柴芍理气和胃合剂质量标准研究_刘信秋.pdf

2023 年 6 月 20 日 第 32 卷第 12 期Vol.32，No.12，June 20，2023China Pharmaceuticals中图分类号：R917；R927文献标志码：A文章编号：1006-4931（2023）12-0072-04doi:10.3969/j.issn.1006-4931.2023.12.017肝气犯胃型胃脘痛以上腹部胃脘近心窝处疼痛为主要表现1，情绪宣泄不畅以致积聚成郁气是其主要病因。西医对于胃痛多采取对症治疗，远期疗效欠佳2，而中医治疗胃脘痛历史悠久且效果显著，故可考虑结合中医治疗3-5。柴芍理气和胃合剂是我院临床验方，常用于胃痛的治疗。为建立其较准确、较全面的质量标准，保证临床疗效。本研究中采用薄层色谱（TLC）法对制剂中柴胡、麸炒枳壳、黄芩、浙贝母进行定性鉴别，采用高效液相色谱（HPLC）法测定芍药苷的含量。现报道如下。1仪器与试药1.1仪器Thermo U-3000型高效液相色谱仪（美国ThermoFisher Scientific 公司）；SQP 型电子天平（德国 Sartorius公司，精度为0.01 mg）；ZF-7N型智能暗箱式三用紫外分析仪（上海嘉鹏科技有限公司）；KQ-100DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；硅胶G薄层板（青岛谱科分离材料有限公司）。1.2试药柴芍理气和胃合剂（蒙城县中医院制剂室自制，16味组方中药饮片均购于安徽普仁中药饮片有限公司，并经亳州市中医院袁如柏副主任中药师鉴定均为正品；批号分别为 20210501，20210502，20210503，规格为每瓶250 mL）；柴胡、枳壳、浙贝母的对照药材（批号分别为 120992-201509，120981-201605，120972-201906），黄芩苷、芍药苷的对照品（批号分别为110715-201821，110736-201943，含量均大于95%），均购于中*基金项目：安徽省亳州市科技重大专项 bzzd2021003。第一作者：刘信秋，女，硕士研究生，主管中药师，研究方向为医院制剂研发及中药质量标准，（电子信箱）。通信作者：袁如柏，男，大学本科，副主任中药师，研究方向为中药鉴定及质量标准，（电子信箱）。柴芍理气和胃合剂质量标准研究*刘信秋1，李思光1，尹安坤1，牛海军2，李晓亮2，刘旭东3，袁如柏1（1.安徽省亳州市中医院，安徽 亳州236800；2.安徽九方药物研究院有限公司，安徽 合肥230088；3.安徽省亳州市蒙城县中医院，安徽 亳州233500）摘要：目的建立柴芍理气和胃合剂的质量标准。方法采用薄层色谱法对柴胡、麸炒枳壳、黄芩、浙贝母药材进行定性鉴别；采用高效液相色谱法测定芍药苷的含量，色谱柱为 Thermo Syncronis C18柱（250 mm 4.6 mm，5 m），流动相为乙腈-0.2%磷酸水溶液（梯度洗脱），流速为 1.0 mL/min，检测波长为 230 nm，柱温为 30，进样量为 5 L。结果柴胡、麸炒枳壳、黄芩、浙贝母的薄层色谱图斑点清晰，分离度高，专属性强，且阴性对照无干扰；芍药苷质量浓度在 0.008 40.168 9 mg/mL 范围内与峰面积线性关系良好（R2=0.999 0，n=5）；精密度、稳定性、重复性试验结果的 RSD 均小于 1.0%；平均加样回收率为 104.14%，RSD 为 0.45%（n=6）。结论所建立的方法操作简便、专属性强、稳定性及重复性良好，可用于柴芍理气和胃合剂的质量控制。关键词：柴芍理气和胃合剂；薄层色谱法；高效液相色谱法；质量标准Quality Standard of Chaishao Liqi Hewei MixtureLIU Xinqiu1，LI Siguang1，YIN Ankun1，NIU Haijun2，LI Xiaoliang2，LIU Xudong3，YUAN Rubai1（1.Bozhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Bozhou，Anhui，China236800；2.Anhui Joyfar Pharmaceutical Research Institute Co.，Ltd.，Hefei，Anhui，China230088；3.Mengcheng County Hospital of Chinese Medicine，Bozhou，Anhui，China233500）AbstractAbstract：ObjectiveTo establish a quality standard of Chaishao Liqi Hewei Mixture.MethodsBupleuri Radix，Bran-Fried AurantiiFructus，Scutellariae Radix and Fritillariae Thunbergii Bulbus were identified qualitatively by the thin-layer chromatography（TLC）method.Thecontentofpaeoniflorinwasdeterminedbythehigh-performanceliquidchromatography（HPLC）method.Thechromatographic column was Thermo Synronis C18column（250 mm 4.6 mm，5 m），the mobile phase was acetonitrile-0.2%phosphoric acid aqueous solution（gradient elution），the flow rate was 1.0 mL/min，the detection wavelength was 230 nm，thecolumn temperature was 30，and the injection volume was 5 L.ResultsThe TLC chromatograms of Bupleuri Radix，Bran-Fried Aurantii Fructus，Scutellariae Radix and Fritillariae Thunbergii Bulbus showed clear spots，good separation，strong specificity，and no interference from the negative reference.The linear range of paeoniflorin was 0.008 4-0.168 9 mg/mL（R2=0.999 0，n=5）.The RSDs of precision，stability and repeatability tests were all lower than 1.0%.The average recovery rate of paeoniflorin was104.14%with an RSD of 0.45%（n=6）.ConclusionThe established method is simple，specific，stable and repeatable，which canbe used for the quality control of Chaishao Liqi Hewei Mixture.Key wordsKey words：Chaishao Liqi Hewei Mixture；TLC；HPLC；quality standard检验检测Inspection and Test722023 年 6 月 20 日 第 32 卷第 12 期Vol.32，No.12，June 20，2023China Pharmaceuticals国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。2方法与结果2.1TLC 鉴别柴胡：取样品10 mL，加水饱和正丁醇溶液振摇萃取2次，每次15 mL，合并正丁醇液，依次用等体积的氨试液和正丁醇饱和的水洗涤，弃去水层，正丁醇液蒸干，加甲醇1 mL使残渣溶解，作为供试品溶液；取柴胡对照药材 0.5 g，加水 40 mL，加热回流 1 h，滤过，取滤液，按供试品溶液制备方法制备对照药材溶液；按柴芍理气和胃合剂处方及工艺制备不含柴胡的阴性样品，同供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。取上述溶液各5 L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以水-甲醇-三氯甲烷（2 7 13，V/V/V）10 下静置分层后的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以含2%对甲氨基苯甲醛的40%硫酸乙醇溶液，70 加热至斑点清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视6-7。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1 A。麸炒枳壳：取样品20 mL，加乙酸乙酯振摇萃取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯，水浴蒸干，加甲醇1 mL使残渣溶解，作为供试品溶液；取枳壳对照药材0.2 g，加甲醇 15 mL，超声（功率 100 W、频率 40 kHz，下同）处理30 min，滤过，滤液蒸干，加甲醇2 mL使残渣溶解，作为对照药材溶液；按柴芍理气和胃合剂处方及工艺制备不含麸炒枳壳的阴性样品，同供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。取上述溶液各 2 L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以水-甲醇-三氯甲烷（2 7 13，V/V/V）静置分层后的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铝乙醇溶液，105 加热约5 min，置紫外光灯（365 nm）下检视6，8-9。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1 B。黄芩：取样品 1 mL，加水稀释至 10 mL，加盐酸调pH至2，加乙酸乙酯振摇萃取2次，每次15 mL，合并乙酸乙酯，水浴蒸干，加甲醇2 mL使残渣溶解，作为供试品溶液；取黄芩苷对照品适量，加甲醇制成质量浓度为1 mg/mL的溶液，作为对照品溶液；按柴芍理气和胃合剂处方及工艺制备不含黄芩的阴性样品，同供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。取上述溶液各5 L，分别点于同一硅胶 G薄层板上，以水-甲酸-丙酮-乙酸丁酯（1 1 3 5，V/V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 2%三氯化铁乙醇溶液，置日光灯下检视6，10。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1 C。浙贝母：取样品20 mL，加浓氨试液2 mL，加三氯甲烷振摇萃取2次，每次20 mL，合并三氯甲烷萃取液，水浴蒸干，加甲醇1 mL使残渣溶解，作为供试品溶液；取浙贝母对照药材2.0 g，加浓氨试液2 mL，加三氯甲烷20 mL，超声处理 20 min，放冷，滤过，滤液水浴蒸干，加甲醇1 mL使残渣溶解，作为对照药材溶液；按柴芍理气和胃合剂处方及工艺制备不含浙贝母的阴性样品，同供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。取上述溶液各5 L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲醇-浓氨试液-乙酸乙酯（2 1 17，V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，置日光灯下检视6，11-12。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1 D。2.2芍药苷含量测定62.2.1色谱条件色谱柱：Thermo Syncronis C18柱（250 mm 4.6 mm，5 m）；流动相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度1.阴性对照品溶液2.对照药材溶液3.对照品溶液4-6.供试品溶液A.柴胡B.麸炒枳壳C.黄芩D.浙贝母图1薄层色谱图1.Negative reference solution2.Reference solution of medicinal materials3.Reference solution4-6.Test solutionA.Bupleuri RadixB.Bran-Fried Aurantii FructusC.Scutellariae RadixD.Fritillariae Thunbergii BulbusFig.1TLC chromatogramsABCD12456124561345624561检验检测Inspection and Test732023 年 6 月 20 日 第 32 卷第 12 期Vol.32，No.12，June 20，2023China Pharmaceuticals洗脱（030min时12%A40%A，3030.1min时40%A12%A，30.135 min时 12%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：230 nm；柱温：30；进样量：5 L13-17。2.2.2溶液制备取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为59.2 g/mL的对照品溶液。精密量取样品2 mL，置25 mL容量瓶中，加乙醇稀释，定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按柴芍理气和胃合剂处方及工艺制备缺白芍的阴性样品，再按供试品溶液制备方法制得阴性对照品溶液。2.2.3方法学考察专属性试验与系统适用性试验：分别吸取2.2.2项下3种溶液各5 L，按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相同保留时间处显相同色谱峰，且阴性对照无干扰，表明方法专属性良好。理论板数按芍药苷峰计应不低于2 000，分离度为8.08，拖尾因子为1.01。详见图2。A/mAU200100-20024681012141618202224262830323435t/min1AA/mAU200100-20024681012141618202224262830323435t/min1BA/mAU200100-20024681012141618202224262830323435t/minC1.芍药苷A.对照品溶液B.供试品溶液C.阴性对照品溶液图2高效液相色谱图1.PaeoniflorinA.Reference solutionB.Test solutionC.Negative reference solutionFig.2HPLC chromatograms线性关系考察：精密量取已知质量浓度（0.0592mg/mL）的芍药苷对照品溶液各适量，加乙醇制成质量浓度分别为0.008 4，0.016 9，0.033 8，0.067 6，0.168 9 mg/mL的系列对照品溶液。按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以芍药苷质量浓度（X，mg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程 Y=129.13X-0.071（R2=0.999 0，n=5）。结果表明，芍药苷质量浓度在0.008 40.168 9 mg/mL范围内与峰面积线性关系良好。精密度试验：精密量取质量浓度为0.059 2 mg/mL的对照品溶液5 L，按2.2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果的RSD为0.31%（n=6），表明仪器精密度良好。稳定性试验：精密量取样品（批号20210501）2 mL，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0，2，4，8，12，24 h时按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果的RSD为0.96%（n=6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内基本稳定。重复性试验：精密量取样品（批号20210501）适量，平行6份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果芍药苷含量的RSD为0.22%（n=6），表明方法重复性良好。加样回收试验：精密量取已知含量的样品（批号20210501），共6份，每份1 mL，精密加入芍药苷对照品适量，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表1。表1加样回收试验结果（n=6）Tab.1Results of the recovery test（n=6）样品含量（mg）0.685 20.685 20.685 20.685 20.685 20.685 2加入量（mg）0.5630.5630.5630.5630.5630.563测得量（mg）1.273 51.269 11.271 61.267 71.272 91.274 3回收率（%）104.49103.71104.16103.46104.39104.64X（%）104.14RSD（%）0.452.2.4样品含量测定及限度确定取投料的3批次白芍药材饮片和3批样品适量，分别按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算芍药苷含量及转移率。结果见表2。柴芍理气和胃合剂成品最低含量范围为0.334 90.338 5 mg/mL，考虑到生产实际，并保证临床疗效，芍药苷最低含量限度定为0.35 mg/mL。表2样品含量及转移率Tab.2Results of content and transfer rate of paeoniflorin in samples饮片序号123芍药苷含量（%）2.442.422.41制剂理论含量（mg/mL）1.9521.9361.928样品批号202105012021050220210503实测含量（mg/mL）0.681 10.680 50.679 9转移率（%）34.8935.1535.263讨论3.1方解柴芍理气和胃合剂由柴胡、白芍、醋香附、麸炒枳壳、槟榔、黄芪等16味中药材组方。方中柴胡疏肝解郁，白芍柔肝止痛，共为君药；香附疏肝、行气、止痛、解郁，麸炒枳壳、槟榔理气行滞，黄芪、山药补脾益气，白术、检验检测Inspection and Test742023 年 6 月 20 日 第 32 卷第 12 期Vol.32，No.12，June 20，2023China Pharmaceuticals薏苡仁健脾燥湿，共为臣药；姜半夏降逆止呕、燥湿化痰、消痞散结，白及收敛止血，黄芩清肝热燥湿，煅瓦楞子消痰化瘀、软坚散结、止酸止痛，浙贝母清热化痰散结，徐长卿止痛消肿，均为佐药；甘草调和诸药，为使药。诸药合用，共奏疏肝理气、活血止痛及止酸止血之功。3.2TLC 条件优化预试验中，曾对处方中除白芍和煅瓦楞子外的14味药材进行了研究，考察了不同的提取方法、展开剂、薄层板及显色剂对TLC鉴别结果的影响，排除了专属性、耐用性不好的鉴别项，最终将柴胡、麸炒枳壳、黄芩及浙贝母4种药材的TLC鉴别纳入质量标准的考察范围。煅瓦楞子的主要成分为碳酸钙，目前相关文献对复方制剂中碳酸钙的定性鉴别研究较少，唐蕾等18采用离子色谱法，通过测定制剂中钙元素的含量，推算出瓦楞子含量，该方法可为柴芍理气和胃合剂中煅瓦楞子含量的测定提供参考。3.3HPLC 条件优化预试验中，在210400 nm波长范围内对芍药苷样品进行测定，结果在231 nm波长处有最大吸收，因此本研究的测定波长确定为230 nm。在确定定量检测指标时，首先选择君药（柴胡、白芍）中的有效成分作为检测指标，但由于柴胡药材定量成分（柴胡皂苷a和柴胡皂苷d）含量限度较低，故本研究选择目标成分单一、稳定，且含量相对较高的芍药苷作为定量检测指标；药理学研究表明，芍药苷具有抗抑郁、镇痛、保肝、调节免疫等作用19，这与柴芍理气和胃合剂疏肝理气、活血止痛的关键功效有较强关联；芍药苷为白芍中的有效成分，梅茜等20分析预测芍药苷可作为白芍的质量标志物，作为复方制剂质量标准控制的指标成分，其含量能客观反映白芍药材及含有白芍的复方制剂质量的优劣。基于以上三点，选择芍药苷作为定量测定指标。在耐用性试验中，考察了Thermo Syncronis C18柱，Wonda Cract ODS-2 柱，Hypersil ODS2 柱（规格均为250 mm 4.6 mm，5 m）3种品牌色谱柱，结果在色谱峰面积、理论板数、分离度及拖尾因子方面均能满足耐用性要求，表明色谱柱的改变对结果无明显影响。本研究中测定了投料的3批次白芍药材饮片中芍药苷的含量，结果相差甚微，表明其含量较稳定，有利于从投料源头对制剂进行质量控制；制成制剂后，芍药苷转移率波动较小，说明制剂制备工艺较稳定。3.4方法评价制剂质量是保障临床有效性的关键，柴芍理气和胃合剂组方药材多、成分复杂，故确立评价制剂质量的多指标综合评价体系有一定意义。本研究中在保障可操作性的基础上，分别建立了柴胡、麸炒枳壳、黄芩、浙贝母的TLC鉴别法及芍药苷的HPLC含量测定法，简单易行、结果重复性较好，可用于柴芍理气和胃合剂的质量控制。参考文献1牛群艳.中药汤剂联合穴位贴敷对胃脘痛（肝气犯胃证）患者的效果观察 J.临床医学研究与实践，2017，2（17）：119-120.2邓登华.中西医结合治疗不同证型胃痛的疗效及对患者生活质量的影响 J.中国医药科学，2016，6（5）：78-81.3付亚江，李洪波.中医辨证分型治疗胃脘痛的临床研究 J.临床医药文献电子杂志，2018，5（A3）：88-89.4韩宗萍，钟雪梅，刘日娇.胃脘痛肝气犯胃证的中医辨证施护 J.中西医结合护理（中英文），2018，4（10）：84-86.5赵丽.调肝理气方治疗肝气犯胃型胃痛的疗效观察 J.河南医学研究，2015，24（5）：117-118.6国家药典委员会.中华人民共和国药典（四部）M.北京：中国医药科技出版社，2020：59-60.7李晓，王学方，张丽先，等.大卫颗粒的质量标准提高 J.中国现代中药，2019，21（4）：517-522.8徐玉玲，伍利华，谭平，等.清脑复神液质量标准再评价研究 J.成都大学学报（自然科学版），2015，34（4）：326-330.9周涓，杨瑜珍，陈华杏，等.荆防除湿茶薄层色谱鉴别研究 J.中国药业，2017，26（9）：22-26.10赵增成，林树乾，李桂明，等.白虎定喘口服液的质量检测 J .动物医学进展，2017，38（3）：79-85.11张义生，梁惟俊，范彦博，等.调脂康口服液的薄层色谱鉴别 J.中国医院药学杂志，2012，32（7）：556-558.12王林，王婷媛，邱远金，等.清肺扶正丸的质量标准研究 J .西北药学杂志，2017，32（3）：294-298.13许丽丽，林林，于凤蕊，等.消乳散结胶囊多指标含量测定及化学计量学分析 J .药物分析杂志，2021，41（4）：594-602.14余中霞，方菲菲，张继红，等.高效液相色谱法同时测定养血当归糖浆中芍药苷和甘草酸铵含量 J.中国药业，2020，29（9）：120-122.15胡玮，顾丽亚，周亚萍，等.HPLC 法同时测定温肾养肝颗粒中 4 种成分 J.中成药，2019，41（4）：756-759.16张璐，姜志戎，尹萌，等.高效液相色谱法同时测定益肾壮骨丸中芍药苷、莫诺苷和马钱苷含量 J.中国药业，2020，29（21）：56-59.17田萍，马开，张薇，等.HPLC 法同时测定真武汤中11种活性成分的含量 J .中国药房，2019，30（18）：2491-2496.18唐蕾，唐燏峰，彭飞燕，等.离子色谱法测定复方田七胃痛胶囊中 4组分的含量 J .中国药师，2020，23（8）：1662-1664.19牟翔宇，郭英慧，孙文君，等.柴胡配伍白芍治疗 PMDD 肝气郁证的研究进展 J.中国实验方剂学杂志，2018，24（20）：192-199.20梅茜，夏金鑫，郭爽，等.基于指纹图谱及网络药理学的白芍质量标志物（Q-marker）预测分析 J.中草药，2020，51（10）：2627-2633.（收稿日期：2022-08-31；修回日期：2022-10-16）检验检测Inspection and Test75