间充质干细胞介导NLRP3_Caspase-1通路对骨关节炎模型大鼠软骨细胞凋亡的影响.pdf

1中国现代医药杂志 2023 年 7 月第 25 卷第 7 期 MMJC，Jul 2023，Vol 25，No.7DOI：10.3969/j.issn.1672-9463.2023.07.001 论著 基金项目：黑龙江省卫生健康委科研课题（编号：2020-397）作者单位：牡丹江医学院附属第二医院骨科，黑龙江 牡丹江 157000通信作者：于涛，E-mail：间充质干细胞介导 NLRP3/Caspase-1 通路对骨关节炎模型大鼠软骨细胞凋亡的影响王海 于涛【摘要】目的 探讨与分析间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）介导核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 3（Nucleotide-binding oligomeric domain-like receptor protein 3，NLRP3）/半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1（Cysteine-requiring aspartate protease-1，Caspase-1）通路对骨关节炎模型大鼠软骨细胞凋亡的影响。方法 将骨关节炎模型大鼠 42 只随机分为 3 组：模型组、地塞米松组与 MSCs 组，每组 14 只。模型组给予生理盐水 5mL/kg 灌胃，每周 2 次；地塞米松组给予肌肉注射 20mg/kg 地塞米松约 200L，每周 2 次；MSCs 组给予 MSCs 注射治疗，每周 2 次。3 组分别在治疗第 4 周、治疗第 8 周各处死 7 只大鼠，检测软骨细胞凋亡情况。结果 地塞米松组与 MSCs 组治疗第 4 周、第 8 周的血清碱性磷酸酶（ALP）含量、软骨细胞凋亡指数水平、软骨组织 NLRP3 和 Caspase-1 蛋白相对表达水平均低于模型组（P0.05），且 MSCs 组低于地塞米松组（P0.05）。地塞米松组与 MSCs 组治疗第 4 周、第 8 周的股骨、腰椎骨密度高于模型组（P0.05），且 MSCs 组高于地塞米松组（P0.05）。结论 在骨关节炎模型大鼠中应用 MSCs 能降低血清 ALP 含量，提高股骨、腰椎骨密度，还可抑制软骨组织 NLRP3、Caspase-1 蛋白的表达，降低软骨细胞凋亡水平。【关键词】间充质干细胞 核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 3 半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1 骨关节炎 软骨细胞凋亡Effects of mesenchymal stem cell mediated NLRP3/Caspase-1 pathway on chondrocyte apoptosis in rats with osteoarthritis Wang Hai,Yu Tao.Department of Orthopedics,the Second Hospital of Mudanjiang Medical College,Mudanjiang 157000【Abstract】Objective To investigate and analyse the effects of mesenchymal stem cells(MSCs)mediated nucleotide-binding oligomeric domain-like receptor protein 3(NLRP3)/cysteine-requiring aspartate protease-1(Caspase-1)pathway on chondrocyte apoptosis in rats with osteoarthritis.Methods 42 cases of osteoarthritis model rats were randomly divided into three groups:model group,dexamethasone group and MSCs group,with 14 rats in each group.The model group was given physiological saline by gavage,5mL/kg,twice a week.The dexamethasone group was given intramuscular injection of 20mg/kg dexamethasone injection of about 200L,twice a week.MSCs group was treated with injection of MSCs,twice a week.Seven rats were killed in each of the three groups at the 4th and 8th weeks of treatment,respectively,and the chondrocytes apoptosis were detected.Results The serum alkaline phosphatase(ALP)content,chondrocyte apoptosis index and the relative expression levels of NLRP3 and Caspase-1 protein in cartilage tissue in the dexamethasone group and MSCs group were lower than those in the model group at the 4th and 8th weeks of treatment(P0.05),and the above indicators in the MSCs group were significantly lower than those in the dexamethasone group(P0.05).The bone mineral density of the femur and lumbar vertebrae in the dexamethasone group and the MSCs group were significantly higher than those in the model group at the 4th and 8th weeks of treatment(P0.05),and the MSCs group was significantly higher than the dexamethasone group(P0.05).Conclusion The application of MSCs in osteoarthritis model rats can reduce the 2中国现代医药杂志 2023 年 7 月第 25 卷第 7 期 MMJC，Jul 2023，Vol 25，No.7content of serum ALP,increase bone mineral density of femur and lumbar spine,inhibit the expression of NLRP3 and Caspase-1 protein in cartilage tissue,and reduce the level of chondrocyte apoptosis.【Key words】MSCs NLRP3 Caspase-1 Osteoarthritis Chondrocyte apoptosis骨关节炎又称老年性骨关节炎、肥大性骨关节炎、退行性关节病等，是临床骨科较常见的疾病1。骨关节炎具有病程长、发病率高、病情反复等特点，主要表现为关节疼痛、关节肿胀，甚至可导致关节畸形与截肢，严重影响患者的身心健康与日常生活2，3。外用激素为骨关节炎的主要治疗方法，能有效缓解临床症状，激素的长期应用使血液处于高凝固状态，造成软骨下骨压缩与骨小梁断裂，并诱发血管炎4。间充质干细胞（MSCs）是一种多能细胞，可从包括骨髓 MSCs 和脂肪 MSCs 等组织中分化而来5。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 3（Nucleotide-binding oligomeric domain-like receptor protein 3，NLRP3）与半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1（Cysteine-requiring aspartate protease-1，Cas-pase-1）组成 NLRP3 炎症小体，可使机体发生炎性反应，参与多种疾病的发生发展6。NLRP3/Caspase-1通路能调节成骨细胞的活性及功能，还可通过与其他成骨信号通路的相互作用发挥对机体成骨功能的抑制作用，当前基础研究也比较多7。细胞凋亡这一主动性细胞死亡方式在骨关节炎中也占有重要地位，合理调节软骨细胞凋亡对改善骨关节炎的预后具有重要价值8。本研究具体探讨 MSCs 介导NLRP3/Caspase-1 通路对骨关节炎模型大鼠软骨细胞凋亡的影响。1 材料与方法1.1 研究材料 MSCs 由本实验室提供，DMEM 细胞培养液购自 Gibco 公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，地塞米松注射液购自浙江仙琚制药有限公司，2.0%戊巴比妥钠购自国药集团，血清碱性磷酸酶（ALP）测定试剂盒、抗 Caspase-1 抗体、抗NLRP3 抗体购自武汉三鹰公司，双能 X 线骨密度仪为美国 GE 公司 LUNAR Prodigy 型。本研究经动物伦理委员会批准，严格遵守相关标准进行饲养。选择成年 4 周龄 SPF 级大鼠 48 只，均为雌性，体重（0.200.02）kg，标准大鼠饲料喂养，12h:12h 模拟白天与黑夜，可自由饮食、饮水和活动。1.2 大鼠分组与治疗 大鼠在无菌条件下，于下腹正中切口，2%戊巴比妥钠溶液按 0.1mL/100g 剂量腹腔麻醉，结扎输卵管等周围组织血管，切除双侧卵巢，缝合切口，将建模成功的 42 只大鼠（不成功原因包括死亡、手术失败等）随机分为 3 组：模型组、地塞米松组与 MSCs 组，每组 14 只。模型组给予生理盐水 5mL/kg 灌胃，每周 2 次；地塞米松组给予肌肉注射 20mg/kg 地塞米松约200L，每周 2 次；MSCs 组给予 MSCs 注射治疗。具体措施如下：MSCs 的分离培养。提取大鼠骨髓植入培养板中，采用含 10.0%胎牛血清的 DMEM培养液进行培养，细胞生长密度接近 90%左右时进行传代培养，持续 3 次后消化细胞，配制成细胞浓度为 2108个/L 的细胞悬液（60L）。在大鼠关节炎部位进行注射治疗，每次 60L，每周 2 次。1.3 观察指标 3 组分别在治疗第 4 周、第 8 周各处死 7 只大鼠进行以下指标检测：眼眶采血法采集大鼠血液 1mL，1 500rpm 离心后收集上清液，-80.0冰箱保存，酶法检测血清 ALP 含量，检测试剂盒购自上海酶联公司。取大鼠骨关节炎的软骨病理组织，浸入 4%的多聚甲醛溶液中固定 48h，制作病理切片，进行 TUNEL 染色。镜下染色呈棕褐色的细胞为阳性细胞，计算阳性细胞率，也就是软骨细胞凋亡指数。剔除附着于腰 4 椎体的软组织，分离横突、椎弓、棘突与椎体组织并打磨，双能 X 线骨密度仪测定腰椎、股骨密度。将骨关节炎软骨组织进行研磨，提取总蛋白，定量蛋白质后进行 SDS-PAGE 电泳，每孔上样 20g，转膜后 3%脱脂奶封闭 2h，分别孵育抗 NLRP3 抗体、抗 Caspase-1抗体和抗-actin 抗体（内参蛋白），4孵育过夜，洗涤后孵育二抗 1h，显影后进行保存并分析。1.4 统计学方法 采用 SPSS 20.0 分析数据，计量资料以均数标准差（xs）表示，两两对比采用t检验，多组间对比采用单因素方差分析（ANOVA），检验水准为=0.05。P0.05 为差异有统计学意义。3中国现代医药杂志 2023 年 7 月第 25 卷第 7 期 MMJC，Jul 2023，Vol 25，No.72 结果2.1 3 组血清 ALP 含量对比 地塞米松组与 MSCs组治疗第 4 周、第 8 周的血清 ALP 含量均低于模型组（P0.05），且 MSCs 组低于地塞米松组（P0.05）。见表 1。2.2 3 组股骨、腰椎骨密度对比 地塞米松组与MSCs 组治疗第 4 周、第 8 周的股骨、腰椎骨密度均高于模型组（P0.05），且 MSCs 组高于地塞米松组表 2 3 组大鼠治疗不同时间点股骨、腰椎骨密度对比（g/cm3，xs）组别n股骨骨密度腰椎骨密度治疗第 4 周治疗第 8 周治疗第 4 周治疗第 8 周模型组70.940.080.950.130.960.060.950.12地塞米松组71.320.041.250.111.240.081.280.15MSCs 组71.590.211.450.221.610.141.540.16F42.98117.18375.41629.378P0.0010.0010.0010.001注：与模型组对比，P0.05；与地塞米松组对比，P0.05表 4 3 组大鼠治疗不同时间点软骨组织蛋白相对表达水平对比（xs）组别nNLRP3Caspase-1治疗第 4 周治疗第 8 周治疗第 4 周治疗第 8 周模型组73.980.115.830.134.760.136.150.21地塞米松组71.560.232.670.193.000.124.110.18MSCs 组70.560.110.780.101.090.031.210.17F842.2152170.0112197.2391227.829P0.0010.0010.0010.001注：与模型组对比，P0.05；与地塞米松组对比，P0.052.3 3 组软骨细胞凋亡指数对比 地塞米松组与MSCs 组治疗第 4 周、第 8 周的软骨细胞凋亡指数均显著低于模型组（P0.05），MSCs 组低于地塞米松组（P0.05）。见表 3。2.4 3 组软骨组织 NLRP3、Caspase-1 蛋白表达水平对比 地塞米松组与 MSCs 组治疗第 4 周、第 8周的软骨组织 NLRP3、Caspase-1 蛋白相对表达水平均低于模型组（P0.05），且 MSCs 组低于地塞米松组（P0.05）。见表 4。表1 3组大鼠治疗不同时间点血清ALP含量比较（U/L，xs）组别n治疗第 4 周治疗第 8 周模型组7118.4410.42132.1410.93地塞米松组792.453.24100.738.92MSCs 组784.767.1491.095.68F38.46641.835P0.0010.001注：与模型组对比，P0.05；与地塞米松组对比，P0.05表 3 3 组大鼠治疗不同时间点凋亡指数对比（%，xs）组别n治疗第 4 周治疗第 8 周模型组735.242.1842.141.11地塞米松组724.023.1126.202.37MSCs 组713.222.4814.871.67F123.74408.945P0.0010.001注：与模型组对比，P0.05；与地塞米松组对比，P0.05（P0.05）。见表 2。3 讨论随着人口的老龄化，骨关节炎的发病人数越来越多，已经成为一种公共卫生疾病9。消除炎症、保护关节软骨与滑膜是治疗骨关节炎的原则，手术为骨关节炎的主要治疗方法，但是任何手术对4中国现代医药杂志 2023 年 7 月第 25 卷第 7 期 MMJC，Jul 2023，Vol 25，No.7于患者都有一定的创伤，且不能从根本上改善关节软骨退变的事实，易复发，严重影响患者的身心健康10，11。干细胞移植已成为近年来创面再生修复、骨关节炎治疗的研究热点之一。MSCs 是一种多能细胞，可从多种成人组织中分化而来，包括脂肪、骨髓等12。MSCs 能够分化为不同胚层来源的细胞，具有获得率高、不涉及伦理问题、容易采集、来源广泛等优点，是一种较为理想的组织工程种子细胞13。血清中约 50%的 ALP 来自于骨，当成骨细胞活跃，可见血清中 ALP 活性增高。卵巢摘除术后患者的骨代谢处于高转换状态，即骨吸收与骨形成均增加，可导致 ALP 升高14。本研究显示地塞米松组与 MSCs 组治疗第 4 周、第 8 周的血清 ALP含量均低于模型组（P0.05），MSCs 组低于地塞米松组（P0.05）；地塞米松组与 MSCs 组治疗第 4 周、第 8 周的股骨、腰椎骨密度均高于模型组（P0.05），MSCs 组高于地塞米松组（P0.05），表明在骨关节炎模型大鼠中应用 MSCs 能降低血清 ALP 含量，提高股骨、腰椎骨密度。本研究显示，地塞米松组与 MSCs 组治疗第 4周、第 8 周的软骨细胞凋亡指数均显著低于模型组（P0.05），MSCs 组低于地塞米松组（P0.05），表明在骨关节炎模型大鼠中应用 MSCs 能抑制软骨细胞的凋亡。从机制上分析，MSCs 有多向分化潜能，是组织修复的种子细胞，可以向其他胚层来源的细胞分化，能够有效提高股骨头内局部组织的成骨能力15，16。有研究显示 MSCs 也能分泌多种成骨活性因子，具有免疫调节作用，减低骨内压，抑制软骨细胞凋亡，达到治疗股骨头坏死的效果17，18。现代研究表明，骨关节炎的发病机制比较复杂，涉及到多种细胞因子、趋化因子的异常表达。NLRP3/Caspase-1 通路参与多种疾病的发生和发展，NLRP3 信号通路被激活后，Caspase-1 表达增加，可进而激活下游靶基因。有学者发现股骨缺损小鼠模型中 NLRP3 的表达量显著上升，特别是在NLRP3 过表达的小鼠成骨细胞中，胞浆-连环蛋白水平和 ALP 活性显著降低。Caspase-1 是成骨信号通路的关键因子，能够调节破骨细胞的生成和活化19。本研究显示，地塞米松组与 MSCs 组治疗第4 周、第 8 周的的软骨组织 NLRP3、Caspase-1 蛋白相对表达水平均低于模型组（P0.05），MSCs 组低于地塞米松组（P0.05），表明在骨关节炎模型大鼠应用 MSCs 能抑制软骨组织 NLRP3、Caspase-1 蛋白的表达。从机制上分析，MSCs 可抑制前体破骨细胞的增殖，调节 NLRP3/Caspase-1 通路的激活，调节和抑制炎症部位的免疫细胞，可促使钙化骨形成增加，导致骨形成大于骨吸收，从而抑制继发性骨质疏松的发生，发挥抗炎和修复组织损伤的作用20。综上所述，MSCs 在骨关节炎模型大鼠中应用能降低血清 ALP 含量，提高股骨、腰椎骨密度，还可抑制软骨组织 NLRP3、Caspase-1 蛋白的表达，降低软骨细胞凋亡水平。本研究存在一定的不足：没有进行剂量学分析，且 MSCs 对 NLRP3/Caspase-1 通路的具体作用靶点也不明确，将在后续研究中深入探讨。参考文献1 吴文哲，付长秀，黄李晨露，等.外泌体通过 NF-B 信号通路调节骨关节炎的炎症反应 J.中国免疫学杂志，2022，38（22）：2689-26942 王刘欣，王贺林，张勉.外泌体在骨关节炎发病及治疗中的作用和机制研究 J.中国现代医学杂志，2022，32（18）：63-693 Zeng LT，Yu GP，Yang KL，et al.Efficacy and safety of mesenchymal stem cell transplantation in the treatment of autoimmune diseases（rheumatoid arthritis，systemic lupus erythematosus，inflammatory bowel disease，multiple sclerosis，and ankylosing spondylitis）：a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trialJ.Stem Cells Int，2022，2022：94633144 Tian XH，Wei WM，Cao Y，et al.Gingival mesenchymal stem cell-derived exosomes are immunosuppressive in preventing collagen-induced arthritisJ.J Cell Mol Med，2022，26（3）：693-7085 Zhai QM，Chen X，Fei DD，et al.Nanorepairers rescue inflammation-induced mitochondrial dysfunction in mesenchymal stem cellsJ.Adv Sci（Weinh），2022，9（4）：e21038396 Wang S，Lei BY，Zhang E，et al.Targeted therapy for inflammatory diseases with mesenchymal stem cells and their derived exosomes：from basic to clinicsJ.Int J Nanomedicine，2022，17：1757-17817 Fu YX，Li J，Zhang ZY，et al.Umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes alleviate collagen-induced arthritis by balancing the population of Th17 and regulatory T cellsJ.FEBS Lett，2022，596（20）：2668-26778 韦宗波，苏允裕，章晓云，等.长链非编码 RNA 调控膝骨关节炎中软骨下骨稳态的作用与机制 J.中国组织工程研究，2023，27（29）：4736-47449 李飞非，张勇，王布雨，等.生长分化因子 5 在骨关节炎发生发展中的作用 J.中国组织工程研究，2023，27（14）：2207-22135中国现代医药杂志 2023 年 7 月第 25 卷第 7 期 MMJC，Jul 2023，Vol 25，No.710 Li YH，Wang J，Ma YC，et al.Retraction note：MicroRNA-15b shuttled by bone marrow mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles binds to WWP1 and promotes osteogenic differentiationJ.Arthritis Res Ther，2022，24（1）：25011 Nasiri N，Hosseini S，Reihani-Sabet F，et al.Targeted mesenchymal stem cell therapy equipped with a cell-tissue nanomatchmaker attenuates osteoarthritis progressionJ.Sci Rep，2022，12（1）：401512 Wen CY，Lin LP，Zou R，et al.Mesenchymal stem cell-derived exosome mediated long non-coding RNA KLF3-AS1 represses autophagy and apoptosis of chondrocytes in osteoarthritisJ.Cell Cycle，2022，21（3）：289-30313 熊波，曾平，刘金富，等.N6-甲基腺苷甲基转移酶样 3 调控骨代谢及其相关疾病的作用 J.中国组织工程研究，2023，27（28）：4566-457014 马国榕，郭洪章，李鹏飞，等.不同来源间充质干细胞的细胞外囊泡对骨关节炎的影响 J.国际骨科学杂志，2022，43（5）：289-29215 Xing YX，Li BY，He J，et al.Labial gland mesenchymal stem cell derived exosomes-mediated miRNA-125b attenuates experimental Sjogrens syndrome by targeting PRDM1 and suppressing plasma cellsJ.Front Immunol，2022，13：87109616 Li KL，Yan GH，Huang HJ，et al.Anti-inflammatory and immunomodulatory effects of the extracellular vesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells on osteoarthritis via M2 macrophagesJ.J Nanobiotechnology，2022，20（1）：3817 Huldani H，Abdalkareem Jasim S，Olegovich Bokov D，et al.Application of extracellular vesicles derived from mesenchymal stem cells as potential therapeutic tools in autoimmune and rheumatic diseasesJ.Int Immunopharmacol，2022，106：10863418 向文远，邓迎杰，廖军，等.IGF1 基因慢病毒转染骨髓间充质干细胞治疗骨性关节炎的实验研究 J.中国医药导报，2022，19（28）：17-2219 梁朝鑫，周安远，王伟，等.骨髓间充质干细胞治疗骨科疾病研究进展 J.陕西医学杂志，2022，51（1）：121-12420 Cai Y，Wu CX，Ou QH，et al.Enhanced osteoarthritis therapy by nanoengineered mesenchymal stem cells using biomimetic CuS nanoparticles loaded with plasmid DNA encoding TGF-1J.Bioact Mater，2023，19：444-457（收稿：2023-04-07）