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生物化学实验PPT课件实验基本知识实验基本知识 容容 量量 瓶瓶液体的量取液体的量取液体的倾倒液体的倾倒滴管的使用滴管的使用试纸的使用试纸的使用一定质量分数的溶液的配制一定质量分数的溶液的配制滤纸的折叠滤纸的折叠物质分离与提纯过滤物质分离与提纯过滤萃取与分液萃取与分液实验内容安排实验内容安排共共3636学时学时1 1、绪论生物化学实验规则及常用仪器使用入门（、绪论生物化学实验规则及常用仪器使用入门（2 2学时）学时）2 2、实验一、实验一 纸层析分离鉴定氨基酸纸层析分离鉴定氨基酸（6 6学时）学时）3 3、实验二、实验二 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳（4 4学时）学时）4 4、实验三、实验三 蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应（2 2学时）学时）5 5、实验四、实验四 蛋白质的沉淀、变性反应蛋白质的沉淀、变性反应（3 3学时）学时）6 6、实验五、实验五 凝胶过滤法除蛋白质中的离子凝胶过滤法除蛋白质中的离子（4 4学时）学时）7 7、实验六、实验六 酵母酵母RNARNA的提取和鉴定的提取和鉴定(4(4学时学时)8 8、实验七、实验七 血糖含量的测定血糖含量的测定（4 4学时）学时）9 9、实验八、实验八 脂肪酸的脂肪酸的-氧化氧化 （5 5学时）学时）1010、实验报告讲解及考核、实验报告讲解及考核 （2 2学时）学时）1实验目的实验目的l掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分离、掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分离、纯化和测定技术的原理及方法；纯化和测定技术的原理及方法；l掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实验技能验技能；l培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学作风、创新能力等综合素质。作风、创新能力等综合素质。绪论绪论2 通过生物化学实验应该做到通过生物化学实验应该做到l学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。理地安排实验步骤和时间。l训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物化学实验仪器。物化学实验仪器。l学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验。行所有的实验。l掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，尤其是各种电泳技术和层析枝术尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今后参加，为今后参加科研工作打下坚实的基础。科研工作打下坚实的基础。3.1 3.1 实验记录实验记录u实验前写好实验预习报告实验前写好实验预习报告(钢笔和园珠笔钢笔和园珠笔)。u实验中应及时准确地记录实验中应及时准确地记录(专用纸，事先在记录纸上专用纸，事先在记录纸上设计好各种记录格式和表格）所观察到的现象和测量设计好各种记录格式和表格）所观察到的现象和测量的数据。的数据。u实验记录要注意有效数字，实验记录要注意有效数字，如吸光度值应为如吸光度值应为“0.050”“0.050”，而不能记成，而不能记成“0.05”“0.05”。每个结果都要尽。每个结果都要尽可能重复观测二次以上，即使观测的数据相同或偏差可能重复观测二次以上，即使观测的数据相同或偏差很大，也都应如实记录，不得涂改。很大，也都应如实记录，不得涂改。u实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、编号、生产厂等；生物材料的来源、试剂的规格、试编号、生产厂等；生物材料的来源、试剂的规格、试剂的浓度等。剂的浓度等。3 3 实验记录与实验报告实验记录与实验报告3 3 实验记录与实验报告实验记录与实验报告3.2 3.2 实验报告实验报告实验报告的格式应为：实验报告的格式应为：实验目的；实验目的；实验原理；实验原理；仪器、材料和试剂；仪器、材料和试剂；实验步骤；实验步骤；结果讨论（含数理据处）；结果讨论（含数理据处）；注意事项注意事项;(7)(7)思考题思考题 注意：实验结果的讨论要充分，尽可能多查阅一些有注意：实验结果的讨论要充分，尽可能多查阅一些有关的文献和教科书，充分运用己学过的知识和生物化关的文献和教科书，充分运用己学过的知识和生物化学原理，进行深入的探讨，勇于提出自己独到的分析学原理，进行深入的探讨，勇于提出自己独到的分析和见解，并欢迎对实验提出改进意见。和见解，并欢迎对实验提出改进意见。4 实验成绩评分方法实验成绩评分方法n实验预习情况（实验预习情况（10%10%）n实验操作情况（实验操作情况（20%20%）n实验报告情况（实验报告情况（70%70%）生物化学实验技术理论生物化学实验技术理论层析技术l1903年，俄国科学家首创了一种从绿叶中分离多种不同颜色色素成分的方法，命名为色谱法(Chromatography)，由于翻译和习惯的原因又常称为层析法。l80多年来，层析法不断发展，形式多种多样。50年代开始，相继出现了分配层析、离于交换层析、凝胶层析、亲和层析、吸附层析等。l几乎每一种层析法都已发展成为一门独立的生化高技术，在生化领域内得到了广泛的应用。一、层析技术一、层析技术一、层析技术一、层析技术l1、层析技术原理l2、层析技术分类l3、常用层析技术原理1、层析技术原理、层析技术原理l层析原理：是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为固定相，另一相流过此相称作流动相，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。l可分离物质：糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸。2、层析技术分类、层析技术分类名称名称操作方式操作方式固定相固定相流动相流动相分离依据分离依据分配层析分配层析纸层析纸层析薄层层析薄层层析液体液体液体液体溶解度溶解度离子交换层析离子交换层析离子交换柱层析离子交换柱层析固体固体液体液体带电性带电性静电引力静电引力吸附层析吸附层析吸附薄层层析吸附薄层层析气体吸附层析气体吸附层析固体固体固体固体液体液体气体气体吸附力吸附力亲合层析亲合层析酶与底物酶与底物抗原与抗体抗原与抗体固体固体液体液体配体专一性配体专一性凝胶层析凝胶层析 凝胶过滤凝胶过滤固体固体液体液体分子大小分子大小3、常用的层析原理、常用的层析原理l（1）分配层析纸层析l原理：溶质在互不相溶的两相中溶解度不同，在终点时达到一种平衡，其比值为一个常数，即分配系数（）。l 固定相内溶质的浓度 流动相内溶质的浓度 固定相：滤纸上吸附的水 流动相：有机溶剂（正丁醇）=128646432643216484816 8324832 8 4204040 20 4 2123040 30 12 2纸层析纸层析l纸层析是最简单的液一液相分配层析。l滤纸是纸层析的支持物。当支持物被水饱和时，大部分水分子被滤纸的纤维素牢牢吸附，因此，纸及其饱和水为层析的固定相，与固定相不相混溶的有机溶剂为层析的流动相。l对某些特定化合物，在特定的展层系统，一定的温度条件下，Rf是个常数。（2）离子交换层析）离子交换层析l原理：将能与周围介质进行离子交换的不稳定离子固定于惰性基质上，从而分离介质中的组分。l常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交联剂：二乙烯苯）l阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基l阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基 l可交换离子：阳离子：Na+、H+阴离子：Cl-、OH-示意图（交换树脂表面）示意图（交换树脂表面）示意图（离子交换过程）示意图（离子交换过程）电离基团（磺酸根）可交换离子（钠离子）交换离子不交换离子示意图示意图水分子B物质A物质（3）吸附层析）吸附层析l原理：当气体或液体中某组分的分子在运动中碰到一个固体表面原理：当气体或液体中某组分的分子在运动中碰到一个固体表面时，分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才离开，此为吸时，分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才离开，此为吸附现象。附现象。l吸附现象形成的原因：吸附现象形成的原因：吸附作用可能由几种作用力形成，包括被吸附作用可能由几种作用力形成，包括被吸附物与吸附剂之间相反电荷基团与基团之间的静电引力吸附物与吸附剂之间相反电荷基团与基团之间的静电引力(形成离形成离子键子键)、氢键及范德华引力等。、氢键及范德华引力等。l在不同条件在不同条件 下，占主要地位的作用力可能不同，也可能几种力同下，占主要地位的作用力可能不同，也可能几种力同时起作用时起作用l吸附剂：氧化铝、活性炭、硅胶；纤维素、淀粉、聚酰胺；滑石、吸附剂：氧化铝、活性炭、硅胶；纤维素、淀粉、聚酰胺；滑石、陶土、粘土。陶土、粘土。吸附层析示意图吸附层析示意图 吸附剂易吸附分子不易吸附分子（4）亲和层析）亲和层析l原理：利用分子间具有专一亲和力而设计的层析利用分子间具有专一亲和力而设计的层析技术。技术。l专一亲和力分子对：酶与底物、特异性抗原与酶与底物、特异性抗原与抗体、抗体、DNA和和RNA、激素和其受体、激素和其受体l载体：使亲和物固相化的水不溶性化合物。如：使亲和物固相化的水不溶性化合物。如：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、乙烯、多孔玻璃。烯、乙烯、多孔玻璃。（5）凝胶过滤凝胶过滤l原理：被分离物质因分子大小不同，在凝胶中向下移动的被分离物质因分子大小不同，在凝胶中向下移动的速度不同。速度不同。l物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：垂直向下移动和无定向物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：垂直向下移动和无定向的扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒内，只能分的扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒内，只能分布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒内，因此向下移动慢。内，因此向下移动慢。l凝胶物质：马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶。胺凝胶、葡聚糖凝胶。电 泳 技 术一一.电泳的概念电泳的概念二二.电泳技术分类电泳技术分类三三.电泳技术基本原理电泳技术基本原理四四.几种常见电泳方法的比较几种常见电泳方法的比较五五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理一.电泳的概念l带电质点在电场中移动的现象带电质点在电场中移动的现象。二.电泳技术分类三.电泳技术基本原理1.基本原理基本原理 不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度，主要与其所不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度，主要与其所带净电荷量，分子量及分子形状有关。带净电荷量，分子量及分子形状有关。pH pI 分子带负电荷分子带负电荷,在电场中向正极移动在电场中向正极移动;pH 蛋蛋 GlyGlylm mcl cl cl clmm蛋蛋 蛋蛋m m GlyGly GlyGlyl凝胶中凝胶中ClCl为快离子，为快离子，Gly Gly为慢离子，为慢离子，蛋白质样品被夹在中间。蛋白质样品被夹在中间。缓冲缓冲液液样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶缓冲液成分及pH的不连续性导致蛋白质样品浓缩效应示意图l快离子l慢离子l蛋白质样品 lE：每厘米的电压降每厘米的电压降 E EI(I(电流强度电流强度)/)/(电导率电导率)lE E与电泳速度成正比与电泳速度成正比l电泳开始后，由于快离子泳动电泳开始后，由于快离子泳动率最大，在快离子后面形成一率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低的低电导区，产个离子浓度低的低电导区，产生较高的电位梯度，使蛋白质生较高的电位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋白质样和慢离子加速移动，蛋白质样品被进一步浓缩。品被进一步浓缩。电位梯度的不连续性lE：每厘米的电压降每厘米的电压降 E EI(I(电流强度电流强度)/)/(电导率电导率)lE E与电泳速度成正比与电泳速度成正比l电泳开始后，由于快离子泳动电泳开始后，由于快离子泳动率最大，在快离子后面形成一率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低的低电导区，产个离子浓度低的低电导区，产生较高的电位梯度，使蛋白质生较高的电位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋白质样和慢离子加速移动，蛋白质样品被进一步浓缩。品被进一步浓缩。电位梯度的不连续性A.样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括理包括：l缓冲液成分及缓冲液成分及pHpH的不连续性的不连续性l电位梯度的不连续性电位梯度的不连续性 缓冲液缓冲液浓缩胶浓缩胶样品样品分离胶分离胶A.样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括理包括：l凝胶层的不连续性：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移动，极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。慢，堆积浓缩。缓冲缓冲液液样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶A.样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括理包括：l凝胶层的不连续性：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移动，极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。慢，堆积浓缩。缓冲缓冲液液样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶A.样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括理包括：l凝胶层的不连续性：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移动，极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。慢，堆积浓缩。缓冲缓冲液液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶A.样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括理包括：l凝胶层的不连续性：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移动，极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。慢，堆积浓缩。缓冲缓冲液液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶B.电荷效应l蛋白质样品进入分离胶后蛋白质样品进入分离胶后 pHpH增大增大(pH 8.9)(pH 8.9)，GlyGly解离度增解离度增大，不存在快、慢离子之分，大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和蛋白质样品在均一电场强度和pHpH条件下泳动。条件下泳动。l由于各种蛋白质由于各种蛋白质pI不同，所载有不同，所载有效电荷不同，因此质点的效电荷不同，因此质点的 有效有效迁移率不同，形成不同区带。迁移率不同，形成不同区带。缓冲缓冲液液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶C.分子筛效应l分离胶的孔径小，各分子分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，所由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同受阻力不同，表现出不同的的 泳动速度，即分子筛作泳动速度，即分子筛作用。分子量小，形状为球用。分子量小，形状为球形的泳动速度最快。形的泳动速度最快。缓冲缓冲液液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶实验一实验一 氨基酸的分离与鉴定氨基酸的分离与鉴定 滤纸层析法滤纸层析法一、实验目的1.1.通通过过氨氨基基酸酸的的分分离离，学学习习纸纸层层析析法法的的基基本本原原理理及及操作方法操作方法2.2.掌掌握握氨氨基基酸酸纸纸上上层层层层析析法法的的操操作作技技术术（点点样样、平平衡、展层、显色、鉴定）衡、展层、显色、鉴定）.二、实验原理1.1.是是分分配配层层析析的的一一种种。在在纸纸上上水水被被吸吸附附在在纤纤维维素素的的纤纤维维之之间间形形成成固固定定相相。当当有有机机相相沿沿纸纸流流动动经经过过层层析析点点时时，层层析析点点上上溶溶质质就就在在水水相相和和有有机机相相之之间间进进行行分分配配，溶溶质质中中各各组组分分的的分分配配系系数数不不同同，移移动动速速率率也也不不同，因而可以彼此分开。同，因而可以彼此分开。2.2.氨基酸与茚三酮的显色反应。氨基酸与茚三酮的显色反应。3.3.物物质质被被分分离离后后在在纸纸层层析析图图谱谱上上的的位位置置是是用用R Rf f值值来来表表示示的的。在在一一定定的的条件下某种物质的条件下某种物质的R Rf f值是常数。值是常数。R Rf f 原点到溶剂前沿的距离原点到溶剂前沿的距离原点到层析点中心的距离原点到层析点中心的距离4 4.R Rf f值值的的大大小小与与物物质质的的结结构构、性性质质、溶溶剂剂系系统统、P PH H层层析析滤滤纸纸的的质质量和层析温度等因素有关。量和层析温度等因素有关。5.5.上层层析、下层层析、单向层析、双向层析。上层层析、下层层析、单向层析、双向层析。三、仪器、材料和试剂实验仪器实验仪器1 1层析缸、培养皿、小烧杯、长颈漏斗层析缸、培养皿、小烧杯、长颈漏斗2 2毛细管、吹风机、电热鼓风干燥箱毛细管、吹风机、电热鼓风干燥箱3 3层析滤纸、手套层析滤纸、手套、透明胶带或针线、透明胶带或针线实验材料和试剂实验材料和试剂1 1氨氨基基酸酸溶溶液液分分别别配配制制0.5%0.5%的的LysLys、AluAlu、IleIle、MetMet溶溶液液及及它它们们的的混合液（各组份浓度均为混合液（各组份浓度均为0.5%0.5%）。）。2 2显色剂显色剂0.1%0.1%水合茚三酮丙酮溶液。水合茚三酮丙酮溶液。3 3扩展剂（展层剂）扩展剂（展层剂）酸酸溶溶剂剂系系统统：正正丁丁醇醇:80%:80%甲甲酸酸:水水15:3:215:3:2（体体积积比比），平平衡衡溶溶剂剂与扩展剂相同。每组配制与扩展剂相同。每组配制30ml30ml碱碱溶溶剂剂系系统统：正正丁丁醇醇:12%:12%氨氨水水:95%:95%乙乙醇醇13:3:313:3:3（体体积积比比），平平衡溶剂为衡溶剂为12%12%氨水。氨水。四、操作步骤与方法 溶剂前沿层析点原点溶剂前沿亮苯丙缬脯赖l1 1将盛有扩展剂将盛有扩展剂10ml10ml的小烧杯和培养皿置于密闭的层析缸中。的小烧杯和培养皿置于密闭的层析缸中。l2 2戴手套取层析滤纸一张作标记。戴手套取层析滤纸一张作标记。l3 3。点点样样：干干后后重重复复点点一一次次，直直径径最最大大不不超超过过3mm3mm。缝缝成成筒筒状状，两两边边不不能能接触。点样面朝外，点样端朝下，盖上层析缸盖，平衡约接触。点样面朝外，点样端朝下，盖上层析缸盖，平衡约2020 3030分钟。分钟。l4.4.展展层层用用长长颈颈漏漏斗斗，扩扩展展剂剂的的液液面面需需低低于于点点样样线线1cm1cm。上上沿沿约约1 1厘厘米米时时，取出滤纸，用铅笔标出溶剂前沿界线，干燥。取出滤纸，用铅笔标出溶剂前沿界线，干燥。l5 5显显色色用用0.1%0.1%茚茚三三酮酮丙丙酮酮溶溶液液均均匀匀浸浸透透，烘烘箱箱（6565）5 5分分钟钟或或用用热热风风吹吹干干。脯脯氨氨酸酸、羟羟脯脯氨氨酸酸产产生生黄黄色色物物质质外外，所所有有氨氨基基酸酸及及一一切切蛋蛋白质都能和茚三酮产生兰紫色物质。白质都能和茚三酮产生兰紫色物质。五、实验结果与讨论六、注意事项1 1切勿用手直接接触滤纸和显色剂。切勿用手直接接触滤纸和显色剂。2.2.点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴。点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴。3 3使用的溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀。使用的溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀。七、思考题：七、思考题：l1做好本实验的关键是什么？l2实验操作过程，为何不能用手接触滤纸？l3影响Rf值的因素有哪些？实验二实验二血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳 l实验原理l实验材料与仪器l实验试剂l实验步骤实验原理实验原理 醋酸纤维薄膜电泳(CAME)是以醋酸纤维薄膜(CAM)作支持物的一种 区带电泳技术。醋酸纤维素薄膜是纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸 酯。将它溶于有机溶剂（如：丙酮，氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂 抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状结构，渗 透性强，对分子移动阻力小，厚度为120m。本实验以醋酸纤维素薄膜为电泳支持物，分离人血清蛋白。血清蛋白中含有清蛋白、1球蛋白、2球蛋白、球蛋白、球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同。分子量小、等电点低的，在相同碱性PH缓冲体系中，带负电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。例如人血清蛋白在 PH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。清蛋白泳动最快，其 余依次是球蛋白。实验材料与仪器实验材料与仪器（一）、材料：人血清（二）、仪器 醋酸纤维薄膜(8X2mm)；点样器；染色皿，漂洗器，镊子；玻璃板；常压电泳仪；直流电源整流器；水平电泳 槽；粗滤纸；直尺和铅笔实验试剂实验试剂 巴比妥缓冲液(pH8.6 I=0.06)；氨基黑10B染色液；漂洗液；95乙醇45ml、冰醋酸5ml；蒸馏水50ml；洗脱液 0.4molLNaOH；透明液；无水乙醇；冰醋酸7：3实验步骤实验步骤1浸泡：用镊子取醋酸纤维薄膜放在缓冲液中浸泡20分 钟。2点样：把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干 多余的液体，然后铺在玻璃板上(无光泽面朝 上)，将点样器在血清中沾一下（量薄薄一层为 好），再在膜条一端2-3厘米处轻轻水平地落下 并随时提起，这样即在膜条上点上了细条状的血 清样品。3电泳：在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面 等高，将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上。膜 条点样的一端放在负极上。通电，电流强度每条 膜1mA(注意强度),电泳时间约为50分钟。4染色：电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡5分 钟。5漂洗：将膜条从染色液中取出后移置到漂洗液申漂洗数 次至无蛋白区底色脱净为止，可得到色带清晰的 电泳图谱。6透明：将脱色后干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡 23分钟后取出平铺在玻璃板上,用一直径0.5cm 的玻璃棒将其间的气泡赶出,两者之间不能有泡。干燥后此透明薄膜,区带着色清晰,可用于光吸收扫 描,长期保存不褪色。思考题：思考题：l.为什么将薄膜的点样端放在滤纸桥的负极端？l.用乙酸纤维素薄膜作为电泳支持物有何优点？实验三 蛋白质的性质实验蛋白质及氨基酸的呈色反应 一、实验目的l（1）了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应）了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。原理。l（2）学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸）学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。的方法。二、实验原理l双缩脲反应双缩脲反应l尿素加热至尿素加热至180左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。l双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。含有一双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。含有一个肽键和一个个肽键和一个CSNH2，CH2NH2，CRHNH2，CH2NH2CHNH2CH2OH或或CHOHCH2NH2等基团等基团的物质也有此反应。的物质也有此反应。NH3干扰此反应，因为干扰此反应，因为NH3与与Cu2+可生可生成暗蓝色的络离子成暗蓝色的络离子Cu（NH3）42+。因此，一切蛋白质或二肽。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。是蛋白质或多肽。茚三酮反应l除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有有氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。该反应十分灵敏，质。该反应十分灵敏，1 1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。l茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。有色物质。l此反应的适宜此反应的适宜pH为为57，同一浓度的蛋白质或氨基酸在，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。黄色反应l含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。l多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。乙醛酸反应l在浓硫酸存在下，色氨酸与乙醛酸反应生成紫色物质，反应机理尚不清楚，可能是一分子乙醛酸与两分子色氨酸脱水缩合形成与靛蓝相似的物质。含有色氨酸的蛋白质也有此反应。三、仪器、材料和试剂实验仪器实验仪器试管；试管架；漏斗；铁架台；滴管；试剂瓶；试管；试管架；漏斗；铁架台；滴管；试剂瓶；水浴锅。水浴锅。实验材料和试剂实验材料和试剂尿尿素素；10%氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液；1%硫硫酸酸铜铜溶溶液液；2%卵卵清清蛋蛋白白溶溶液液；0.5%甘甘氨氨酸酸溶溶液液；0.1%茚茚三三酮酮水水溶溶液液；大大豆豆提提取取液液；头头发发；指指甲甲；0.5%苯苯酚酚溶溶液液；浓浓硝硝酸酸；0.3%色色氨氨酸酸溶溶液；液；0.3%酪氨酸溶液；冰醋酸、浓硫酸。酪氨酸溶液；冰醋酸、浓硫酸。四、操作步骤与方法 取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加形成双缩脲。冷后，加10%10%氢氧化钠溶液约氢氧化钠溶液约1ml1ml，振荡混匀，振荡混匀，再加再加1%1%硫酸铜溶液硫酸铜溶液1 1滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。要滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。向另一试管加卵清蛋白溶液约红色。向另一试管加卵清蛋白溶液约1ml1ml和和10%10%氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液2ml2ml，摇匀，再加，摇匀，再加1%1%硫酸铜溶液硫酸铜溶液2 2滴，随加随摇。观察紫玫瑰滴，随加随摇。观察紫玫瑰色的出现。色的出现。双缩脲反应实验操作双缩脲反应实验操作茚三酮反应实验操作l取取2 2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液液1ml1ml，再各加，再各加0.5ml0.1%0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混匀，茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热在沸水浴中加热1212分钟，观察颜色由粉色变分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。紫红色再变蓝。l在一小块滤纸上滴一滴在一小块滤纸上滴一滴0.5%0.5%甘氨酸溶液，风甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴干后，再在原处滴一滴0.1%0.1%茚三酮乙醇溶液，茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。黄色反应实验操作l向向7 7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。管 号1234567材 料（滴）鸡蛋清溶液4大豆提取液4指甲少许头发少许0.5%苯酚40.3%色氨酸40.3%酪氨酸4浓硝酸/（滴）244040444现象乙醛酸反应实验操作乙醛酸反应实验操作l 取取3 3支试管。编号。分别按上表加入蛋白质溶支试管。编号。分别按上表加入蛋白质溶液、色氨酸溶液和水，然后各加入冰醋酸液、色氨酸溶液和水，然后各加入冰醋酸2 2毫升，毫升，混匀后倾斜试管，沿管壁分别缓缓加入浓硫酸约混匀后倾斜试管，沿管壁分别缓缓加入浓硫酸约1 1毫升，静置。观察各管液面间紫色环的出现。若不毫升，静置。观察各管液面间紫色环的出现。若不明显，可于水浴中微热。明显，可于水浴中微热。试剂管号水滴0.03%色氨酸溶液（滴）蛋白质溶液（滴）冰醋酸（ml）浓硫酸（ml）现 象1-521241-2135-21五、思考题：五、思考题：l1.1.茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调？并说明原因。？并说明原因。l2.2.你能区分蛋白质茚三酮反应及其他氨基化合你能区分蛋白质茚三酮反应及其他氨基化合物茚三酮反应的结果吗？试解释之。物茚三酮反应的结果吗？试解释之。l3.3.能否利用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的存能否利用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的存在？在？l4.4.哪些芳香基因（蛋白质中的、非蛋白质中的）哪些芳香基因（蛋白质中的、非蛋白质中的）可以与浓硝酸作用呈现黄色反应的阳性结果？可以与浓硝酸作用呈现黄色反应的阳性结果？实验四 蛋白质的变性、沉淀反应蛋白质的变性、沉淀反应 一、实验目的l（1）加加深深对对蛋蛋白白质质胶胶体体溶溶液液稳稳定定因因素素的的认认识。识。l（2）了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用）了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。意义。l（3）了解蛋白质变性与沉淀的关系。）了解蛋白质变性与沉淀的关系。二、实验原理l 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。蛋白质的沉淀反应可分为两类。脱水而沉淀。蛋白质的沉淀反应可分为两类。l（1 1）可逆的沉淀的反应）可逆的沉淀的反应 此时蛋白质分子的结构此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。l（2 2）不可逆沉淀反应）不可逆沉淀反应 此时蛋白质分子内部结此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。此类。l 蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。因此变性蛋件仍然存在（如电荷），并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。未必都已变性。三、仪器、材料和试剂 实验材料和试剂实验材料和试剂0.2%0.2%鸡鸡蛋蛋清清溶溶液液；pH4.7 pH4.7 醋醋酸酸-醋醋酸酸钠钠的的缓缓冲冲溶溶液液；3%3%硝硝酸酸银银溶溶液液；5%5%三三氯氯乙乙酸酸溶溶液液；95%95%乙乙醇醇；饱饱和和硫硫酸酸铵铵溶溶液液；硫硫酸酸铵铵结结晶晶粉粉末末；0.1 0.1 molL-1molL-1盐盐酸酸溶溶液液；0.1 0.1 molL-1molL-1氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液；0.05 0.05 molL-1molL-1碳碳 酸酸 钠钠 溶溶 液液；0.1 0.1 molL-1molL-1醋醋酸酸溶溶液液；甲甲基基红红溶溶液液；2%2%氯氯化化钡钡溶溶液液；10%NaOH10%NaOH；饱饱和和的的NaClNaCl；10%10%醋酸。醋酸。四、操作步骤与方法 1 1盐析：加盐析：加5%5%卵清蛋白溶液卵清蛋白溶液5 ml5 ml于试管中，再加等量的饱和硫酸铵于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？将管中内容物过滤，向滤液中添加硫少量水，观察是否溶解，为什么？将管中内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。2 2重金属离子沉淀蛋白质：重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的重金属离子沉淀蛋白质：重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。复合物。取取1 1支试管，加入蛋白质溶液支试管，加入蛋白质溶液2 ml2 ml，再加，再加3%3%硝酸银溶液硝酸银溶液1212滴，振滴，振荡试管，有沉淀产生。放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，荡试管，有沉淀产生。放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？沉淀是否溶解？为什么？3 3某些有机酸沉淀蛋白质：取某些有机酸沉淀蛋白质：取1 1支试管，加入蛋白质溶液支试管，加入蛋白质溶液2 ml2 ml，再加，再加1 ml5%1 ml5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。放置片刻，倾出上三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。l4加加热热沉沉淀淀蛋蛋白白质质：取取5支支试试管管，编编号号。依依下下表表顺顺序序加加入入试试剂剂：将将各各管管混混匀匀，观观察察记记录录各各管管情情况况，然然后后，放放沸沸水水浴浴中中加加热热10min，注注意意观观察察各各管管的的沉沉淀淀情情况况，最最后后将将第第3、4、5号号管管分别用分别用10%NaOH或或10%醋酸中和，观察并解释实验结果。醋酸中和，观察并解释实验结果。试剂管号蛋清蛋白质（滴）0.1mol/L醋酸（滴）10%醋酸（滴）饱和的NaCl（滴）10%NaOH(滴）蒸馏水（滴）110-72105-5310-5-5410-52-510-255乙醇引起的变性与沉淀：取3支试管，编号。依下表顺序加入试剂：振摇混匀后，观察各管有何变化。放置片刻，向各管内加水8 ml，然后在第2、3号管中各加一滴甲基红，再分别用0.1 molL-1醋酸溶液及0.05 molL-1碳酸钠溶液中和之。观察各管颜色的变化和沉淀的生成。每管再加0.1 molL-1盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。解释各管发生的全部现象。试剂（ml）管号5%卵清蛋白溶液0.1 molL-1氢氧化钠溶 液0.1 molL-1盐酸溶液95%乙醇pH4.7缓冲溶液123111111111五、思考题：五、思考题：l1.鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂？鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂？l2氯化汞为何能做为杀菌剂？氯化汞为何能做为杀菌剂？实验五五 凝胶过滤法使蛋白质脱盐凝胶过滤法使蛋白质脱盐 一、实验目的l 学学习习凝凝胶胶过过滤滤法法分分离离纯纯化化