病毒与宿主细胞相互作用分子机制的研究应用.doc

项目名称：
病毒与宿主细胞互相作用分子机制研究
首席科学家：
于晓方 吉林大学
起止年限：
.1至.8
依托部门：
教诲部

一、核心科学问题及研究内容
本项目选取重大传染性疾病-艾滋病病原体人免疫缺陷病毒（HIV）为重要研究对象，在大量原创性前期工作基本上，对病毒与宿主细胞互相作用分子机制进行系统研究，以期揭示“病毒与宿主蛋白形成蛋白质网络在病毒侵染、复制、潜伏、出芽、耐药性中功能和构造基本”这一重要科学问题。
环绕上述科学问题，本项目：（1）将病毒学与构造生物学有机结合起来，在功能及作用机制基本上进行构造生物学方面研究，解析一批重要病毒、宿主蛋白以及形成蛋白质复合物构造，解决本领域二十年来科学热点和难点，阐明病毒与宿主蛋白互相作用及其蛋白质网络功能与构造基本（课题1）；（2）以Tetherin等宿主天然防御因子为研究重点，运用蛋白组学和计算化学等技术手段，研究宿主天然防御因子分子作用机制及构造基本，解析病毒与宿主细胞互相作用在宿主抵抗病毒感染中生物学功能（课题3）；（3），以TSG101及ESCRT复合物为研究重点，研究宿主细胞内参加病毒组装释放核心环节，系统阐明病毒与宿主细胞互相作用在病毒复制中生物学功能（课题4）；（4）从宿主遗传多态性和病毒耐药性两个研究热点入手，研究宿主因子与艾滋病易感性、病程进展及耐药性有关性，阐明病毒与宿主细胞互相作用在艾滋病发生与发展作用（课题2）；（5）应用本课题组独有随机基因敲除调控技术平台，全基因组筛选HIV-1感染潜伏期和重激活核心宿主细胞因子，研究病毒与宿主细胞互相作用在病毒感染潜伏和重激活中重要调控功能（课题4）。
本课题紧密环绕“病毒与宿主细胞互相作用”这一主题，以“功能与构造学结合”为重点研究方向，从病原感染与宿主防御两个视角，从分子水平构造生物学到整体水平艾滋病发生发展多层面，系统研究HIV-1与宿主互相作用在病毒侵染、复制、潜伏、出芽、耐药性中功能和构造基本，为阐明其她病原体与宿主细胞互相作用机制共同性和规律性提供理论基本和研究系统与平台，为提高国内重大传染性疾病防控、疫苗与药物研发整体水平奠定基本。
重要研究内容：
针对上述核心科学问题，拟开展如下研究：
（一）系列HIV病毒蛋白与宿主蛋白互相作用及其蛋白质网络分子作用机制。
1、HIV-1 Vif蛋白及其蛋白质网络分子作用机制。
咱们近来研究发现了一种新细胞内调控因子VifF1（数据未刊登），在Vif与Cul5、ElonginB、ElonginC等宿主蛋白形成E3泛素化连接酶功能中至关重要，而这一过程对病毒复制至关重要。咱们将进一步拟定VifF1在HIV-1 Vif蛋白形成 E3泛素连接酶和逃避宿主防御因子APOBEC3蛋白过程中详细作用机制，以及HIV-1 Vif与新调控因子VifF1互相作用界面。
2、HIV Vpr和Vpx蛋白生物学功能和分子作用机制。
Vpr和Vpx为艾滋病病毒功能性基因，它们对病毒复制、特别在巨噬细胞中复制至关重要。咱们将考察Vpr蛋白中某些重要功能区对其参加调节HIV-1病毒逆转录过程保真性，核运送以及核定位，诱导被侵染细胞细胞周期阻滞等重要生理功能影响；同步揭示 Vpr诱导细胞凋亡分子机制；Vpr增进HIV-1在巨噬细胞中感染机制。5月研究证明Vpx蛋白可以抑制宿主细胞内抗病毒因子SAMHD1，而Vpx可以与宿主蛋白DDB1、Cul4A和DCAF1形成E3连接酶咱们将进一步拟定Vpx抑制SAMHD1分子作用机制，Vpx重要功能区。
3、HIV-1 Vpu蛋白及形成蛋白质网络分子机制。
HIVVpu蛋白可以拮抗和抑制病毒颗粒释放Tetherin蛋白，尽管当前有某些前期成果，但仍存在同研究成果之间仍具备矛盾结论，将进一步证明Vpu和Tetherin之间互相作用与拮抗机制，Vpu结合Tetherin后在细胞内运转过程，以及Vpu介导CD4和Tetherin降解途径关系。
4、TSG101对HIV病毒出芽抑制作用和机理。
本项目将进一步研究TSG101在病毒出芽过程中分子作用机制；HIV病毒在长期TSG101阻断条件下生物特性、突变谱和病毒出芽能力。特别是HIV Gag基因突变株对病毒出芽能力作用和机理；TSG101与ESCRT复合物互相作用中对细胞生理活动影响。
（二）宿主天然防御因子分子作用机制。
1、宿主天然防御因子Tetherin抗病毒作用机制。
宿主细胞内天然抗病毒因子Tetherin，作用于所有有膜病毒，不但可以抑制HIV-1等逆转录病毒，还可以抑制Lassa病毒、Marburg病毒和Ebola病毒等其她种类病毒细胞释放。HIVVpu蛋白对Tetherin具备抑制作用，咱们将详细拟定Tetherin在细胞膜病毒装配和出芽过程中作用，进一步揭示Tetherin减少病毒感染性作用机制，Tetherin在病毒感染后影响pDC功能中作用。
2、宿主天然防御因子SAMHD1抗病毒作用机制。
作为近来被定义病毒Vpx蛋白抑制宿主防御因子SAMHD1，当前对其所知甚少，咱们将进一步考察SMAHD1广谱抗病毒作用，不同种属SAMHD1抗病毒作用，SAMHD1抗病毒机制。
3、宿主天然防御因子APOBEC3蛋白抗病毒作用。
继续进一步研究被HIV Vif蛋白所抑制APOBEC3家族蛋白抗病毒作用机制，A3G被包装进病毒机制。
4、HIV-1感染潜伏期和重激活核心宿主细胞因子分子作用机制。
咱们将进一步研究核心宿主细胞因子调节HIV-1前病毒转录调控机制；对HIV-1蛋白合成和降解调控机制；对HIV-1前病毒表观遗传学调控机制；HIV-1 蛋白与核心宿主细胞因子互相作用和功能构造域；HIV-1 蛋白与核心宿主细胞因子互相作用蛋白网络；核心宿主细胞因子淋巴细胞和巨噬细胞中表达、调控和修饰等
（三）鉴定影响HIV病毒生活周期新核心细胞因子。
1、采用免疫共沉淀和改良差减杂交等技术筛选和鉴定宿主细胞内拮抗Vpr抗病毒因子。
2、鉴定病毒与抗病毒因子（Vpu/Tetherin）复合物中新细胞因子。
Tetherin自身也可以泛素化，并且TrCP在Vpu拮抗Tetherin过程中只有某些作用，在这个过程中应当尚有此外E3连接酶。蛋白质组学研究可以提供线索发现复合物中新细胞因子。
3、全基因组筛选HIV-1感染潜伏期和重激活核心宿主细胞因子。
（四）病毒蛋白及其形成蛋白质复合物构造生物学研究。
1、HIV-1 Vif蛋白构造生物学研究。VifF1因子对Vif对的折叠具备辅助作用，环绕HIV-1 Vif，对其形成具有Cul5、ElonginB、ElonginC或VifF1、A3G蛋白质复合物构造生物进行重点研究，在体外共表达蛋白质复合物，并进行纯化，结晶条件筛选，获得蛋白三维晶体构造，最后获得Vif构造方面突破性研究，并在此基本上阐述构造与功能之间关系。
2、HIV Vpx蛋白及其蛋白质复合物构造生物学研究。体外单独或共表达Vpx及其形成具有DCAF1或DDB1蛋白质复合物，纯化，结晶条件筛选，获得蛋白质复合物晶体构造并解析。
3、Tetherin蛋白及形成蛋白质复合物构造研究。Vpu和Tetherin之间通过它们TM区互相作用，通过NMR进一步研究TetherinTM区构造，以及两者TM区结合复合物。
4、A3G蛋白及形成蛋白质复合物晶体构造研究。
通过度子作用机制研究拟定A3G特异性结合RNA，有助于咱们在体外表达体系中加入此共因子以辅助A3G N端蛋白对的折叠和可溶性表达，以便于在体外条件下进行结晶条件筛选、优化，最后获得A3G N端蛋白晶体构造解析。
（五）宿主因子在艾滋病易感性、病程进展及耐药性发生中作用。
1. 研究宿主因子遗传多态性与艾滋病毒感染、发病及疾病进展中有关性。
研究APOBEC3超家族成员、Tetherin、TSG101等核心宿主因子在艾滋病毒感染者和艾滋病人中，特别是暴露未感者和长期非进展者中表达水平和基因变异，拟定其遗传多态性和艾滋病毒感染、发病及疾病进展有关性及其分子机制，摸索以宿主因子遗传多态性为分子标志物预测HIV-1易动人群和病程进展可行性。
2. APOBEC3超家族成员在逆转录病毒基因组变异和耐药性形成中作用。
研究不同物种来源APOBEC3超家族成员在其相应逆转录病毒中引入非致死性突变能力，对病毒基因组突变频率影响；阐明APOBEC3超家族成员非致死性突变能力与HIV-1耐药性形成有关性，为摸索通过抑制APOBEC3超家族成员非致死性突变能力减少病毒变异和耐药性发生频率新防治方略奠定理论基本。

二、预期目的
总体目的
本项目将在大量前期原创性和处在国际领先水平科学前沿研究基本上，汇集国际重要科学前沿和研究热点，环绕重大传染性疾病人免疫缺陷病毒（HIV）运用病毒重要蛋白与宿主细胞互相作用分子机制这一研究重点，阐明泛素化、细胞吞噬等生物学现象在病毒复制和感染中作用，揭示病毒突破宿主防御系统普遍规律。本研究将同步发挥学科间交流与合伙优势，将分子病毒学、分子生物学、细胞生物学、构造生物学和免疫学等方面技术有机结合起来，进一步揭示HIV病毒引起疾病本质，理解其致病机理和机体免疫保护机制；解析病毒重要蛋白以及其与宿主因子形成蛋白质复合物构造，并在此基本上进一步研究功能与构造关系，为开发以新靶点为筛选模型抗病毒创新药物研制提供理论基本。通过课题实行，凝聚和培养具备国际影响人才体系，全面提高国内重大传染性疾病防治和自主创新能力。
五年预期目的
1、通过本项目实行获得一批原创性科研成果。
⑴全面系统揭示病毒与宿主细胞之间互相作用及作用机制。
通过HIV-1病毒辅助蛋白及宿主细胞蛋白研究，系统阐述病毒蛋白与宿主细胞蛋白形成蛋白质复合物在病毒侵染、复制、潜伏、出芽、耐药性中功能和构造基本，对宿主天然防御因子调控作用；宿主内天然防御因子构造与功能；宿主因子遗传多态性在艾滋病易感性、病程进展及耐药性中作用。
⑵筛选和鉴定宿主细胞内核心细胞因子。
采用免疫共沉淀和改良差减杂交等技术筛选和鉴定HIV辅助蛋白Vpr宿主细胞内相应抗病毒因子。
运用随机基因敲除调控技术平台全基因组筛选HIV-1感染潜伏期和重激活核心宿主细胞因子。
⑶病毒重要蛋白及蛋白质复合物构造解析。
在分子作用机制和功能研究基本上，对HIV病毒辅助蛋白Vif、Vpr、Vpx、Vpu及形成蛋白质复合物、宿主抗病毒因子A3G、Tetherin等蛋白及形成复合物构造进行解析，最后攻克国际研究热点和难点，为设计针对更多靶标抗HIV病毒药物提供理论根据。
2、技术平台建立。
通过本项目实行，建立完善病毒与宿主细胞互相作用实验研究体系，建立分子病毒学与构造生物学交叉合伙实验研究平台，实现强强联合。
3、人才培养。
通过本项目实行，培养一批高质量博士后和研究生，扶植一批在病毒与宿主蛋白互相作用机制以及病毒蛋白质复合物构造生物学与功能相结合研究领域具备国际竞争力先进中青年科学家和后备人才，建立一支构造合理，具备攻坚能力国际先进水平研究队伍。
4、以刊登高水平研究论文与申请专利形成发布研究成果。
拟申请抗HIV病毒创新药物靶点国际专利6-8项，在SCI收录杂志上刊登论文50篇，力求在Nature、Cell等国际顶尖杂志刊登文章2-4篇，培养中青年研究骨干20人以上，研究生50名。

三、研究方案
（一）总体学术思路
本项目环绕病毒与宿主细胞互相作用分子机制这一重要科学问题，选取重大传染病-艾滋病病原体HIV为重要研究对象，对病毒重要辅助蛋白Vif、Vpr、Vpx、Vpu运用宿主蛋白形成蛋白质网络，在病毒侵染、复制、潜伏、重激活、出芽、多重耐药性等生物学活性中作用及作用机制，对宿主免疫反映调控作用，宿主天然防御因子作用机制等进行系统地研究，并且在功能及作用机制基本上，有机地将病毒学与构造生物学结合起来，对病毒或宿主蛋白以及形成蛋白质复合物进行构造解析，通过构造再验证功能，互相增进，解决本领域二十近年来科学热点和难点。并且，通过本项目实行，发现更多病毒与宿主互相作用机制创新性观点。
（二）技术路线

1．应用共聚焦显微镜和免疫荧光染色技术对细胞内蛋白进行定位分析。
2．应用RNA 干扰技术检测特定蛋白对其生物学功能影响。
3．应用实时定量PCR技术或免疫印迹等手段检测特定蛋白表达，或拟定蛋白与RNA结合能力。
4. 应用RNA干扰、免疫印迹和限制性蛋白水解法来判断细胞内蛋白折叠，拟定VifF1与否可以诱导HIV-1 Vif构象变化，提高与Cul5-ElonginB-ElonginC E3连接酶结合。
5. 应用RNA 干扰技术、蔗糖密度梯度离心结合免疫印迹等技术拟定蛋白质复合物结合与构成状况。
6、差减杂交筛选抗病毒因子cDNA办法，结合RNA提取和Northern检测等技术鉴定Vpx特异性抑制抗病毒因子。
7、应用免疫共沉淀等技术拟定蛋白质之间互相作用。
8、应用流式细胞仪拟定特定蛋白对细胞周期、细胞凋亡影响。
9、通过体外表达、纯化层析手段获得可溶性蛋白，并在体外进行晶体生长。
10、在得到高辨别率晶体条件下，运用北京同步辐射光源以及日本、美国等国外同步辐射光源，进行晶体X-射线衍射数据收集。构造解析相位问题可以通过重原子浸泡法或硒代甲硫氨酸法运用多波长反常散射法（MAD）或单波长反常散射法（SAD）解决。
11、应用分子生物学手段，基于复合物三维构造，对结合位点中重要氨基酸进行突变，检测对其功能影响。结合晶体学和生物化学手段研究蛋白质复合物构造和功能关系，从而进一步阐明其功能和作用机理。
12、应用随机基因敲除调控技术平台全基因组筛选核心宿主细胞因子。
本项目集中了国内最强势分子病毒学、分子生物学、蛋白质组学、构造生物学与细胞生物学研究队伍，初次在国内大规模协作、系统开展病毒与宿主细胞互相作用分子作用机制基本研究，由此而构建平台对对提高国内重大传染性疾病防治和自主创新能力具备重要作用。
（三）可行性分析
1. 科学假设上可行性。申请项目整体实验思路清晰，目明确，环绕病毒与宿主细胞互相作用机制及构造基本这一核心科学问题将整个项目划提成即相对独立又互相联系四个课题，使项目进行时更有针对性，彼此之间又存在互相联系。本项目中有分子病毒学、分子免疫学、分子生物学、细胞生物学、构造生物学等学科交叉，集成与优势互补可以创新一系列办法，使咱们有能力解析病毒与宿主细胞互相作用分子作用机制和互相作用构造模型，例如蛋白质组学技术中蛋白质1D和2D电泳、免疫共沉淀、质谱鉴定等技术综合构成了研究病毒与宿主细胞互相作用技术平台；晶体生长、构造解析和NMR等技术构成了研究蛋白质复合物构造生物学平台。
2. 技术上可行性。本项目集中了国内最强势分子病毒学、分子生物学、蛋白质组学、构造生物学与细胞生物学研究队伍，初次在国内大规模协作、系统开展病毒与宿主细胞互相作用分子作用机制基本研究，由此而构建平台对对提高国内重大传染性疾病防治和自主创新能力具备重要作用。
3. 研究内容可行性。本项目研究领域属于国际重要科学前沿，研究内容属于热点领域。国际上该方面研究多数属于某一环节研究，涉及各种层面上系统研究还较有限，咱们集中华人民共和国内优势力量，在大量原创性前期工作积累基本上，有也许在该领域获得某些突破性成果。
4. 人才上可行性。本项目首席科学家为中组部“千人筹划”于晓方专家，课题负责人均为长期从事HIV病毒或构造生物学研究中青年学术带头人，在国外知名大学均具备近年研究工作经历，新被引进回国先进人才。
5. 学术上可行性。团队共刊登SCI论文近300篇，均收录于国际一流生物学期刊。以第一作者或通讯作者刊登文章涉及Science. (IF:29.162)，Nature (IF:30.4) 2篇，Cell (IF:31.152)2篇，Lancet（IF：28），Genes. Dev (IF:16.385)，PNAS (IF:10.231)7篇，Hepatology (IF:10.84)2篇，Neuron (IF:13.26)，Blood (IF:10.8)，Mol Cell Proteomics (IF:9.876)，Mol Cell (IF:13.156)2篇，PLoS Biol. (IF:8.95)，Nat Struct Mol Biol. (IF:11.085)2篇，PLoS Pathog（IF：9.705），在国际上相应领域具备一定学术地位，具备获得突破性进展能力。
（四）创新性
1、本项目重要研究内容均是在前期原创性成果基本上，针对当前国际研究热点和难点设计，具备获得重大突破性科学成果能力与潜力。
2、通过对HIV进一步研究，除揭示泛素化降解途径、细胞周期影响等机制外，为病毒与宿主互相作用机制提供更多创新性观点。
2、本项目运用先进生物学实验技术，如流式细胞技术、RNA干扰、细胞荧光染色、生物信息学分析，荧光定量PCR，免疫共沉淀，蛋白质组学技术等，具备获得突破性研究技术水平。
3、应用以PCR为基本cDNA差减实验和随机基因敲除调控技术平台（美国专利）筛选和定义新宿主细胞因子。
4、将分子病毒学与构造生物学有机结合起来，强强联合，建立病毒学与构造学相结合研究平台。
（五）课题设立思路
环绕项目总体思路，本项目设立4个课题，重点研究病毒与宿主细胞蛋白互相作用分子机制，以HIV病毒为例，全面阐述病毒与宿主细胞形成复杂蛋白质网络对病毒生物学功能以及宿主生理活动双面影响。详细涉及病毒蛋白与宿主蛋白互相作用及形成蛋白质网络在病毒感染过程中构造和生物学功能；其对宿主免疫反映调控；宿主天然防御因子分子作用机制及构造生物学研究；以及宿主因子在艾滋病易感性、病程进展及耐药性发生中作用。并且在分子作用机制和功能研究基本上进行构造生物学研究，同步在构造解析后进一步验证功能。四个课题即相对独立，又互相之间紧密联系，互相增进。
课题间联系及其与项目目的关系
本项目课题环绕“病毒与宿主蛋白形成蛋白质网络在病毒侵染、复制、潜伏、出芽、耐药性中功能和构造基本”这一重要科学问题开展，每个课题涉及病毒蛋白，相应宿主防御因子，以及形成蛋白质网络均是病毒形成和维持感染必不可少构成某些，并且它们与宿主蛋白互相作用机制有共同性，规律性，通过本课题实行，对全面理解蛋白质网络在病毒侵染、复制、潜伏等各个环节中作用机制，为艾滋病防止控制、疫苗和药物研发等奠定坚实理论基本。
课题1．病毒与宿主蛋白互相作用及其蛋白质网络功能与构造生物学研究。
重要研究内容：
1、HIV-1 辅助蛋白Vif与宿主蛋白互相作用及其蛋白质网络功能研究。
咱们已证明，VifF1是HIV-1 Vif对抗宿主A3G和A3F独一无二调节剂（数据未刊登）。在此，需要进一步拟定VifF1在HIV-1 Vif蛋白形成 E3泛素连接酶和逃避宿主防御因子APOBEC3蛋白过程中详细作用机制，以及HIV-1 Vif与新调控因子VifF1互相作用界面。
⑴． VifF1与否调节HIV-1 Vif在细胞内分布。
⑵． VifF1与否调节HIV-1 Vif和Gag和/或Cul5在细胞质膜定位。
⑶. VifF1与否调节HIV-1 Vif与病毒基因组RNA互相作用。
⑷. VifF1与否诱导HIV-1 Vif共价修饰提高了其与Cul5-ElonginB-ElonginC E3连接酶之间互相作用。
⑸. VifF1与否可以诱导HIV-1 Vif构象变化，提高与Cul5-ElonginB-ElonginC E3连接酶结合。
⑹. VifF1与否是Vif-Cul5-ElonginB-ElonginC E3连接酶中独一无二和重要组分。
⑺ 拟定HIV-1Vif与VifF1分子作用。
2、HIV Vpr和Vpx生物学功能和分子作用机制研究。
⑴．HIV病毒蛋白 Vpx分子作用机制。辅助蛋白Vpx是HIV/SIV病毒在人巨噬细胞内复制所不可缺少因子，有文献证明它与宿主内DCAF1、DDB1、Cul4A等蛋白互相作用形成E3连接酶发挥作用，近来研究证明HIV/SIVVpx蛋白可以抑制宿主细胞内抗病毒因子SAMHD1，咱们将进一步拟定Vpx抑制SAMHD1分子作用机制，Vpx重要功能区，SMAHD1广谱抗病毒作用，以及不同种属SAMHD1抗病毒作用。
⑵．HIV-1病毒蛋白Vpr分子功能区对其生物学活性影响。应用定点突变等办法，检测Vpr蛋白中某些重要功能区对其参加调节HIV-1病毒逆转录过程保真性，核运送以及核定位，诱导被侵染细胞细胞周期阻滞等重要生理功能影响；同步揭示 Vpr诱导细胞凋亡分子机制；Vpr增进HIV-1在巨噬细胞中感染机制。
3、新细胞内抗病毒因子鉴定。
鉴定HIV辅助蛋白Vpr靶向分子。咱们将采用免疫共沉淀和改良差减杂交等技术筛选和鉴定宿主细胞内相应抗病毒因子。
4、病毒蛋白及其形成蛋白质复合物构造生物学研究。
⑴ HIV-1 Vif蛋白构造生物学研究。VifF1因子对Vif对的折叠具备辅助作用，环绕HIV-1 Vif，对其形成具有Cul5、ElonginB、ElonginC或VifF1、A3G蛋白质复合物构造生物进行重点研究，在体外共表达蛋白质复合物，并进行纯化，结晶条件筛选，获得蛋白三维晶体构造，最后获得Vif构造方面突破性研究，并在此基本上阐述构造与功能之间关系。
⑵ HIV Vpx蛋白及其蛋白质复合物构造生物学研究。体外单独或共表达Vpx及其形成具有DCAF1或DDB1蛋白质复合物，纯化，结晶条件筛选，获得蛋白质复合物晶体构造并解析。
课题目的：
1） 完善病毒蛋白形成E3泛素化连接酶模型；
2） 拟定新调控因子在HIV-1病毒感染中作用机制；
3） 拟定HIV Vpr和Vpx生物学功能和分子作用机制；
4） 鉴定和定义新宿主细胞内抗病毒因子；
5） 获得两种复合物高质量、适合X射线衍射单晶体及其她核心蛋白质有关构造域晶体并且解析，通过晶体构造解析病毒重要蛋白及其复合物构造；
6） 刊登SCI研究论文15-18篇，其中IF＞10研究论文1-2篇，IF＞5研究论文8-10篇；
7） 申请2-3项专利；
8） 培养3-5名博士后，10-15名博士研究生。
承担单位：
吉林大学 清华大学
课题负责人：
于晓方 专家 吉林大学
重要学术骨干：
王冠军 专家 吉林大学
杨茂君 专家 清华大学
崔久嵬 专家 吉林大学
经费比例：32.5%

课题2 宿主因子在艾滋病易感性、病程进展及耐药性发生中作用。
重要研究内容：
1. 宿主因子遗传多态性研究。
通过real-time PCR，Western blot和基因测序等各种技术手段，定性和定量地研究艾滋病毒感染者和艾滋病人（特别是暴露未感者和长期非进展者）外周血单核细胞中APOBEC3超家族成员、Tetherin、TSG101等核心宿主因子转录水平，蛋白表达及基因多态性。
2. 研究宿主因子遗传多态性与艾滋病易感性及病程进展有关性。
对HIV感染者（涉及长期非进展和进展者）CD4计数和病毒载量进行定量，以拟定宿主因子遗传多态性与艾滋病毒感染、发病及疾病进展之间有关性。
3. 宿主因子突变体生物学功能及影响艾滋病易感性及病程进展分子机制。
克隆并表达暴露未感者和长期非进展者中宿主因子突变体，通过单轮感染性分析和病毒复制分析实验，研究突变体对野生型HIV-1病毒复制影响，并结合生物化学和构造生物学实验手段，研究突变体影响病毒复制分子机制。
4.APOBEC3超家族成员在逆转录病毒基因组变异和耐药性形成中作用。
研究不同物种来源APOBEC3超家族成员在其相应逆转录病毒中引入非致死性突变能力，对病毒基因组突变频率影响；阐明APOBEC3超家族成员非致死性突变能力与HIV-1耐药性形成有关性，为摸索通过抑制APOBEC3超家族成员非致死性突变能力减少病毒变异和耐药性发生频率新防治方略奠定理论基本。
课题目的：
1) 拟定宿主因子遗传多态性；
2) 拟定宿主因子遗传多态性与艾滋病易感性及病程进展性关系；
3) 明确APOBEC3超家族成员在病毒耐药性中作用及作用机制。
4) 摸索以宿主因子遗传多态性为分子标志物预测HIV-1易动人群和病程进展可行性。
5) 摸索通过抑制APOBEC3超家族成员非致死性突变能力减少病毒变异和耐药性发生频率新防治方略
6) 刊登有关SCI文章12-15篇，力求在Nature、Cell等顶级杂志刊登文章1篇；
7) 申请有关专利3-5项，其中华人民共和国际专利1-2项；
8) 培养中青年研究骨干3人，研究生15名。
承担单位：
中华人民共和国医学科学院医药生物技术研究所 吉林大学
课题负责人：
岑 山 教 授 中华人民共和国医学科学院医药生物技术研究所
重要学术骨干：
张文艳 副 教 授 吉林大学
周金明 副研究员 中华人民共和国医学科学院医药生物技术研究所
李晓宇 副研究员 中华人民共和国医学科学院医药生物技术研究所
经费比例：22.5%

课题3 宿主天然防御因子分子作用机制及构造生物学研究
重要研究内容：
1、 宿主天然防御因子Tetherin抗病毒作用机制。
⑴ Tetherin在细胞膜病毒装配和出芽过程中作用。
⑵ Tetherin抑制HIV-1病毒颗粒细胞间传播机制。
⑶ Tetherin影响病毒感染性机制。
2、鉴定病毒与抗病毒因子（Vpu/Tetherin）复合物中新细胞因子。
Tetherin自身也可以泛素化，并且TrCP在Vpu拮抗Tetherin过程中只有某些作用，在这个过程中应当尚有此外E3连接酶。蛋白质组学研究可以提供线索发现复合物中新细胞因子。
3、宿主天然防御因子构造生物学研究。
⑴ Tetherin蛋白及形成蛋白质复合物构造研究。Vpu和Tetherin之间通过它们TM区互相作用，通过NMR进一步研究TetherinTM区构造，以及两者TM区结合复合物。
⑵ A3G蛋白及形成蛋白质复合物晶体构造研究。A3G分子作用机制研究显示它特异性结合RNA形成核酸蛋白复合物，在体外表达体系中加入此共因子以辅助A3G N端蛋白对的折叠和可溶性表达，以便于在体外条件下进行结晶条件筛选、优化，最后获得A3G N端蛋白晶体构造解析。
4、病毒蛋白与宿主天然防御因子互相作用生物学功能。
⑴ Vpu结合Tetherin后在细胞内运转过程。
⑵ Vpu介导CD4和Tetherin降解途径关系。
课题目的：
1）拟定宿主防御因子Tetherin、A3G抗病毒作用机制；
2）鉴定新宿主细胞因子；
3）拟定病毒蛋白与宿主限制因子互相作用生物学功能；
4）用构造生物学手段解析宿主限制因子Tetherin、A3G及其复合物构造；
5）培养中青年研究骨干5人以上，研究生10名；
6）申请抗HIV病毒创新药物靶点专利1-2项；
7）在SCI收录杂志上刊登论文8-10篇，力求在国际顶尖杂志刊登文章。
承担单位：
中华人民共和国医学科学院病原生物学研究所
中华人民共和国科学院生物物理研究所
中华人民共和国医学科学院医药生物技术研究所
课题负责人：
郭 斐 研 究 员 中华人民共和国医学科学院病原生物学研究所
重要学术骨干：
梁 臣 教 授 中华人民共和国医学科学院病原生物学研究所
龚 勇 副研究员 中华人民共和国科学院生物物理研究所
韩燕星 副研究员 中华人民共和国医学科学院医药生物技术研究所
经费比例：22.5%

课题4 病毒感染潜伏期、重激活和病毒出芽核心宿主细胞因子研究
重要研究内容：
1、阻断TSG101对不同HIV病毒出芽抑制作用和机理。
前期研究成果表白运用siRNA、抗TSG101抗体或小分子化合物可阻断不同野生型HIV和耐药株病毒出芽，但对HIV能否通过突变产生抗TSG101阻断HIV病毒研究甚少。咱们将建立不同TSG101阻断研究系统，进一步研究HIV病毒在长期TSG101阻断条件下生物特性、突变谱和病毒出芽能力。特别是HIV Gag基因突变株对病毒出芽能力作用和机理。
2、TSG101与ESCRT复合物互相作用对细胞生理活动影响。
⑴ TSG101与ESCRT复合物互相作用对细胞生长和增殖影响。
⑵ TSG101阻断对细胞生长、增殖和代谢影响。
⑶ TSG101功能构造域修饰和蛋白降解调控。
3、全基因组筛选HIV-1感染潜伏期和重激活核心宿主细胞因子。
⑷ 建立HIV-1感染潜伏期和重激活细胞系和检测系统。
⑸ 建立全基因组突变平台。
⑹ 建立高通量筛选HIV-1感染潜伏期和重激活系统。
⑺ 筛选HIV-1感染潜伏期和重激活核心宿主细胞因子。
⑻ 功能鉴定核心宿主细胞因子。
4、核心宿主细胞因子对HIV-1前病毒转录调控分子作用机制。
⑴ 核心宿主细胞因子调节HIV-1前病毒转录调控机制。
⑵ 核心宿主细胞因子对HIV-1蛋白合成和降解调控机制。
⑶ 核心宿主细胞因子对HIV-1前病毒表观遗传学调控机制。
5、HIV-1 蛋白与核心宿主细胞因子互相作用功能和构造生物学研究。
⑴ HIV-1 蛋白与核心宿主细胞因子互相作用和功能构造域。
⑵ HIV-1 蛋白与核心宿主细胞因子互相作用蛋白网络。
⑶ 核心宿主细胞因子淋巴细胞和巨噬细胞中表达、调控和修饰。
6、核心宿主细胞因子在抗病毒免疫机制中作用和功能机制。
⑴ 核心宿主细胞因子对干扰素和淋巴因子调节作用。
⑶ 核心宿主细胞因子对TNF通道调节作用。
⑷ 核心宿主细胞因子对HIV-1重激活抑制机制研究。
⑸ HIV-1突变与核心宿主细胞因子关系。
⑹ 基于核心宿主细胞因子HIV-1感染潜伏期和重激活药物筛选系统。
课题目的：
1） 通过研究艾滋病毒与宿主细胞因子蛋白互相作用机制研究，系统地筛选和鉴定在艾滋病毒感染潜伏期和重激活核心宿主细胞因子；
2） 拟定艾滋病毒与核心宿主细胞因子互相作用功能和构造基本；
3） 初步确认宿主细胞因子蛋白质在艾滋病毒感染潜伏期和重激活分子机理和临床特性；
4） 为艾滋病感染潜伏期和重激活新防治办法提供理论基本；
5） 通过本项目实行，建立完善病毒与宿主细胞互相作用实验研究体系。培养一批高质量博士研究生；
6） 拟申请抗艾滋病毒创新药物靶点国际专利2-3项；
7） 在SCI收录杂志上刊登论文5-10篇，力求在Nature、Cell等国际顶尖杂志刊登文章1-2篇。
承担单位：
中华人民共和国医学科学院基本医学研究所 医药生物技术研究所 吉林大学
课题负责人：
李利民 研究员 中华人民共和国医学科学院基本医学研究所
重要学术骨干：
余利岩 研究员 中华人民共和国医学科学院基本医学研究所
尹洪超 副专家 中华人民共和国医学科学院医药生物技术研究所
周小红 副研究员 吉林大学
经费比例：22.5%

四、年度筹划

课题一研究内容
课题一预期目的
第

一

年
1、应用共聚焦显微镜技术和VifF1 shRNA沉默稳定表达细胞系，研究VifF1调节HIV-1Vif在细胞内分布；
2、应用TIRFM技术和VifF1 shRNA沉默稳定表达细胞系，研究VifF1调节HIV-1 Vif和Gag和/或Cul5在细胞质膜定位；
3、应用Real-time PCR技术和VifF1 shRNA沉默稳定表达细胞系，研究VifF1调节HIV-1 Vif与病毒基因组RNA互相作用；
4、应用免疫共沉淀及定点突变等技术拟定Vpx蛋白与宿主防御因子SAMHD1分子作用机制，研究Vpx蛋白重要功能区；
5、运用原核以及真核表达体系，对病毒蛋白Vif，ElonginB，EloginC，Cullin5不同组合蛋白质复合体进行表达条件优化。（这些蛋白或者截短体及复合物下面简称为目的蛋白）；纯化分离上述目的蛋白。
1、获得稳定表达VifF1 shRNA稳定表达细胞系，作为沉默VifF1以研究它调节作用重要平台；
2、拟定VifF1对HIV-1 Vif在细胞内分布影响；
3、拟定VifF1对HIV-1 Vif和Gag和/或Cul5在细胞质膜定位影响；
4、拟定VifF1对HIV-1 Vif与病毒基因组RNA互相作用影响；
5、拟定Vpx蛋白抑制SAMHD1机制；获得一系列Vpx突变体；
6、获得8种以上目的蛋白表达；纯化其中4种以上目的蛋白。
7、刊登SCI论文1-2篇；
第

二

年
1、应用VifF1 shRNA沉默稳定表达细胞系，研究VifF1对HIV-1 Vif磷酸化修饰作用；
2、用限制性蛋白水解法研究VifF1与否可以诱导HIV-1 Vif构象变化；
3、研究Vpx蛋白对不同种属SAMHD1抑制及不同种属SAMHD1抗病毒作用；
4、寻找Vpr分子中行使不同功能功能区；
5、构建稳定表达Vpr细胞系，通过免疫共沉淀办法寻找细胞内新抗病毒因子；
6、对于纯化得到目的蛋白开展结晶条件摸索。
1、拟定VifF1对HIV-1 Vif与否有磷酸化修饰作用；
2、拟定VifF1与否诱导HIV-1 Vif构象变化；
3、获得一系列不同种属SAMHD1表达克隆，
4、拟定Vpx对不同种属SAMHD1作用，评价互相作用种属特异性；同步拟定不同种属SAMHD1抗病毒作用；
5、获得一系列Vpr功能区突变体，验证它们对病毒核运送及核定位、诱导细胞周期阻滞功能影响；
6、优化免疫共沉淀条件，通过Silver染色发现特异性结合细胞内蛋白；
7、争取纯化出8种以上目的蛋白，获得3种以上目的蛋白晶体。
8、刊登SCI文章3-4篇。
第

三

年
1、研究VifF1对Vif-Cul5-EloB/C E3连接酶装配调节；
2、研究SAMHD1中决定其抗病毒作用功能区；继续研究Vpx与SAMHD1互相作用机制；开展SAMHD1广谱抗病毒作用研究；
3、继续研究Vpr分子中行使不同功能功能区；
4、对与Vpr特异性结合蛋白进行质谱鉴定；
5、继续开展晶体优化工作，并对于已经获得晶体蛋白开展构造解析工作。
1、拟定Vif-Cul5-EloB/C E3连接酶形成模型；
2、获得一系列不同SAMHD1突变体，拟定SAMHD1中重要功能区；同步拟定SAMHD1对其他逆转录病毒HBV作用，评价它广谱抗病毒能力；
3、拟定Vpr诱导细胞凋亡分子机制；
4、通过质谱鉴定和分析，筛出2-3个重要特异性结合蛋白质；
5、获得总共4种以上目的蛋白晶体，同步完毕其中2种以上蛋白晶体构造研究。
6、刊登SCI文章3-4篇。
第

四

年
1、继续研究VifF1调节作用；通过免疫共沉淀以及对抗病毒因子抑制作用等实验研究VifF1与HIV-1 Vif分子作用功能区，为创新药物开发提供新靶点；
2、继续研究SAMHD1广谱抗病毒能力和作用机理；
3、继续研究Vpr分子中行使不同功能功能区；
4、通过沉默、免疫共沉淀等技术对新病毒因子进行功能研究；
5、继续对于获得晶体蛋白开展构造解析工作；对于已经完毕构造解析蛋白开展有关功能研究。
1、拟定HIV-1 Vif分子中与VifF1作用功能区；拟定VifF1分子中决定与Vif互相作用功能区；
2、拟定SAMHD1对HIV及其他病毒作用机理；
3、拟定Vpr分子中各个功能区生物学功能；
4、拟定新病毒因子生物学功能；
5、共完毕4种以上目的蛋白晶体构造研究；争取完毕1-2种目的蛋白机理研究。
6、刊登SCI文章3-4篇。
第

五

年
1、完善VifF1调节HIV-1 Vif形成E3连接酶作用模型，发现新研