己糖-6-磷酸脱氢酶在急性...动脉壁组织中表达变化的研究_叶剑楠.pdf

书书书现代医学Modern Medical Journal2023，Apr;51(4):427-431收稿日期2023-01-10 修回日期2023-04-12基金项目国家自然科学基金资助项目(82070488)作者简介叶剑楠(1996 )，男，湖北咸宁人，在读硕士研究生。E-mail:920479420 qq com通信作者方泽民E-mail:zmfang hust edu cn 引文格式叶剑楠，霍博，魏翔，等 己糖-6-磷酸脱氢酶在急性主动脉夹层患者主动脉壁组织中表达变化的研究J 现代医学，2023，51(4):427-431 论著 己糖-6-磷酸脱氢酶在急性主动脉夹层患者主动脉壁组织中表达变化的研究叶剑楠，霍博，魏翔，方泽民(华中科技大学同济医学院附属同济医院 心脏大血管外科，湖北 武汉430030)摘要目的:探究急性主动脉夹层患者主动脉壁组织中己糖-6-磷酸脱氢酶(H6PD)的表达变化及其意义。方法:纳入 2015 年至 2019 年收治于我科并行手术治疗的 59 例急性 Stanford A 型主动脉夹层患者作为夹层组，选取同时段内接受心脏移植手术的 22 例移植受体作为对照组，手术过程中剪取部分主动脉壁标本。采用苏木素-伊红(HE)染色及弹性纤维(EVG)染色观察两组患者主动脉壁组织结构的差异;提取主动脉组织蛋白，蛋白质印迹法(Western blot)检测主动脉壁组织中 H6PD 蛋白表达，应用 Imagelab 软件进行蛋白定量;免疫组化染色法检测两组样本中 H6PD 蛋白表达以及亚细胞定位，并使用 Image J 软件对阳性染色面积进行定量;使用 GraphPad Prism 8 3 0 软件进行组间差异的比较。结果:HE 与 EVG 染色显示夹层组主动脉壁组织中平滑肌细胞丢失且排列紊乱，伴有弹力纤维的减少和断裂;Western blot 结果显示 H6PD 蛋白在夹层组主动脉壁组织中表达上调;免疫组化染色显示 H6PD 分子定位于胞质，与对照组比较，夹层组主动脉壁组织中 H6PD 蛋白表达水平显著升高。结论:主动脉夹层患者主动脉壁组织中 H6PD 蛋白表达升高，提示该分子可能参与主动脉夹层的发生发展。关键词主动脉夹层;己糖-6-磷酸脱氢酶;主动脉平滑肌细胞 中图分类号543 1 文献标志码A 文章编号1671-7562(2023)04-0427-05doi:10 3969/j issn 1671-7562 2023 04 001Expression and implication of H6PD in the aortic wall of patientswith acute aortic dissectionYE Jiannan，HUO Bo，WEI Xiang，FANG Zemin(Division of Cardiothoracic and Vascular Surgery，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China)AbstractObjective:To investigate the expression changes and clinical significance of hexose-6-phosphatedehydrogenase(H6PD)in the aortic wall of patients with acute aortic dissection Methods:From 2015 to 2019，59patients who underwent concurrent surgery for Stanford type A aortic dissection in our division were included as theaortic dissection(AD)group，22 transplant recipients who underwent heart transplantation during the same periodwere selected as the control group We performed Hematoxylin-eosin(HE)and Verhoeffs Van Gieson(EVG)staining to observe the difference in microstructure of the aortic wall tissue between the two groups;the expressionlevel of H6PD protein in aorta tissue was estimated through Western blot，and protein quantification was conducted724using Image lab software;immunohistochemical staining was adopted to confirm the distinction of H6PD proteinexpression and show the subcellular localization of H6PD，the positive staining area was quantified utilizing Image Jsoftware;GraphPad Prism 8 3 0 software was used for comparison of inter-group differences esults:In ADgroup，HE staining presented that the smooth muscle cells were lost and disarranged in aortic wall，correspondingdegradation and breakage of elastic fibers was observed in AD medial aorta through EVG staining;the results ofWestern blot demonstrated an up-regulated protein expression of H6PD in AD aorta tissue compared with the controlgroup;the results of immunohistochemical staining showed that H6PD was mainly located in cytoplasm and furtherverified the elevated protein level of H6PD in AD group Conclusion:The upregulation of H6PD in AD patientsindicates that H6PD may participate in the process of AD development Key wordsaortic dissection;hexose-6-phosphate dehydrogenase;aortic smooth muscle cells主动脉夹层是在多种病理因素致使主动脉中膜发生退行性病变的基础上，加上高血压、动脉粥样硬化等因素，导致血液从主动脉内膜破口进入主动脉壁内，撕裂主动脉中层所产生的一种严重威胁人类生命安全的心血管疾病。根据主动脉夹层的分型及危急程度需采用不同的治疗手段，主要包括急诊开胸手术、覆膜支架置入术及药物治疗等1-3。目前主动脉夹层的发病机制尚未完全明确，探究其发病机制，有助于提高该病的诊断和治疗效率。己糖-6-磷酸脱氢酶(hexose-6-phosphate dehydrogenase，H6PD)定位于多种细胞的内质网，通过将 6-磷酸葡萄糖和 NADP 转化为 NADPH和 6-磷酸葡糖酸盐催化磷酸戊糖途径的前两步反应。此外，H6PD 还参与多种细胞内生化过程，包括中间代谢、氧化还原稳态的维持及细胞间的信号传导等4-6。已有研究7 表明，H6PD 能通过调控其下游分子参与高血压及动脉粥样硬化等心血管疾病的发生，但是H6PD 是否参与主动脉夹层的发病过程尚未可知。本研究测定 H6PD 蛋白在主动脉夹层患者的主动脉壁组织中的表达变化，讨论其在主动脉夹层发生发展中的可能作用。1材料与方法1 1主动脉组织的获取纳入 2015 年至 2019 年于我科行手术治疗的 59例急性 Stanford A 型主动脉夹层患者为夹层组，排除创伤性主动脉夹层、医源性主动脉夹层、严重瓣膜疾病、恶性肿瘤和严重肝肾功能损伤等;纳入同时段在本科室接受心脏移植手术的 22 例移植受体为对照组。在手术过程中剪取部分主动脉壁标本。组织取回后一部分剪碎 80 冻存备用，其余部分用多聚甲醛固定，脱水后石蜡包埋备用。本研究已经过华中科技大学同济医学院附属同济医院伦理委员会审批。所有患者均签署知情同意书。1 2材料和试剂HE、EVG 染色试剂盒购自武汉 Servicebio 公司，H6PD 抗体购自中国 Proteintech 公司，二抗购自美国Jackon immunoresearch 公司，IPA 裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天公司，乙二胺四乙酸(EDTA)修复液、即用型免疫组化试剂盒(Elivisionplus)及 DAB 辣根过氧化物酶显色试剂盒购自福州迈新公司。1 3HE 及 EVG 染色1 3 1HE 染色取石蜡包埋的主动脉以 5 m 厚度切片，置于烘箱中 70 烘烤 1 h 使石蜡充分融化，然后将切片浸入二甲苯中 15 min 以脱蜡，重复 3 次后依次在 100%、95%及 75%的乙醇中浸泡 5 min，随后在双蒸水中浸洗两次进行水合，每次 10 min。将切片放入苏木素染液中浸染 5 min 后，置于缓慢流动的清水中清洗10 min，然后在1%盐酸酒精中浸泡3 s，迅速取出浸入 Scott 液 1 min 后再次清水漂洗，随后伊红染液浸染 1 min，再依次在 75%、95%、100%乙醇中脱水5 min，二甲苯浸泡 10 min 重复 3 次，随后封片。1 3 2EVG 染色组织切片脱蜡水合后 浸 入Verhoeffs 染液 20 min，2%氯化铁溶液处理 15 s，随后5%硫代硫酸钠溶液浸洗 1 min，Van Giesons 液染色3 min，再经梯度浓度乙醇及二甲苯浸泡后封片。显微镜下观察组织形态并拍照。1 4组织蛋白提取及测定将 80 冻存的主动脉壁组织取出置于液氮中，使用研钵碾成小颗粒，随后加入 IPA 裂解液，再使用研磨仪研磨 5 min，置于冰上使用超声细胞粉碎机以4 000 Hz 裂解样本，低温离心机中以 12 000 rmin1离心 30 min，吸取上清液。蛋白质印迹法(Westernblot)测定各样品蛋白浓度，BCA 试剂盒中加入上样缓冲液，95 水浴15 min使蛋白变性。根据测得的蛋白浓度调整上样量进行凝胶电泳，再以湿转法将蛋白转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，使用以 TBST 配制的824现代医学(Modern Medical Journal)2023 年 4 月，51(4)5%脱脂牛奶封闭 1 h，随后用稀释过的 H6PD 特异性一抗(1 1 000)4 孵育过夜。次日加入以 5%脱脂牛奶配制的二抗(1 10 000)，室温孵育 2 h 后使用BIO-AD ChemiDocTMXS+成像系统显影。使用Imagelab 软件对显影条带进行蛋白定量，并计算各组样品 H6PD 蛋白的相对含量。1 5免疫组化染色将石蜡包埋的主动脉组织以 5 m 厚度切片，烘箱烘烤及脱蜡水合后，置于 EDTA 抗原修复液中 95 水浴 15 min，自然冷却至室温后以 3%H2O2室温孵育30 min 阻断内源性过氧化物酶，再用 5%BSA 室温封闭 1 h，滴加 H6PD 一抗(1 500 稀释)后置于湿盒内4 过夜。次日加入生物素标记二抗，室温孵育 1 h后 DAB 溶液显色，随后使用苏木素溶液复染 15 s，盐酸酒精浸泡 3 s，再迅速置于缓慢流动水中洗去多余染液，再经脱水、透明后封片。光学显微镜下观察、拍照，以 Image J 软件分析统计图片上染色阳性区域面积占比。1 6统计学处理使用 GraphPad Prism 8 3 0 软件进行统计分析，计量资料以均数 标准差表示，组间比较采用独立样本 t 检验;计数资料以例表示，组间比较采用 2检验。P 0 05 为差异有统计学意义。2结果2 1两组患者一般资料的比较本研究总计纳入 81 例患者，包括夹层组 59 例、对照组 22 例。夹层组平均年龄、体质指数(body massindex，BMI)以及既往有高血压病史的比例均高于对照组，见表 1。表 1两组患者一般资料的比较组别n年龄/岁男/例BMI/kgm2高血压病史/例吸烟史/例饮酒史/例夹层组5950 50 9 5647(79 66)25 60 3 8432(54 24)18(30 51)7(11 86)对照组2243 95 12 2019(86 36)22 28 3 916(27 27)7(31 82)2(9 09)t 或 2值2 2670 4773 2204 6780 0130 125P 值0 0310 4900 0030 0310 9100 724注:括号内为所占百分比2 2两组主动脉壁组织形态结构比较HE 染色可见对照组主动脉壁形态正常，中层平滑肌排列整齐有序;而夹层组主动脉壁中层出现明显退行性改变，平滑肌细胞相对减少且排列紊乱。EVG弹力纤维染色显示，与对照组比较，夹层主动脉组织中弹力纤维减少且出现断裂。见图 1。图 1两组患者主动脉壁组织的 HE 染色和 EVG 染色924叶剑楠，等 己糖-6-磷酸脱氢酶在急性主动脉夹层患者主动脉壁组织中表达变化的研究2 3两组患者主动脉壁组织中 H6PD 蛋白表达量比较因部分病例仅收集了甲醛固定的病理标本，未采集冻存的生化标本，因此，本研究通过 Western blot 仅检测了夹层组 9 例、对照组 5 例主动脉组织，结果显示夹层组主动脉中 H6PD 蛋白表达量显著上升，见图 2。随后为进一步验证上述结论，我们将两组所有石蜡包埋的病理标本切片后进行了免疫组化染色，结果显示H6PD 蛋白被染为棕色，主要定位于细胞质中，夹层组主动脉壁中染色阳性面积所占百分比显著高于对照组。见图 3。a P 0 05图 2两组患者主动脉壁组织中的 H6PD 蛋白水平a P 0 001图 3主动脉壁组织中 H6PD 分子的表达和亚细胞定位3讨论主动脉夹层作为一种高发病率、高致死率的心血管重症，目前尚缺乏精确的初期筛查生物标志物及有效的药物干预措施。本研究发现急性 Stanford A型夹层患者主动脉壁中 H6PD 蛋白的表达较对照组有明显上调，提示其可能与主动脉夹层的发生发展有关。H6PD 存在于内质网中参与葡萄糖的分解代谢并维持内质网的正常功能，能通过催化 NADPH 产生从而发挥调控内质网内氧化还原平衡的关键作用，在H6PD 表达异常时会引起内质网功能障碍、未折叠蛋白反应的激活及钙平衡失调等，导致内质网应激8。既往研究9-10 表明，主动脉夹层的进展过程与主动脉平滑肌细胞凋亡和内质网应激密切相关，敲除内质网应激相关分子 CHOP 可以有效抑制平滑肌细胞的凋亡和炎症的发生，从而延缓夹层进展。此外，内质网应激状态下的主动脉平滑肌细胞可以通过产生微粒体并释放到胞外介导炎症反应和主动脉内皮功能障碍，促进主动脉夹层的发生11。因此，H6PD 可能通过调节主动脉平滑肌细胞的内质网应激状态参与主动脉夹层的034现代医学(Modern Medical Journal)2023 年 4 月，51(4)发生。此外，Tsachaki 等12 研究发现 H6PD 分子的敲低抑制了多种人乳腺癌细胞的增殖，同时可减少癌细胞的迁移。另有研究13 发现 H6PD 的缺失可通过磷酸戊糖途径影响成纤维细胞的合成代谢，抑制细胞的DNA 复制，进而调控其增殖过程。而在目前已知的主动脉夹层的发病机制中，主动脉平滑肌细胞的增殖与迁移异常是影响夹层进展的重要因素14-15，提 示H6PD 可能调控平滑肌细胞的增殖和迁移从而影响主动脉夹层的进程。本研究只对 H6PD 进行了蛋白表达的研究，而未对其转录水平进行检测，无法明确 H6PD 在夹层患者主动脉组织中的升高是由于蛋白合成增加还是降解途径被抑制所致，该问题有待进一步研究探讨。此外，H6PD 分子主要定位于细胞内质网而非分泌蛋白，临床上难以对其进行直接检测，尚待更深层次的发掘以便于进行临床转化。综上所述，本研究发现 StanfordA 型主动脉夹层患者主动脉组织中 H6PD 分子表达量相较于非夹层患者有明显升高。我们推测该分子可能通过影响主动脉平滑肌细胞内质网稳态或调控主动脉平滑肌细胞的增殖和迁移进而参与主动脉夹层的发病过程，为进一步探究主动脉夹层的发病机制提供了新思路，有望为主动脉夹层的诊断和药物干预提供新靶点。参考文献 1BOSSONE E，EAGLE K A Epidemiology and management ofaortic disease:aortic aneurysms and acute aortic syndromes J Nat ev Cardiol，2021，18(5):331-348 2NIENABE C A，CLOUGH E Management of acute aorticdissection J Lancet，2015，385(9970):800-811 3 NIENABE C A，CLOUGH E，SAKALIHASAN N，et alAortic dissection J Nat ev Dis Primers，2016，2:16053 4SENESI S，CSALA M，MACOLONGO P，et al Hexose-6-phosphate dehydrogenase in the endoplasmic reticulumJ Biol Chem，2010，391(1):1-8 5LIU L，WANG Y，WANG J，et al Enhanced hexose-6-phos-phate dehydrogenase expression in adipose tissue may contrib-ute to diet-induced visceral adiposity J Int J Obes(Lond)，2018，42(12):1999-2011 6 BNHEGYI G，CSALA M，BENEDETTI A 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e1292134叶剑楠，等 己糖-6-磷酸脱氢酶在急性主动脉夹层患者主动脉壁组织中表达变化的研究