《酯酶与氧化酶》ppt课件.ppt

EsteraseEsterase1.一、基本概念一、基本概念1.定定义：酯酶(Esterase),催化作用于催化作用于酯类物物质的的酯健健,使之水使之水解的解的酶的的总称称,包括磷酸包括磷酸酶,羧酸酸酯水解水解酶,硫酸硫酸酯水解水解酶等。等。羧酸酸酯水解水解酶(Carboxylic ester hydrolase)，是所有能，是所有能催化催化羧酸酸酯水解的水解的酶的的总称（或称称（或称酯酶），其作用是），其作用是水解脂肪族水解脂肪族酯和芳香族和芳香族酯，催化的反，催化的反应式：式：羧酸2.2.2.酯和和酯键酯由来自由来自羧酸的酸的酰基基和来自和来自醇的醇的烃氧基氧基组成，是成，是羧酸与醇反酸与醇反应失水失水而生成，即而生成，即羧基上基上羟基和醇基和醇羟基上基上的的氢共同脱水。通式共同脱水。通式R-CO-ORR-CO-OR，结构上可看作构上可看作羧酸酸中的中的羟基被基被烃氧基（氧基（-OR-OR）取代的取代的产物，亦可看作物，亦可看作醇中醇中羟基的基的氢原子被原子被酰基（基（R-CO-R-CO-）取代的取代的产物。物。羧酸3.酰基基（R-CO-R-CO-）是含氧酸分子（）是含氧酸分子（RCOOHRCOOH）中）中去掉酸去掉酸性性OHOH后（即能离解出后（即能离解出H H+的的OHOH基）余下的基基）余下的基团。包括。包括丙丙酰基基(丙酸）、苯甲丙酸）、苯甲酰基（苯甲酸）、草基（苯甲酸）、草酰基基（草酸）、苯磺（草酸）、苯磺酰基（苯磺酸）、基（苯磺酸）、亚硝硝酰基（基（亚硝硝酸）、酸）、亚硫硫酰基（基（亚硫酸）、磷硫酸）、磷酰基（磷酸）。基（磷酸）。4.5.3.3.酯酶与水解反与水解反应 羧酸酸酯酶水解水解羧酸酸酯为醇醇和和羧酸酸芳香芳香酯酶水解水解乙酸苯乙酸苯酯为酚酚和和乙酸乙酸脂肪脂肪酶水解甘油三水解甘油三酯为甘油二甘油二酯和脂肪酸和脂肪酸乙乙酰酯酶水解乙水解乙酰酯为醇和乙酸醇和乙酸乙乙酰胆碱胆碱酯酶水解水解乙乙酰胆碱胆碱为胆碱胆碱和和乙酸乙酸胆碱胆碱酯酶水解水解酯酰胆碱胆碱为胆碱胆碱和和羧酸酸6.根据根据酶对底物、底物、pH、激活、激活剂、抑制、抑制剂的反的反应特特点，可将点，可将酯酶分分为20余种，在生物化学上余种，在生物化学上统称称为酯酶，只有一部分可用只有一部分可用组化的方法化的方法证明。通常根据明。通常根据对底物是底物是否具有特异性，可分否具有特异性，可分为特异性特异性与与非特异性非特异性酯酶两种。两种。分解分解短短链（C2C4）低）低级脂肪酸脂肪酸酯多多为非特异性非特异性酯酶，如芳香基如芳香基酯酶、羧酸酸酯酶和乙和乙酰酯酶。特异性。特异性酯酶据据其底物特异性可分其底物特异性可分为，分解，分解长链(C8以上）高以上）高级脂肪脂肪酸酸酯的的酶称称酯酶(Lipase)，分解乙分解乙酰胆碱的胆碱的乙乙酰胆碱胆碱酯酶，分解，分解酯酰胆碱的胆碱的胆碱胆碱酯酶。二、二、酯酶的分的分类7.（一）非特异性（一）非特异性酯酶(non-specific esterase)：无底物特异性。根据无底物特异性。根据E600,DFP,PCMB对它它们的抑制作用不同，分的抑制作用不同，分为3类.1.芳香芳香基基酯酶(Aromesterase)，即，即A-酯酶，亦称有机，亦称有机磷酸抵抗性磷酸抵抗性酯酶I。（）底物：（）底物：萘酚乙酚乙酯萘酚乙酸酚乙酸酯类吲哚酚乙酸酚乙酸酯类8.（）完全抑制（）完全抑制10mmol/L 磷酸二乙基磷酸二乙基对硝基苯硝基苯酯(E 600)1mmol/L CuSO41mmol/L Pb(NO3)210mmol/L AgNO3100 mol/L 对氯高汞苯甲酸高汞苯甲酸(PCMB)（）激活（）激活mmol/L半胱氨酸半胱氨酸(Cysteine)9.、脂肪族、脂肪族酯酶（aliesterase),即即B-酯酶，亦称有亦称有机磷酸敏感性机磷酸敏感性酯酶（）底物（）底物 萘酚乙酚乙酯；萘酚乙酸酚乙酸酯类；吲哚酚乙酸酚乙酸酯类。（）完全抑制（）完全抑制10 mol/L磷酸二乙基磷酸二乙基对硝基苯硝基苯酯(E-600)100 mol/L毒扁豆碱毒扁豆碱(Eserine)10mmol/L AgNO310.乙乙酰酯酶(acetylesterase)：即：即C-酯酶，又称有机磷酸抵抗性又称有机磷酸抵抗性酯酶（）底物（）底物吲哚酚乙酸酚乙酸酯类萘酚酚AS乙酸乙酸酯类（）完全抑制（）完全抑制10mmol/L -苯丙酸苯丙酸10mmol/L AgNO31mmol/L CuSO4（）（）激活激活100 mol/L 对氯高汞苯甲酸高汞苯甲酸(PCMB)100 mol/L 苯苯氯化汞化汞11.非特异性酯酶A酯酶B酯酶C酯酶别称芳香/芳基酯酶,有机磷酸抵抗性酯酶羧酸酯酶,芳香族酯酶,有机磷酸敏感性酯酶乙酰酯酶,-SH抑制性抵抗性酯酶,有机磷酸抵抗性酯酶E600(10-4mol/L)抑制PCMB(10-4mol/L)抑制激活12.（二）特异性（二）特异性酯酶(Specific esterase)根据底物的特异性分根据底物的特异性分为三种三种:、脂、脂酶(Lipase)底物：高底物：高级脂肪酸脂肪酸抑制抑制剂：毒扁豆碱：毒扁豆碱(eserine)激活激活剂：2.5%牛磺胆酸牛磺胆酸钠、胆碱、胆碱酯酶(cholinesterase)特异性底物：丁特异性底物：丁酰硫代胆碱硫代胆碱 抑制抑制剂：四异丙基氨基焦：四异丙基氨基焦酰胺胺(ISO-OMPA)3、乙、乙酰胆碱胆碱酯酶(Acetylcholinesterase)底物：底物：乙乙酰 甲基硫代胆碱甲基硫代胆碱 乙乙酰硫代胆碱硫代胆碱 乙乙酰基基吲哚重氮重氮盐 抑制抑制剂：四异丙基氨基焦：四异丙基氨基焦酰胺胺(ISO-OMPA)13.酯酶的的鉴别、根据底物特异性、根据底物特异性选择特异底物配制孵育液特异底物配制孵育液、选择一定一定浓度的抑制度的抑制剂或激活或激活剂通常使用抑制通常使用抑制剂的方法是向底物液中加的方法是向底物液中加抑制抑制剂或将切片在抑制液中浸或将切片在抑制液中浸渍。14.（一）（一）显示法示法 A.A.偶氮色素法偶氮色素法 、反、反应原理原理在在酶作用下，从底物游离出来的作用下，从底物游离出来的-萘酚酚ASAS与与重氮重氮盐偶偶联形成形成偶氮色素偶氮色素，同，同时沉着于沉着于酶的存在部位，通的存在部位，通过偶氮色素偶氮色素显色，色，间接接证明明酶的存在部位。的存在部位。-萘酚系酚系统可用重氮可用重氮盐坚牢牢蓝，坚牢牢蓝RRRR，坚牢牢红RCRC盐。萘酚酚ASAS系系统用柘榴石（黄色）、用柘榴石（黄色）、GBGB盐、坚牢牢红RCRC、坚牢牢红紫紫LCLC盐。三、非特异性三、非特异性酯酶15.16.17.2.2.孵育液孵育液 （萘酚酚ASAS乙酸乙酸酯法法 Pearse,1972Pearse,1972）1%1%萘酚酚ASAS醋酸醋酸盐（丙（丙酮溶液）溶液）0.1ml (0.1ml (底物）底物）0.05mol/L PBS(pH 7.0)0.05mol/L PBS(pH 7.0)10ml 10ml（缓冲液）冲液）坚牢牢蓝B B盐30mg30mg（重氮（重氮盐）搅拌拌过滤使用使用3.3.操作步操作步骤 (1)(1)新新鲜组织恒冷箱切片；恒冷箱切片；(2)(2)入孵液，室温或入孵液，室温或37 20-30min37 20-30min；(3)(3)流水冲洗流水冲洗2min2min；(4)(4)2%2%甲基甲基绿复染复染细胞核；胞核；(5)(5)流水冲洗流水冲洗3-5min3-5min；(6)(6)甘油明胶封固。甘油明胶封固。18.4.4.结果与果与评价价酶活性部位活性部位为黑色黑色，胞核，胞核为绿色色。活性部位的染。活性部位的染色色视重氮重氮盐不同而异。不同而异。坚牢牢红TRTR为紫紫红色，色，坚牢牢红RCRC为暗暗红色，色，坚牢牢蓝RRRR为青青铜色。色。5.5.组织处理理说明明非特异性非特异性酯酶类对固定固定的抵抗性的抵抗性较强，可用，可用醛类固固定液固定后冰定液固定后冰冻切片。切片。10%10%福福尔马林林钙、4%4%多聚甲多聚甲醛磷磷酸酸缓冲液或二甲冲液或二甲胂酸酸盐缓冲冲液，液，pH7.2-7.4;4pH7.2-7.4;4固定固定16-16-1818小小时，时间随随酶活性活性强弱弱不同。不同。19.-醋酸醋酸萘酚酚酯 萘酚酚ASAS乙酸乙酸酯 坚牢牢蓝B B盐 坚牢牢蓝BBBB盐20.B.B.偶氮偶氮吲哚酚法酚法1.1.反反应原理原理在非特异性在非特异性酯酶作用下，作用下，醋酸醋酸吲哚酚酚酯被水解被水解为吲哚酚酚和和醋酸醋酸，吲哚酚与酚与六氮六氮盐偶偶联成成偶氮色素偶氮色素。吲哚酚酚酯吲哚酚酚羧酸酸+六氮六氮盐 偶氮色素偶氮色素21.2.2.孵育液孵育液醋酸醋酸吲哚酚酚 3mg3mg二甲基甲二甲基甲酰胺胺 0.3ml0.3ml六氮化副六氮化副蔷薇苯胺薇苯胺缓冲液冲液10ml10ml（六氮化副六氮化副蔷薇苯胺薇苯胺0.3ml0.3ml溶于溶于0.1mol/L 0.1mol/L PBSPBS pH5-6,pH5-6,用用1mol/L-0.1mol/L 1mol/L-0.1mol/L NaOHNaOH将将pHpH调至至5-5.55-5.5，混匀，混匀过滤立即使用。）立即使用。）22.3.3.操作步操作步骤(1)(1)恒冷箱切片入孵液，恒冷箱切片入孵液，3715-60min3715-60min；(2)(2)蒸蒸馏水洗；水洗；(3)4%(3)4%甲甲醛固定数小固定数小时；(4)(4)甘油明胶封固。甘油明胶封固。4.4.结果果酶活性活性处呈呈红棕色棕色腹水癌腹水癌细胞中的胞中的酯酶23.巨噬巨噬细胞中的胞中的酯酶24.C.吲哚酚法酚法(靛靛蓝法法)Pearse,1972 .原理原理醋酸醋酸吲哚酚酚经酶水解水解释放出放出吲哚酚，再氧化形成靛酚，再氧化形成靛蓝沉着于沉着于酶所在部位。所在部位。底物底物:5-5-溴溴-6-6-氯吲哚酚乙酸酚乙酸酯,5-5-溴溴吲哚酚乙酸酚乙酸酯等等.氧化氧化剂:铁氰化化钾、亚铁氰化化钾25.孵育液孵育液(1)(1)醋酸溴醋酸溴吲哚酚酚酯2mg2mg(2)(2)二甲基甲二甲基甲酰胺胺0.2ml0.2ml(3)(3)储备液液10ml10ml储备液配制：液配制：铁氰化化钾(1.65%)(1.65%)5ml5ml亚铁氰化化钾(2.11%)(2.11%)5ml5ml0.1mol/L Tris-HCL0.1mol/L Tris-HCL缓冲液冲液pH6.8pH6.820ml20ml2%CaCL2%CaCL2 210ml10ml蒸蒸馏水水10ml10ml26.3.3.操作步操作步骤(1)(1)新新鲜组织恒冷箱切片；恒冷箱切片；(2)(2)切片入孵育液，切片入孵育液，3737或室温或室温 5-120min5-120min；(3)(3)蒸蒸馏水洗；水洗；(4)(4)甘油明胶封固。甘油明胶封固。4.4.结果果酶活性部位呈活性部位呈青青绿色色，背底无色。，背底无色。.注意注意铁氰化化钾氧化氧化吲哚酚除酚除产生靛生靛蓝外，外，还有无色有无色产物。物。因此因此酶活性与活性与显色无平行关系，色无平行关系，可定性不可定量。可定性不可定量。27.肾间质细胞胞 油螺卵母油螺卵母细胞胞 底物：底物：5-5-溴溴吲哚酚乙酸酚乙酸酯28.主要定位于主要定位于内内质网网和和溶溶酶体体，生理功能尚不清楚，生理功能尚不清楚,目前目前认为主要参与主要参与酯类和蛋白和蛋白质代代谢。极极强阳性：阳性：胰腺胰腺外分泌部腺外分泌部腺细胞胞，横，横纹肌肌运运动终板板，小小肠 上皮上皮细胞；胞；强阳性：阳性：肝肝细胞，胞，肾近曲小管上皮近曲小管上皮，结肠上皮上皮细胞；胞；阳性：胰腺和腮腺阳性：胰腺和腮腺导管上皮，食管上皮，管上皮，食管上皮，肠腺上皮，肺泡腺上皮，肺泡 巨噬巨噬细胞，睾丸胞，睾丸间质细胞。胞。弱阳性：心肌弱阳性：心肌细胞，胰胞，胰岛细胞，胆管、甲状腺、气管、支胞，胆管、甲状腺、气管、支 气管、膀胱等上皮气管、膀胱等上皮细胞。胞。（二）非特异性（二）非特异性酯酶的生物学意的生物学意义29.特异性酯酶脂酶乙酰胆碱酯酶胆碱酯酶底物高级脂肪酸乙酰胆碱，乙酰-基甲基胆碱乙酰胆碱，苯甲酰胆碱，长链脂肪酸胆碱抑制剂毒扁豆碱异丙基氨基焦酰胺(ISO-OMPA)四异丙基氨基焦酰胺激活剂2.5%牛磺胆酸钠30.广广义的的胆碱胆碱酯酶包括包括乙乙酰胆碱胆碱酯酶（AChE)和狭和狭义的的胆碱胆碱酯酶(ChE)，两者化学性，两者化学性质不同，用不同，用酯来来检测底物特异性底物特异性时，乙乙酰胆碱胆碱酯酶能最快地促使能最快地促使乙乙酰胆碱分解胆碱分解，也能水解乙，也能水解乙酰-基甲基甲基胆碱，但不能水解苯甲基胆碱，但不能水解苯甲酰胆碱，此胆碱，此酶能被能被高高浓度的乙度的乙酰胆碱胆碱抑制抑制。但。但胆碱胆碱酯酶却不同，却不同，乙乙酰胆碱胆碱浓度越高度越高，越能被胆碱，越能被胆碱酯酶所分解。所分解。ChE还能水解苯甲能水解苯甲酰胆碱，但不能水解乙胆碱，但不能水解乙酰-基甲基甲基胆碱。基胆碱。乙乙酰胆碱胆碱+H+H2 2O O 胆碱胆碱+醋酸醋酸酯酰胆碱胆碱+H+H2 2O O 胆碱胆碱+羧酸酸AChEChE四、乙四、乙酰胆碱胆碱酯酶和胆碱和胆碱酯酶(Acetylcholinesterase and Cholinestrase,AChE and ChE)31.乙酰胆碱酯酶胆碱酯酶乙酰胆碱（快）高浓度时抑制其活性高浓度不抑制其活性乙酰-基甲基胆碱苯甲酰胆碱（快）长链脂肪酸胆碱（快）AChE 和和 ChE的底物特异性的底物特异性32.（一）（一）显示方法示方法亚铁氰化化铜法法1 1、反、反应原理原理利用乙利用乙酰胆碱胆碱酯酶能将能将乙乙酰胆碱胆碱盐水解水解产生硫生硫代胆碱，使代胆碱，使铁氰化物化物还原原为亚铁氰化物化物，再与，再与铜离离子子结合形成合形成亚铁氰化化铜显色沉淀，色沉淀，证明明酶活性的存活性的存在。在。乙乙酰胆碱胆碱盐AChE硫代胆碱硫代胆碱若用若用四异丙基焦磷四异丙基焦磷酰胺胺抑制胆碱抑制胆碱酯酶，可，可单独独显示示乙乙酰胆碱胆碱酯酶。铁氰化化钾亚铁氰化化钾+Cu2+亚铁氰化化铜33.、孵育液、孵育液乙乙酰硫代胆碱碘硫代胆碱碘盐5mg5mg0.1mol/L0.1mol/L醋酸醋酸缓冲液冲液pH5.5pH5.56.5ml6.5ml0.1mol/L(2.94%)0.1mol/L(2.94%)柠檬酸檬酸钠0.5ml0.5ml30mmol/L(0.75%)CuSO30mmol/L(0.75%)CuSO4 41.0ml1.0ml5mmol/L(0.164%)5mmol/L(0.164%)铁氰化化钾1.0ml1.0ml 蒸蒸馏水水1.0ml1.0ml乙乙酰胆碱碘胆碱碘盐完全溶解于醋酸完全溶解于醋酸缓冲液后，依次加冲液后，依次加入其它溶液，入其它溶液，临用前不超用前不超过3030分分钟内配制内配制，充分混匀，充分混匀，至溶液呈亮至溶液呈亮绿色，最色，最终pH5.5pH5.5。34.、操作步、操作步骤(1)(1)新新鲜组织恒冷箱切片；恒冷箱切片；(2)(2)冷丙冷丙酮或或10%10%福福尔马林固定林固定20-25min20-25min；(3)(3)蒸蒸馏水洗；水洗；(4)(4)入孵育液入孵育液3737，h h；(5)(5)蒸蒸馏水洗；水洗；(6)(6)甘油明胶封固。甘油明胶封固。35.、结果与果与评价价乙乙酰胆碱胆碱酯酶和胆碱和胆碱酯酶活性部位活性部位显棕色沉淀棕色沉淀。CuCu2+2+浓度太小易弥散，度太小易弥散，pH5-5.5pH5-5.5，高于易，高于易扩散。散。、对照照用用四异丙基焦磷四异丙基焦磷酰胺胺4mM(0.137%)0.2ml4mM(0.137%)0.2ml抑制胆抑制胆碱碱酯酶显示乙示乙酰胆碱胆碱酯酶；用用毒扁豆碱硫酸毒扁豆碱硫酸酯310310-5-5M M代替蒸代替蒸馏水，先将切水，先将切片片处理理3030分，水洗后入孵育液，分，水洗后入孵育液，则二种二种酶均被抑制均被抑制呈呈阴性。阴性。36.(二）生物学意二）生物学意义胆碱胆碱酯酶的活性中心是的活性中心是丝氨酸氨酸。乙。乙酰胆碱胆碱酯酶活性的活性的强弱是弱是神神经细胞性胞性质和功能的重要参考指和功能的重要参考指标，亦是神亦是神经系系统发生生过程中的程中的神神经细胞分化胞分化的一个指的一个指标，所以在形，所以在形态上将乙上将乙酰胆碱胆碱酯酶的的组织化学化学显示示作作为胆碱能胆碱能传递部位的部位的标志。志。AChEAChE是是生物神生物神经传导中的一种关中的一种关键性的性的酶，在，在胆碱能突触胆碱能突触间，该酶降解乙降解乙酰胆碱，胆碱，终止神止神经递质对突触后膜的突触后膜的兴奋作用，保作用，保证神神经信号在生物体内信号在生物体内的正常的正常传递。37.AChEAChE与与细胞凋亡胞凋亡有一定的关系。在有一定的关系。在细胞水平胞水平发现实验所用的各所用的各类细胞，正常状胞，正常状态没有没有AChEAChE活性反活性反应，一旦，一旦发生凋亡，都有生凋亡，都有AChEAChE活性反活性反应。用其特异。用其特异的抑制的抑制剂可以抑制其活性反可以抑制其活性反应。用。用RT-PCRRT-PCR方法方法证明明了凋亡了凋亡细胞有胞有AChEmRNAAChEmRNA的的转录。加入其抑制。加入其抑制剂石杉石杉碱可降低凋亡基因的表达。碱可降低凋亡基因的表达。乙乙酰胆碱胆碱酯酶主要分布于主要分布于神神经系系统（大（大脑皮皮质中有中有AChEAChE阳性的神阳性的神经纤维，还存在于胆碱能神存在于胆碱能神经元元中）中）、神、神经肌肉接肌肉接头处、红细胞胞等，而等，而胆碱胆碱酯酶主主要分布于要分布于血清血清、胰腺胰腺、唾液腺内唾液腺内。38.五、胆碱乙五、胆碱乙酰转移移酶(choline acetyltransferase,ChAc)此此酶不属于不属于羧酸酸酯水解水解酶，它是，它是乙乙酰胆碱的合成胆碱的合成酶。胆碱乙。胆碱乙酰转移移酶的的强弱是弱是胆碱能神胆碱能神经生理功能的生理功能的标志，因此将志，因此将ChACChAC确确认为胆碱能神胆碱能神经的的标志志酶。39.（一）（一）显示方法示方法BurtBurt法法1 1、反、反应原理原理 胆胆碱碱乙乙酰转移移酶可可把把乙乙酰胆胆碱碱辅酶A A的的乙乙酰基基转移移到到胆胆碱碱分分子子上上,合合成成乙乙酰胆胆碱碱。辅酶A A被被游游离离出出来来，辅酶A A中的中的SHSH被被铅离子沉淀而离子沉淀而显示示酶的活性。的活性。乙乙酰辅酶A+A+胆碱胆碱 乙乙酰胆碱胆碱+辅酶A A Pb Pb2+2+沉淀沉淀产物物 PbSPbS 硫化硫化铵ChAc40.2 2、孵育液、孵育液25mmol/L N-2-羟基乙基基乙基哌嗪-N-2-乙乙烷磺酸磺酸缓冲冲 液液（HEPES）pH6.04mmol/L 胆碱胆碱（48.5mg/100ml缓冲液）冲液）0.2mmol/L 乙乙酰胆碱胆碱辅酶A（16.2mg/100ml缓冲液）冲液）18mmol/L 硝酸硝酸铅（59.6mg/100ml缓冲液）冲液）0.1mmol/L Phospholine iodide(乙乙酰胆碱胆碱酯酶抑抑 制制剂）（）（3.8mg/100 ml缓冲液）冲液）最最终pH值为6.0。41.3 3、操作步、操作步骤（1）固固定定：8m厚厚的的冰冰冻切切片片在在10%蔗蔗糖糖和和2%戊戊二二醛的的25mmol/LHEPES缓冲冲液液（pH7.0）中中固固定定5min；（2）漂漂 洗洗：用用 含含 10%蔗蔗 糖糖 的的 HEPES缓 冲冲 液液 洗洗15min3；（3）孵孵育育：切切片片入入孵孵育育液液中中，室室温温，3h；（30，15-30min）；）；（4）蒸）蒸馏水洗水洗3次；次；（5）1%硫化硫化铵显色色2min；（6）缓冲液漂洗，甘油明胶封固。冲液漂洗，甘油明胶封固。42.4 4、结果：果：酶活性部位呈黑色沉淀。活性部位呈黑色沉淀。5 5、对照：照：（1 1）孵育液中可除去）孵育液中可除去辅酶A A；（2 2）孵育液中去除胆碱，反）孵育液中去除胆碱，反应结果果为阴性。阴性。（二）生物学意（二）生物学意义 ChAcChAc是是胆碱能神胆碱能神经元的元的标志志酶，是乙，是乙酰胆碱的合胆碱的合成成酶，分布在，分布在胆碱能神胆碱能神经元和元和纤维内内，其含量的多少，其含量的多少，可可说明明神神经兴奋性的高低性的高低，能充分反映神，能充分反映神经的功能。的功能。是了解胆碱能神是了解胆碱能神经元及其所支配器官的重要指元及其所支配器官的重要指标。AChEAChE是乙是乙酰胆碱的水解胆碱的水解酶，其特性没有，其特性没有ChAcChAc高，两高，两酶相相结合作合作观察指察指标最最为理想。理想。43.六、脂六、脂酶(Lipase)(Lipase)脂脂酶又名甘油又名甘油酯水解水解酶，能催化，能催化长链脂肪酸甘油脂肪酸甘油酯或其它或其它醇醇酯水解。水解。激活激活剂：CaCa2+2+、SrSr2+2+、MgMg2+2+、半胱氨酸、半胱氨酸、巯基乙酸、牛磺胆基乙酸、牛磺胆酸酸盐。（一）（一）显示方法示方法硫化硫化铅法（吐温法之一，法（吐温法之一，Gomori,1954)Gomori,1954)、基本原理、基本原理以以长链脂肪酸脂肪酸酯为底物，在脂底物，在脂酶作用下，分离出的脂肪酸作用下，分离出的脂肪酸可与可与钙形成形成钙皂沉淀，再用皂沉淀，再用铅置置换钙，最后，最后经硫化胺置硫化胺置换生成生成棕黑色硫化棕黑色硫化铅沉淀。沉淀。吐温吐温脂脂酶脂肪酸脂肪酸+Ca2+钙皂皂铅置置换钙硫化胺硫化胺PbS44.、孵育液、孵育液5%5%吐温吐温6060或或8080硬脂酸硬脂酸酯（油酸（油酸酯）2ml2ml0.2mol/L Tris0.2mol/L Tris缓冲液冲液(pH7.2-7.4)(pH7.2-7.4)5ml5ml10%10%氯化化钙2ml2ml蒸蒸馏水水40ml40ml45.、操作步、操作步骤(1)(1)恒冷箱切片；恒冷箱切片；(2)(2)入孵育液，入孵育液，37,37,小小时；(3)1%CaCL(3)1%CaCL液内浸洗，使液内浸洗，使钙皂不溶；皂不溶；(4)1%Pb(NO(4)1%Pb(NO3 3)2 2浸浸15min15min，（置（置换）；）；(5)(5)流水冲洗流水冲洗5 5分；分；(6)0.5-1%(6)0.5-1%硫化胺液内硫化胺液内minmin，（显色）色）；(7)(7)水洗分；水洗分；(8)(8)甘油明胶封片。甘油明胶封片。46.、结果与果与评价价棕黑色棕黑色硫化硫化铅沉淀沉淀为脂脂酶活性所在部位。活性所在部位。本法需本法需保持保持CaCa2+2+浓度度，才有利于在，才有利于在Pb(NOPb(NO3 3)2 2液内液内进行充分置行充分置换反反应。孵化。孵化时间过长，易，易弥散。弥散。、对照照去出吐温去出吐温6060（底物）（底物）为阴性阴性47.（二）生物学意（二）生物学意义 脂脂酶在在体体内内主主要要催催化化甘甘油油三三酯水水解解，使使之之成成为二二酰甘甘油油和和脂脂肪肪酸酸，甘甘油油三三酯必必须在在脂脂酶将将它它分分解解成成甘甘油油和和脂脂肪肪酸酸后后，才才能能被被肠道道吸吸收收。脂脂肪肪细胞胞也也需需要脂要脂酶水解脂肪，以保水解脂肪，以保证脂肪的外运。脂肪的外运。脂脂酶的定位和的定位和组织分布：分布：脂脂酶主要存在于胞主要存在于胞质的基的基质，高，高尔基复合体和基复合体和线粒体也可出粒体也可出现阳性反阳性反应。胰腺胰腺最最为丰富，其次是丰富，其次是肝肝脏、肾脏、脾、脾脏、唾液腺唾液腺导管管（但大鼠极少）、胃（但大鼠极少）、胃贲门、睾丸基、睾丸基质细胞中也胞中也存在。存在。48.Oxidase and DehydrogenaseOxidase and Dehydrogenase49.一、氧化一、氧化还反反应1.1.生物体内的氧化方式生物体内的氧化方式(1)(1)脱脱电子反子反应：从底物上脱落一个从底物上脱落一个电子。子。Fe Fe 2+2+Fe Fe 3+3+e+e(2)(2)脱脱氢反反应：从底物上脱落一从底物上脱落一对氢原子。原子。MHMH2 2 M+2H(2H M+2H(2H+2e)+2e)(3)(3)加氧反加氧反应：向底物中直接加入氧原子或氧分子。向底物中直接加入氧原子或氧分子。催化上述反催化上述反应的的酶，称，称氧化氧化还原原酶。受受电子体、受子体、受氢体与供体与供电子体、供子体、供氢体体50.氧化反氧化反应：分解代分解代谢中失中失电子、脱子、脱氢、加氧。、加氧。还原反原反应：合成代合成代谢中得中得电子、加子、加氢、脱氧。、脱氧。还原原剂：供供电子体子体FeFe2+2+(亚铁离子）。离子）。氧化氧化剂：受受电子体（或受子体（或受氢体体)Fe)Fe3+3+(高高铁离子）。离子）。51.根据根据受受氢体的不同体的不同，氧化，氧化还原原酶分分为：氧化氧化酶：催化：催化氢原子直接原子直接转移到移到氧分子氧分子上。上。脱脱氢酶：催化：催化氢原子原子转移到移到其它受其它受氢体上体上，催，催化氧化化氧化过程的中程的中间环节。52.常常见的受的受氢体有：体有：辅酶（NADNAD+，nicotinamide adenine nicotinamide adenine dinucleotide,dinucleotide,尼克尼克酰胺腺胺腺嘌呤二核苷酸）；呤二核苷酸）；辅酶（NADPNADP+,nicotinamide adenine,nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,dinucleotide phosphate,尼克尼克酰胺腺胺腺嘌呤呤二核苷酸磷酸）；二核苷酸磷酸）；黄素腺黄素腺嘌呤二核苷酸呤二核苷酸(FADFAD,Flavin-,Flavin-adenine dinucleotide)adenine dinucleotide)53.2.2.电子子传递链营养物养物质在在线粒体内粒体内经三三羧酸循酸循环、脂肪酸氧化、脂肪酸氧化等不同氧化分解途径，等不同氧化分解途径，脱脱氢氧化氧化。脱下的。脱下的氢大多由大多由NADNAD+、NADPNADP+、FADFAD接受，接受，NADNAD+、FADFAD是常是常见脱脱氢酶的的辅酶或或辅基。基。这些些脱脱氢酶是是连接代接代谢途径和途径和电子子传递链的的环节。代。代谢物脱下一物脱下一对氢，分，分别以以NADH+HNADH+H+或或FADHFADH2 2进入入电子子传递链，最，最终与与氧氧结合生成水合生成水，并，并释放能量。放能量。电子子只能从只能从电子子亲和力和力低低的的传递体向体向亲和力和力高高的的传递体体传递。54.55.二、二、细胞色素氧化胞色素氧化酶(Cytochrome Oxidase,CCO)细胞色素胞色素(Cytochrome,cyt)是生物是生物细胞内一胞内一类传递蛋白蛋白质，含有，含有铁呋啉啉辅基，具有基，具有红色而取名色而取名细胞胞色素。色素。电子子传递链中有中有5种不同种不同细胞色素：胞色素：b、c、c1、a、a3，b、c、c1的的辅基都含基都含铁原原呋呤（血呤（血红素）素），铁原子与原子与呋呤呤环和蛋白和蛋白质形成六个配位形成六个配位键，不能，不能再与氧再与氧结合。合。56.细胞色素胞色素是一种水溶性的是一种水溶性的膜表面蛋白膜表面蛋白，还原性原性的的细胞色素把它的胞色素把它的电子子传递给细胞色素氧化胞色素氧化酶CytaaCytaa3 3，细胞色素胞色素a a和和a a3 3结合合紧密，一般分离方法不密，一般分离方法不能将它能将它们分开，形成一个大分子寡聚体，通常称分开，形成一个大分子寡聚体，通常称为细胞色素胞色素aaaa3 3,FeFe与与呋呤呤环和蛋白和蛋白质形成五个配位形成五个配位键，还保留一个配位保留一个配位键和和O O2 2、COCO和和CNCN-（氰基）基）结合，合，是是电子子传递链中中能与氧能与氧进行反行反应的复合物，能催化的复合物，能催化分子分子氧接受氧接受电子而被子而被还原原，称，称细胞色素氧化胞色素氧化酶或或细胞色素氧化胞色素氧化酶。细胞色素氧化胞色素氧化酶使使还原的原的细胞色素再氧化，是胞色素再氧化，是线粒体的粒体的结构成分之一。构成分之一。57.（一）（一）显示方法示方法1、Nadi氧化氧化酶反反应（Naphthol-diamine,萘酚二胺）酚二胺）（1）反）反应原理原理O258.（2 2）孵育液）孵育液 N-N-苯基苯基-对苯二胺苯二胺 （底物）（底物）3mg 3mg 1-1-羟基基-2-2-萘酚酚 3mg3mg 二甲基二甲基亚砜 0.1ml0.1ml0.05mol/L0.05mol/L磷酸磷酸缓冲液冲液pH7.2 10mlpH7.2 10ml混匀，混匀，过滤。59.（3 3）操作步）操作步骤：1 1）新）新鲜组织，恒冷箱切片；，恒冷箱切片；2 2）入孵育液中，室温，）入孵育液中，室温，202030min30min；3 3）入）入LugolLugol碘液碘液2min2min；（稳定有色定有色产物）物）4 4）入）入5%5%硫代硫酸硫代硫酸钠溶液溶液4min4min；（脱碘）（脱碘）5 5）入）入1%1%醋酸醋酸钴液中液中60min60min；（有色（有色产物螯合）物螯合）6 6）D.WD.W洗；洗；7 7）甘油明胶封固。）甘油明胶封固。60.（4 4）结果：果：酶活性部位呈棕黑色活性部位呈棕黑色颗粒。粒。（5 5）对照：照：标本孵育于含本孵育于含氰化化钾（0.0065g/10ml)0.0065g/10ml)的孵育液中，呈阴性反的孵育液中，呈阴性反应。61.2.二氨基二氨基联苯胺法苯胺法（DAB法法,diaminobenzidine）1、原理、原理细胞色素氧化胞色素氧化酶（CCO）能催化）能催化DAB，被，被H2O2氧化，在新氧化，在新鲜或固定或固定标本上生成本上生成棕色沉淀。棕色沉淀。DAB盐酸酸盐溶于水后无色透明，但由于溶于水后无色透明，但由于CCO的的作用，作用，侧链氨基被氧化氨基被氧化，进行反复行反复氧化性聚合氧化性聚合和和氧氧化性化性环化化，形成不溶性，形成不溶性褐色吩褐色吩嗪(phenazine)聚合体。聚合体。62.(2)(2)孵育液孵育液 蒸蒸馏水水 5ml5ml 3,3 3,3-二氨基二氨基联苯胺苯胺-4-4盐酸酸盐 5mg5mg 0.2mol/L 0.2mol/L磷酸磷酸缓冲液（冲液（pH7.4)5mlpH7.4)5ml 过氧化氧化氢酶 c-100 1mgc-100 1mg 或或 c-40 4mgc-40 4mg 细胞色素胞色素C IIIC III型型 10mg10mg 或或 IV 5mg IV 5mg 63.（3 3）操作步）操作步骤：1 1）组织块浸泡固定：戊二浸泡固定：戊二醛固定液（固定液（3%3%戊戊二二醛，0.1mol/L PB pH7.4,0.05%CaCl0.1mol/L PB pH7.4,0.05%CaCl2 2，二甲砷二甲砷酸酸盐缓冲液），冲液），44，10min;10min;2 2）洗）洗涤：冷固定液：冷固定液15min15min，3 3次；次；3 3）恒冷箱切片；）恒冷箱切片；4 4）孵育：）孵育：37 37，40-60min40-60min，充分洗，充分洗涤；5 5）复染；）复染；6 6）封片。）封片。64.（4 4）结果果 酶活性部位呈活性部位呈茶褐色茶褐色沉淀，沉淀，细胞内胞内线粒体数粒体数目多者目多者酶活性活性强。（5 5）对照照 孵育液内加孵育液内加1mM K-CN1mM K-CN或或10mM NaN10mM NaN3 3，反，反应完全完全呈阴性呈阴性。抑制。抑制剂为氰化物、迭氮化化物、迭氮化钠（NaNNaN3 3）、）、硫化硫化氢（H H2 2S S）、一氧化碳，原因是）、一氧化碳，原因是这些物些物质均能均能与与细胞色素氧化胞色素氧化酶的三价的三价铁结合而抑制合而抑制酶活性。活性。从反从反应液中液中去掉底物去掉底物DABDAB不能成不能成为对照照，因，因为DABDAB同同时也是成色也是成色剂。65.DAB DAB将氧化型将氧化型细胞色素胞色素还原，原，还原型原型细胞胞色素又被色素又被细胞色素胞色素a a再氧化，反复循再氧化，反复循环进行，行，DABDAB不断被氧化，反不断被氧化，反应氧化物沉淀沉氧化物沉淀沉积。此法从反此法从反应特异性、重复性和特异性、重复性和电镜应用等用等方面最好，用得最普遍。方面最好，用得最普遍。DABDAB法是研究法是研究代代谢旺盛旺盛细胞胞线粒体粒体的有效手的有效手段。段。66.骨骼肌骨骼肌DAB法法显示示CCO67.肾皮皮质肾髓髓质68.（二）生物学意（二）生物学意义 几乎所有几乎所有组织细胞都呈阳性反胞都呈阳性反应，其，其强度取度取决于决于细胞内的胞内的线粒体数目粒体数目，是，是线粒体的粒体的标志志酶之之一一。是研究代。是研究代谢旺盛旺盛细胞胞线粒体的有效手段。粒体的有效手段。心心肌、肌、肾小管上皮、胃壁小管上皮、胃壁细胞、肝胞、肝细胞胞活性均活性均较高，高，恶性性肿瘤瘤和癌前期和癌前期酶活性有增高活性有增高趋势。69.三、三、DOPA氧化氧化酶(Catechol Oxidase)也称儿茶酚氧化也称儿茶酚氧化酶，酪氨酸，酪氨酸酶。1、反、反应原理原理以以DOPA(dihydroxyphenylalanine,二二羟苯基苯基丙氨酸）丙氨酸）为底物，氧化后底物，氧化后经一系列复一系列复杂反反应生生成黑色成黑色产物。物。2、孵育液孵育液5.6mmon/L二二羟苯基丙氨酸，溶于苯基丙氨酸，溶于0.1mol/L磷磷酸酸缓冲液中，冲液中，pH7.4。70.3.3.操作步操作步骤(1)(1)新新鲜组织，厚，厚5mm,10%5mm,10%福福尔马林室温固定林室温固定1h;1h;(2)(2)流水冲流水冲3 3分；分；(3)(3)入孵育液，入孵育液，371h;371h;(4)(4)换孵育液，孵育液，3712-15h;3712-15h;(5)(5)流水冲洗；流水冲洗；(6)Bouin(6)Bouin液固定液固定24h;24h;(7)(7)酒精脱水，透明，石蜡包埋；酒精脱水，透明，石蜡包埋；(8)(8)切片切片6-86-8微米，可复染；微米，可复染；(9)(9)树胶封片。胶封片。71.4.4.结果果酶活性部位呈活性部位呈黑棕色黑棕色颗粒粒。5.5.对照照去底物或用去底物或用氰化物化物6.6.生物学意生物学意义对诊断断恶性黑素瘤有意性黑素瘤有意义。72.四、四、单胺氧化胺氧化酶(Monoamine Oxidase,MAO)又称又称肾上腺素氧化上腺素氧化酶，酪胺，酪胺酶。1、反、反应原理原理 MAO是催化是催化芳香族、脂肪族芳香族、脂肪族单胺胺类氧化脱氨基氧化脱氨基的的酶，属黄素，属黄素酶，以，以FAD为辅基。反基。反应产物有物有醛和和H2O2。利用它利用它们的的还原性或氧化性原性或氧化性进行行组化染色。化染色。73.反反应产物有物有醛和和H H2 2O O2 2，利用，利用醛的的还原性和原性和H H2 2O O2 2的氧化性的氧化性进行行组化染色。化染色。(1)(1)醛还原作用原作用氧化氧化氧化氧化还原原74.(2)H(2)H2 2O O2 2的氧化作用的氧化作用利用利用产生的生的H H2 2O O2 2经辣根辣根过氧化物氧化物酶(HRP)(HRP)催化，将催化，将芳香胺氧化芳香胺氧化显色。色。HRP75.2.2.孵育液孵育液四四唑盐法法盐酸色胺（底物）酸色胺（底物）25mg25mg 无水硫酸无水硫酸钠 4mg4mg NBT NBT（四（四唑盐）4mg4mg 0.1mol/LPBS(pH7.6)0.1mol/LPBS(pH7.6)5ml5ml 蒸蒸馏水水15ml15ml3.3.操作步操作步骤(1)(1)新新鲜冰冰冻切片；切片；(2)(2)入孵育液，入孵育液，37 30-60min37 30-60min；(3)(3)流水冲洗流水冲洗2min2min；(4)4%(4)4%多聚甲多聚甲醛固定固定24h;24h;(5)(5)洗洗涤，脱水，甘油明胶封片。，脱水，甘油明胶封片。76.4.4.结果果酶反反应阳性部位阳性部位见蓝色或紫色甲簪色或紫色甲簪颗粒。粒。5.5.对照照去色胺底物。去色胺底物。6.6.生物学意生物学意义：(1)(1)含生物活性胺含生物活性胺组织：