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补 充充 2 2酶催化活性的催化活性的测定方法定方法2024/5/26 周日1.目目 的的掌握定掌握定时法和法和连续监测法法测定定酶活性的原理及方法活性的原理及方法2.一、一、测定定酶促反促反应速度的两速度的两类方法方法（一）（一）酶促反促反应速度的表示方法速度的表示方法 单位位时间的底物的消耗量（的底物的消耗量（-dS/min-dS/min）单位位时间的的产物的生成量（物的生成量（dP/mindP/min）来表示）来表示（二）（二）测定方法分定方法分类 定定时法法 在一定在一定时间内通内通过测定定总变化量再化量再计算出速度算出速度.连续监测法法 直接用来直接用来测定速度定速度3.（一）定（一）定时法法1.1.概念概念 在足量的底物系在足量的底物系统中，加入一定量的中，加入一定量的酶试剂，反，反应一一定定时间后，加入后，加入终止止剂终止反止反应，然后，然后测定底物的消耗量或定底物的消耗量或产物的生成量物的生成量2.2.酶活性的活性的结果果计算算 假假设某一某一样品的品的酶活性活性为X X（U/LU/L），取），取样品量品量VsVs毫升与底物毫升与底物缓冲液冲液VrVr毫升孵育，毫升孵育，经过t t分分钟反反应，加入，加入终止液止液 Ve(ml)Ve(ml)，检测到到产物物净吸光度增加吸光度增加为A A，该产物的摩物的摩尔消光系数消光系数为 （终点法的摩点法的摩尔消光系数一般可通消光系数一般可通过带标准求得）比色皿光径准求得）比色皿光径为b(cm)b(cm)4.若把若把A/tA/t以以A/minA/min表示，表示，则此定此定时法法测定定酶活性的活性的计算公式与算公式与连续监测法相同法相同5.3.3.定定时法与法与终点法和两点法的区点法和两点法的区别定定时法法 是是经过一定一定时间（固定的（固定的时间）反）反应后后终止反止反应 终点法点法 指反指反应基本达到平衡，信号基本达到平衡，信号变化很小，但可以不需化很小，但可以不需要要终止反止反应两点法两点法 监测反反应过程中的两个点，即某一段程中的两个点，即某一段时间内的底物内的底物或或产物的物的变化化6.（二）（二）连续监测法法1.1.原理原理 连续监测法是将法是将酶与底物在特定条件（与底物在特定条件（缓冲液、温度冲液、温度等）下孵育，每隔一定等）下孵育，每隔一定时间（2-60s2-60s）连续测定定酶促反促反应过程中程中某一底物或某一底物或产物的特征信号（如物的特征信号（如NADHNADH在在340nm340nm的吸光度）的的吸光度）的变化，化，从而从而计算出每分算出每分钟的信号的信号变化速率化速率2.2.酶促反促反应动力学曲力学曲线 一个典型的一个典型的酶促反促反应过程一般包括延滞程一般包括延滞期、期、线性期和非性期和非线性期性期7.1.1.延滞期延滞期 对单一一酶促反促反应而言，是指而言，是指酶促反促反应从开始到达最大反从开始到达最大反应速度所需要的速度所需要的间，包括，包括酶催化位点的暴露、底物解离后与催化位点的暴露、底物解离后与酶结合合位点的位点的结合、合、酶与与辅酶的的结合、合、酶的激活等等的激活等等 对于于酶偶偶联反反应而言，延滞期而言，延滞期还包括中包括中间产物堆物堆积到一定到一定程后，程后，导致指示反致指示反应速度增加，直到与待速度增加，直到与待测酶酶促反促反应速度达到速度达到平衡所需的平衡所需的时间。一般来。一般来说，辅助助酶越多，延滞期越越多，延滞期越长2.2.线性期性期 是指是指酶促反促反应速度保持恒定的速度保持恒定的时期，不受底物期，不受底物浓度的影响。度的影响。此期底物此期底物虽被不断消耗但被不断消耗但还不足以明不足以明显改改变酶促反促反应的速度，即的速度，即以初速度以初速度进行行3.3.非非线性期性期 随着反随着反应的的进行，底物消耗越来越明行，底物消耗越来越明显，反，反应速度明速度明显下降下降而而进入非入非线性期。性期。酶浓度越高在度越高在选定条件下定条件下线性期就越短。其他性期就越短。其他造成造成进入非入非线性期的原因有可逆反性期的原因有可逆反应增增强、产物抑制增加、物抑制增加、酶变性失活增加、性失活增加、酶聚合或解离增加等等聚合或解离增加等等8.（二）（二）连续监测法法酶活性的活性的结果果计算算 假假设某一某一样品的品的酶活性活性为x x（U/LU/L），取），取样品量品量V Vs s与底物与底物缓冲液冲液V Vr r孵育，延滞期孵育，延滞期为t t0 0分分钟，测定定间隔隔时间为t t1 1分分钟，读数次数数次数为n n，每每间隔隔时间吸光度吸光度变化平均化平均值为A A，该产物的摩物的摩尔消光系数消光系数为比比色皿光径色皿光径为b b（cmcm）。反）。反应速度分速度分别用用产物的生成速度和物的生成速度和样品中品中酶的催化能力来表示的催化能力来表示 9.二、二、酶活性活性测定方法原理定方法原理（一）直接法（一）直接法 根据待根据待测酶的的酶促反促反应底物或底物或产物有特征性的理化性物有特征性的理化性质，然后通然后通过特殊的特殊的仪器直接器直接检测1.1.基于基于NADHNADH或或NADPHNADPH的反的反应原理原理 NADHNADH或或NADPHNADPH在在340nm340nm处有特有特异吸收峰，而异吸收峰，而NAD+NAD+或或NADP+NADP+只在只在260nm260nm处有明有明显的吸收峰，的吸收峰，监测340nm340nm吸光度吸光度变化可以反化可以反应NADHNADH或或NADPHNADPH的的变化。利用化。利用该原原理可以理可以测定以定以NADNAD（P P）+或或NADNAD（P P）H H为辅酶的氧化的氧化还原原酶例如例如LDLD、G-6-PDG-6-PD、-HBD-HBD、ADAD、SDSD、GLDHGLDH等等10.一些水解一些水解酶类或或转移移酶类经过酶促反促反应将化合物中的某将化合物中的某一基一基团水解或移去，使无水解或移去，使无颜色的底物色的底物转变为有有颜色的色的产物。物。人人们把把这类底物称底物称为色素原底物。根据色素原底物。根据这一原理，人一原理，人们有意有意识地合成一系列底物用来地合成一系列底物用来测定定酶活性，即人工合成色素原底活性，即人工合成色素原底物，利用物，利用这类底物底物测定的定的酶2基于人工合成色素原底物反基于人工合成色素原底物反应原理原理色素原底物待测酶产物的毫摩尔吸光系数4-硝基磷酸酚钠盐ALPPNP（4-硝基酚405nm）,18.53-羧基-L-谷氨酰对硝基苯胺GGT5-氨基-2-硝基苯甲酸,405nm,9.872-氯-硝基苯-半乳糖-麦芽糖苷AMS2-氯酚（2-CP405nm）,6.211.3.3.基于氧的消耗基于氧的消耗 氧化氧化酶在催化反在催化反应时会不断消耗氧气，可以会不断消耗氧气，可以设计氧氧电极来极来连续监测氧的消耗速度氧的消耗速度4.4.其他其他 胆碱胆碱酯酶催化乙催化乙酰胆碱胆碱产生乙酸，造成生乙酸，造成pHpH下降，可以用下降，可以用pHpH差示法差示法测定胆碱定胆碱酯酶。脱。脱羧酶在反在反应过程中程中产生生CO2CO2，可以用，可以用量量积法法测定定 12.（二）（二）间接法接法 是指是指酶促反促反应底物和底物和产物之物之间没有特征性的理化性没有特征性的理化性质，需通需通过另一个化学反另一个化学反应或生化反或生化反应，将底物或，将底物或产物物转化化为有有明明显特征理化性特征理化性质的另一个化合物。用直接法来的另一个化合物。用直接法来测定的定的酶类非常有限，很多情况下不得不使用非常有限，很多情况下不得不使用间接法接法 13.大多数定大多数定时法都是在法都是在酶促反促反应终止后加入另一个止后加入另一个试剂与底与底物或物或产物反物反应，转化化为有色化合物，再用分光光度法有色化合物，再用分光光度法检测。也。也有个有个别酶类不不终止反止反应，加入与，加入与酶促反促反应无关的无关的试剂，但能与，但能与酶促反促反应的某一的某一产物反物反应生成有特征性的化合物。生成有特征性的化合物。例如：例如：胆碱胆碱酯酶催化催化酰基硫代胆碱基硫代胆碱类底物后，生成的硫代胆底物后，生成的硫代胆碱（碱（SChSCh）与）与5 5，5-5-二硫代二硫代-双（双（2-2-硝基苯甲酸）（硝基苯甲酸）（DTNBDTNB）反）反应，生成黄色阴离子，生成黄色阴离子5-5-巯基基-2-2-硝基苯甲酸（硝基苯甲酸（5-TNBA5-TNBA）酸性磷酸酸性磷酸酶测定，利用定，利用-萘酚磷酸酚磷酸盐做底物，做底物，经酸性酸性磷酸磷酸酶水解后水解后释放放萘酚，与酚，与试剂中的固中的固红TRTR发生偶氮反生偶氮反应，生，生成黄色化合物成黄色化合物 1.1.化学法化学法14.在在酶活性活性测定定时，常采用另一个（指示，常采用另一个（指示酶）或几个）或几个酶（辅助助酶和指示和指示酶）将）将测定定酶的某一的某一产物物转化化为新的新的产物，当其他物，当其他酶的的反反应速度与待速度与待测酶反反应速度达到平衡速度达到平衡时，可以用指示，可以用指示酶的反的反应速速度来代表待度来代表待测酶的活性。可以表示的活性。可以表示为：指示指示酶是指能是指能监测反反应速度的速度的酶辅助助酶在在酶偶偶联反反应中可以一个或多个，也可以不需要中可以一个或多个，也可以不需要辅助助酶 由于由于NADNAD（P P）+或或NADNAD（P P）H H在在340nm340nm的光吸收特性，很容易的光吸收特性，很容易进行行连续监测，因此它是最常用的指示，因此它是最常用的指示酶，过氧化物氧化物酶（PODPOD）也可）也可做指示做指示酶。下表列。下表列举了需要指示了需要指示酶的的酶偶偶联方法来方法来测定定酶活性活性 2.2.酶偶偶联法法15.待测酶测定方法辅助酶指示酶丙氨酸氨基转移酶IFCC推荐法LD脂肪酶GK-GPO-POD法GK、GPO、POD5-核苷酸酶5-IMP作底物的NP-XOP-POD法核苷磷酸化酶NP黄嘌呤氧化酶XODPOD举 例例16.后面内容直接删除就行资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用17.主要经营：网络软件设计、图文设计制作、发布广告等公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！18.致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求19.感感谢您的您的观看和下看和下载The user can demonstrate on a projector or computer,or print the presentation and make it into a film to be used in a wider field20.