体能密封高压液体 两端加过滤片两端加过滤片第62页 柱体为直形不锈钢管，内径柱体为直形不锈钢管，内径16 mm，柱长，柱长540 cm。减小填料粒度和柱径以提升柱效。减小填料粒度和柱径以提升柱效。第63页柱效影响原因柱效影响原因填料颗粒度及其均匀性填料颗粒度及其均匀性柱长、填装方法与技巧柱长、填装方法与技巧 惯用：惯用：内径内径25mm（4.6mm)柱效一定时，柱长与颗粒度成正比柱效一定时，柱长与颗粒度成正比比如：颗粒度比如：颗粒度510um、柱长、柱长1530cm 颗粒度颗粒度35um、柱长柱长7.515cmP282283第64页23 进样装置进样装置 六通进样阀六通进样阀 P280281 结构如图：结构如图：第65页2-4 检测系统检测系统功效：功效：连续地将色谱柱中流出组分随时间连续地将色谱柱中流出组分随时间 改变情况，转变成大小不一样电信改变情况，转变成大小不一样电信 号输入到统计仪中，得到色谱图。号输入到统计仪中，得到色谱图。按检测方式不一样，分为：按检测方式不一样，分为：总体性质检测器（通用型）总体性质检测器（通用型）示差折射检测器示差折射检测器溶质性质检测器（选择型）溶质性质检测器（选择型）紫外检测器、荧光检测器、电导检测器紫外检测器、荧光检测器、电导检测器第66页检测器性能指标检测器性能指标一个理想检测器，必须具备以下条件：一个理想检测器，必须具备以下条件：灵敏度高灵敏度高不受温度及流动相流速改变影响不受温度及流动相流速改变影响响应随组分量改变而线性地改变响应随组分量改变而线性地改变稳定性好，操作方便稳定性好，操作方便第67页衡量指标：衡量指标：灵敏度灵敏度 S=R/Q噪音在没有样品情况下，检测器输出最大噪音在没有样品情况下，检测器输出最大 振幅振幅（温度、流量、泵）（温度、流量、泵）漂移检测器在一段时间内，基线随时间增漂移检测器在一段时间内，基线随时间增 加而产生偏离加而产生偏离（电压、流动相）（电压、流动相）最小检测限样品产生两倍于噪音信号时最小检测限样品产生两倍于噪音信号时（检测下限）（检测下限）浓度浓度线性范围检测信号呈线性改变时，最大和最线性范围检测信号呈线性改变时，最大和最 小进样量之比小进样量之比第68页检测器检测器 紫外检测器紫外检测器（光电二极管阵列检测器）光电二极管阵列检测器）示差折光检测器示差折光检测器 荧光检测器荧光检测器 电导检测器电导检测器 第69页 a.a.紫外检测器紫外检测器 应应用用最最广广，对对大大部部分分有有机机化合物化合物有响应。有响应。特点：特点：灵敏度高；灵敏度高；线性范围宽；线性范围宽；流通池可做得很小流通池可做得很小(1mm 10mm(1mm 10mm，容积，容积 8L)8L)；对流动相流速和温度改变不敏感；对流动相流速和温度改变不敏感；波长可选，易于操作波长可选，易于操作(波长范围，惯用波长）波长范围，惯用波长）200200400nm400nm 254nm254nm、280nm280nm可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。第70页b.b.光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 紫外检测器主要进展；紫外检测器主要进展；光光电电二二极极管管阵阵列列检检测测器器：10241024个个二二极极管管阵阵列列，各各检检测测特特定定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。波长，计算机快速处理，三维立体谱图。第71页光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器第72页三维：光谱三维：光谱-色谱图色谱图第73页检测原理检测原理比尔定律：比尔定律：A=c L紫外检测器优点：紫外检测器优点：灵敏度高（灵敏度高（1010g/ml)对梯度洗脱是一个理想检测器对梯度洗脱是一个理想检测器不足：不足：不能检测对紫外光没有吸收样品不能检测对紫外光没有吸收样品不能使用对紫外光有吸收溶剂不能使用对紫外光有吸收溶剂 P289293第74页第三章第三章 液固色谱和键合相色谱液固色谱和键合相色谱 31 液固吸附色谱液固吸附色谱一、原理一、原理:固定相是极性吸附剂，固定相是极性吸附剂，不一样组份官能团含有不一样组份官能团含有不一样极性，因而对固不一样极性，因而对固定相吸附能力不一样。定相吸附能力不一样。极性越大，吸附能力极性越大，吸附能力越强；极性越低，吸附越强；极性越低，吸附能力越弱而造成分离。能力越弱而造成分离。Flow流动相流动相活性吸附点活性吸附点固定相固定相第75页存在竞争吸附：存在竞争吸附：吸附解吸平衡吸附解吸平衡 溶质、流动相分子之间溶质、流动相分子之间 溶质中不一样官能团之间溶质中不一样官能团之间 竞争结果，造成了分离。竞争结果，造成了分离。溶质在柱内受到两种力作用：溶质在柱内受到两种力作用：固定相吸附力固定相吸附力 流动相溶解力流动相溶解力 当吸附力当吸附力溶解力溶解力 k大大 吸附力吸附力溶解力溶解力 k小小第76页二分离对象：二分离对象：官能团有差异不一样类型化合物官能团有差异不一样类型化合物 （烷基类吸附弱，不能分离）（烷基类吸附弱，不能分离）几何异构体几何异构体 (固定相表面是刚性结构固定相表面是刚性结构 溶质分子官能团与吸附中心相互作用溶质分子官能团与吸附中心相互作用随分子几何形状而改变）随分子几何形状而改变）第77页三填料类型及其选择三填料类型及其选择按形状分：按形状分：a.球形球形 b.无定形无定形按多孔程度分：按多孔程度分：a.多孔型多孔型 b.薄壳型薄壳型按极性分：按极性分：a.极性（硅胶、极性（硅胶、Al2O3、MgO、分子筛）、分子筛）b.非极性（活性碳）非极性（活性碳）第78页四、硅胶活性控制及标准化四、硅胶活性控制及标准化硅胶特点：硅胶特点：活性控制意义：活性控制意义：标准化方法：标准化方法：市售未处理硅胶市售未处理硅胶加热加热46小时，活小时，活化去水，再加进定量水分，使吸附剂含化去水，再加进定量水分，使吸附剂含水量保持恒定。水量保持恒定。（100m2表面积含水表面积含水0.020.03g为佳）为佳）第79页吸附强度分类吸附强度分类依据化合物结构类型，可将它们依据化合物结构类型，可将它们在硅胶上在硅胶上 吸附强度排序：吸附强度排序：P315归纳：归纳：官能团不一样官能团不一样极性不一样极性不一样吸附强度吸附强度不一样不一样几何异构体几何异构体空间位置不一样空间位置不一样吸附强吸附强度不一样度不一样P314-316 P331-333P314-316 P331-333第80页分子空间效应。分子空间效应。n 与官能团相邻大烷基可能降低保留能与官能团相邻大烷基可能降低保留能力；（位阻效应）力；（位阻效应）n 顺式化合物保留能力可能比反式化合顺式化合物保留能力可能比反式化合物强；物强；n 对位化合物保留能力可能比邻位化合对位化合物保留能力可能比邻位化合物强。物强。第81页五样品分子结构对保留影响五样品分子结构对保留影响 对对吸吸附附色色谱谱来来说说,主主要要取取决决于于样样品品分分子子所所含含官官能团类型及其数目能团类型及其数目。常见官能团吸附强度：常见官能团吸附强度：不吸附：不吸附：烷烃烷烃 弱吸附：弱吸附：烯烃、硫醇、硫醚、单环或双环芳烯烃、硫醇、硫醚、单环或双环芳 烃、卤代芳烃烃、卤代芳烃中等吸附：中等吸附：多环芳烃、醚、腈、硝基物、大多多环芳烃、醚、腈、硝基物、大多 数羰基化合物数羰基化合物 强吸附：强吸附：醇、酚、胺、酰胺、亚枫、酸和多醇、酚、胺、酰胺、亚枫、酸和多 官能团化合物官能团化合物 第82页六、六、液相色谱流动相液相色谱流动相1.1.流动相实用要求流动相实用要求（1 1）溶剂纯度和化学特征必须满足）溶剂纯度和化学特征必须满足 色谱过程稳定性和重复性要求。色谱过程稳定性和重复性要求。（2 2）防止使用与固定相发生不可逆反应溶剂。）防止使用与固定相发生不可逆反应溶剂。（使用（使用AIAI2 2O O3 3-防止酸、使用硅胶防止碱）防止酸、使用硅胶防止碱）（3 3）溶剂应不干扰使用检测器正常工作，与检测器相匹）溶剂应不干扰使用检测器正常工作，与检测器相匹 配。配。使用溶剂应该易于除去，不干扰对分离组分回收。使用溶剂应该易于除去，不干扰对分离组分回收。第83页2.2.流动相分流动相分类类 按流动相组成份按流动相组成份：单组分和多组分；单组分和多组分；按极性分：按极性分：极性、弱极性、非极性；极性、弱极性、非极性；按使用方式分：按使用方式分：普通淋洗和梯度淋洗。普通淋洗和梯度淋洗。惯用溶剂：惯用溶剂：正相正相:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、正戊烷正戊烷 正庚烷正庚烷 反相反相:甲醇甲醇、乙腈、水溶液。乙腈、水溶液。第84页LSC LSC 流动相选择流动相选择 在在吸吸附附色色谱谱中中,对对溶溶质质保保留留值值和和分分离离选选择择性性起起主主导导作作用用是是溶溶质质与与固固定定相相作作用用,流流动动相相主主要要是是调调整溶质保留值在适当范围内。整溶质保留值在适当范围内。溶剂强度溶剂强度洗脱能力洗脱能力 k k 液固吸附色谱流动相液固吸附色谱流动相值要适当，值要适当，惯惯用用正正己己烷烷、正正庚庚烷烷,添添加加少少许许CHCH2 2ClCl2 2、CHClCHCl3 3、CHCH3 3CNCN和和CHCH3 3OHOH。(混合后溶剂强度在两种纯溶剂之间）混合后溶剂强度在两种纯溶剂之间）第85页液固色谱应用特点：液固色谱应用特点：对含有不一样极性取代基化合物表现出较高选对含有不一样极性取代基化合物表现出较高选 择性，但对同系物分离能力较差择性，但对同系物分离能力较差对强极性或离子型样品，因有时会发生不可逆对强极性或离子型样品，因有时会发生不可逆 吸附，液固色谱常不能取得满意分离结果。吸附，液固色谱常不能取得满意分离结果。吸附剂含水量对吸附剂活性、样品容量和保吸附剂含水量对吸附剂活性、样品容量和保 留值有较大影响留值有较大影响 液固吸附色谱主要应用于液固吸附色谱主要应用于:结构异构体、几何异构体分离。结构异构体、几何异构体分离。第86页思索：思索：在液固色谱中，以硅胶为固定相，对以下四在液固色谱中，以硅胶为固定相，对以下四 组分进行分离，流出众谱柱次序可能是：组分进行分离，流出众谱柱次序可能是：a.a.邻苯二胺邻苯二胺 b b对苯二胺对苯二胺 c c间苯二胺间苯二胺 a.a.苯酚苯酚 b.b.对羟基苯胺对羟基苯胺 c.c.苯胺苯胺 d.d.苯苯12第87页3-2 反相键合相色谱 键键合合相相色色谱谱是是当当前前HPLCHPLC中中最最常常见见分分离离模模式式,约约80%HPLC80%HPLC是采取反相键合相色谱。是采取反相键合相色谱。烷基苯同系物分离分析烷基苯同系物分离分析 多环芳烃分离分析多环芳烃分离分析第88页反相键合相色谱反相键合相色谱定义定义固定相经过某种化学反应将有机分固定相经过某种化学反应将有机分 子以共价键结合在子以共价键结合在色谱担体色谱担体表面，表面，这种色谱类型称之。这种色谱类型称之。制备制备硅胶基质硅胶基质化学键合固定相注意点：化学键合固定相注意点：键合反应前，将硅胶表面硅氧烷全部水键合反应前，将硅胶表面硅氧烷全部水 解为硅烷醇。解为硅烷醇。除去硅胶表面吸附水，使表面完全呈自除去硅胶表面吸附水，使表面完全呈自 由硅醇基。由硅醇基。第89页 形成化学键合固定相形成化学键合固定相 具备条件：具备条件：所用基质材料所用基质材料 应有某种化学应有某种化学反应活性反应活性有能与基质表面发生有能与基质表面发生 化学反应化学反应官能团官能团第90页化学键合固定相化学键合固定相 (P303)a.硅氧碳键型：硅氧碳键型：SiOC b.硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水，耐光，耐有机溶剂，应用最广稳定，耐水，耐光，耐有机溶剂，应用最广 c.硅碳键型：硅碳键型：SiC d.硅氮键型：硅氮键型：SiN第91页化学键合固定相特点：化学键合固定相特点：（1 1）传质快传质快:表面无深凹陷。表面无深凹陷。（2 2）寿命长寿命长:化学键合，耐流动相冲击；化学键合，耐流动相冲击；稳定。稳定。（3 3）选选择择性性好好:可可键键合合不不一一样样官官能能团团，提提升升选选 择性择性（4 4）有利于梯度洗脱。有利于梯度洗脱。因因为为产产生生弱弱极极性性固固定定相相，因因而而扩扩展展了了反反相相色色谱分离技术应用。谱分离技术应用。反相色谱反相色谱正相色谱正相色谱第92页存在着存在着双重分离机制双重分离机制：由键合基团由键合基团覆盖率覆盖率决定决定n高覆盖率：分配为主；高覆盖率：分配为主；n低覆盖率：吸附为主。低覆盖率：吸附为主。惯用反相键合固定相：惯用反相键合固定相：C18、C8 P300P302第93页反相色谱保留机理反相色谱保留机理两种观点两种观点:疏溶剂理论疏溶剂理论（溶质与极性溶剂疏远）（溶质与极性溶剂疏远）双保留机理双保留机理 （残留羟基）（残留羟基）第94页影响溶质保留原因影响溶质保留原因 流动相流动相 组分保留随流动相极性降低而降低组分保留随流动相极性降低而降低,ln k