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实验研究 福建中医药 2023 年 4 月 第 54 卷 第 4 期Fujian Journal of TCM April 2023，54（4）复方熊胆茵陈颗粒对代谢相关脂肪性肝病大鼠HPA轴相关激素影响的研究王春桔1，伍娟1*，楼莹1，杨眉峰1，刘赟1，吴玲2（1.福建中医药大学临床技能教学中心，福建 福州 350122；2.福建中医药大学护理学院，福建 福州 350122）摘要：目的 研究复方熊胆茵陈颗粒（ACF）对代谢相关脂肪性肝病（MAFLD）大鼠HPA轴相关激素的影响。方法 将51只SD大鼠随机分为模型组11只，正常组、低剂量组、中剂量和高剂量组各10只，正常组给予基础饲料、模型组与各剂量组给予高脂饲料喂养 6周。造模成功后，低、中、高剂量组按体质量 1 mL/100 g分别予4.73、9.46、18.92 g/L复方熊胆茵陈颗粒药液灌胃，正常组和模型组给予2 mL生理盐水灌胃，共4周。取肝脏行HE染色观察5组大鼠肝组织病理变化，取血清检测5组大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、皮质醇（CORT）水平，qPCR检测5组大鼠肝组织中CRH、ACTH、CORT mRNA相对表达水平，免疫组化检测5组大鼠肝组织中CRH、ACTH、CORT蛋白相对表达水平。结果 与正常组比较，模型组大鼠肝索排列紊乱，脂肪空泡满视野，累及肝小叶大于50，符合脂肪性肝病病理+级；与模型组比较，各剂量组大鼠肝细胞的脂肪空泡减少，肝索排列整齐，肝小叶清晰可见。与正常组比较，模型组血清ALT、AST、CRH、ACTH、CORT均显著升高（P均0.01）；与模型组比较，各剂量组大鼠血清ALT、AST、ACTH、CORT均显著降低（P均0.01），中、高剂量组大鼠血清CRH均显著降低（P0.05或 P0.01）。与正常组比较，模型组大鼠肝脏 CRH、ACTH、CORT mRNA 相对表达水平均显著升高（P均0.01）；与模型组比较，低、中、高剂量组大鼠肝脏CRH、ACTH、CORT mRNA相对表达水平均显著降低（P0.05或0.01）。与正常组比较，模型组大鼠肝脏CRH、ACTH、CORT蛋白相对表达水平均显著升高（P均0.05）；与模型组比较，各剂量组大鼠肝脏CRH、ACTH、CORT蛋白相对表达水平均显著降低（P均0.05）。结论 ACF能够改善MAFLD大鼠肝组织损伤，减少MAFLD大鼠血清及肝组织中CRH、ACTH、CORT的分泌，提示ACF治疗MAFLD的作用机制可能与改善下丘脑-垂体-肾上腺轴功能紊乱有关。关键词：代谢相关脂肪性肝病；复方熊胆茵陈颗粒；促肾上腺皮质激素释放激素、促肾上腺皮质激素、皮质醇随着人们生活水平的提高、生活习惯和饮食结构的改变，代谢相关脂肪性肝病（metabolic asso-ciated fatty liver disease，MAFLD）发病率呈逐年上升趋势，已成为我国第一大慢性肝病。流行病学调查显示已成为全球常见的慢性肝脏疾病之一，全球患病率在 25%左右，我国患病率高达15%以上1。复方熊胆茵陈颗粒（artemisia capillaris formula，ACF）为福建中医药大学阮时宝教授经典方，是福建中医药大学附属第二人民医院院内制剂（批准文号：闽药制Z20110007）。方中含有熊胆粉、茵陈、山楂、泽泻、白术、柴胡、甘草等中药，具有清肝利湿、疏肝健脾的功效。课题组前期的动物实验证实：ACF能明显改善MAFLD模型大鼠的肝脏脂肪变性和脂滴聚集情况，可通过调控脂代谢关键酶的表达调节脂质代谢，降低肝脏脂肪含量，达到降血脂及治疗脂肪肝的目的2-5。下丘脑-垂体-肾上腺轴（hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA）是反应机体应激状态的中枢神经系统，是大脑与肠道之间由神经-内分泌介导的双向应答系统。HPA 轴相关激素促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、皮质醇（CORT）的表达影响肠道屏障功能以及肠道微生物组成和丰度6-8。肠道菌群与MAFLD 的发生、发展密切相关。MAFLD 患者 HPA轴过度激活程度与肝组织病理改变密切相关9。本研究旨在观察ACF对MAFLD大鼠HPA轴相关激素的影响，以进一步明确 ACF 治疗 MAFLD 的作用机制。1实验材料1.1实验动物SPF 级 SD 大鼠 51 只，雄性，体质量（20020）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（浙）2019-0002，在福建中医药大学动物实验中心 SPF 级动物实验室适应性喂养1周，实验动物许可证号：SCXK（沪2017-0005）。1.2实验药物制备ACF由福建中医药大学附属第二人民医院药剂科制备，采用水提醇沉法制备浸膏，加入75%辅料制得，每克相当于生药1.314 g。1.3实验仪器超微量分光光度计（美国 Thermo Fisher Scientific公司，型号：NanoDrop2000）；标准试剂型纯水仪（青岛富勒姆科技有限公司，型号：FBZ2001-up-p）；荧光定量 PCR 仪（美国 ABI公司，型号：Stepone plus）；包埋机（武汉俊杰电子有限公司，型号：JB-P5）；病理切片机（上海徕卡仪器有限公司，型号：RM2016）。收稿日期：2022-12-15基金项目：福建省自然科学基金项目（2019J01364）通信作者：伍娟，E-mail：DOI：10.13260/ki.jfjtcm.2023.0400513福建中医药第 54 卷1.4实验试剂10%水合氯醛（永华化学科技有限公司，批号：20181101）；4%多聚甲醛（广州赛国生物科技有限公司，批号：1800122）；苏木素-伊红染色液（批号：180634）、乙二胺四乙酸（批号：G1206）、HRP标记山羊抗兔二抗（批号：GB23303）、免疫组化试剂盒 DAB 显色剂（批号：G1211）、RNA提取液（货号：G3013）、目的基因引物 DNA 均购自赛维尔生物科技有限公司；一抗 CORT（北京博奥森生物技术有限公司，批号：bs-14001R）；一抗ACTH（英国 Abcam 公司，批号：Ab74976）；一抗CRH（上海泊湾生物科技有限公司，批号：AY1786）；cDNA合成试剂盒（美国Thermo公司，货号：#K1622）。2实验方法2.1动物造模、分组及给药取雄性SD大鼠51只，体质量（20020）g，随机分为模型组 11 只和正常组、低剂量组、中剂量组、高剂量组各10只，造模前均适应性饲养1周。正常组给予基础饲料、模型组与各剂量组给予高脂饲料（每 100 g饲料中含有猪油 10%，胆固醇 2%，基础饲料 88%）喂养 6 周。于6 周末随机抽取模型组大鼠 1 只，摘取肝脏，采用HE 染色观察肝脏病理改变，当脂肪性病变肝细胞超过肝小叶 1/3 时提示大鼠 MAFLD 模型造模成功。造模成功后，低、中、高剂量组按1 mL/100 g体质量分别予 4.73、9.46、18.92 g/L ACF药液灌胃，正常组和模型组予生理盐水2 mL灌胃，5组均于上午910时灌胃，每日1次，连续4周。2.2取材取材前一晚禁食，取材当天称重后按0.5 mL/100 g体质量腹腔注射 20%乌拉坦麻醉，迅速开腹，腹主动脉取血。将血液收集在普通采血管内，离心后取其血清，保存于-20冰箱中备用，用于检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、CRH、ACTH、CORT；迅速分离整个肝脏后用无菌生理盐水轻轻漂洗，取右叶肝组织切成约 1 cm1 cm1 cm 大小，以 4%多聚甲醛溶液固定后流水冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋制成肝组织标本用作病理观察；其余肝组织置于-80 冰箱保存用于qPCR和免疫组化检测。2.3观察指标2.3.1肝组织病理学形态将肝组织石蜡标本切片（厚度为4 m），采用HE染色，中性树脂封片，光镜下观察肝组织病理学形态。2.3.2血清 AST、ALT、CRH、ACTH、CORT 水平测定采用速率法检测血清中 AST、ALT 水平，采用ELISA法检测CRH、ACTH、CORT含量。2.3.3 qPCR 检 测 肝 组 织 中 CRH、ACTH、CORT mRNA相对表达水平提取总 RNA：TRIzol 法提取总RNA，使用Nanodrop 2000检测RNA浓度及纯度。Primer 6.0 软件设计 CRH、ACTH 的引物（引物序列见表 1），依次加入 4 L 5Reaction Buffer、2 L 10 mmol/L dNTP Mix、1 L RiboLock RNAase 抑制剂（20 U/L）和 1 L RevertAiM-MuLV 逆转录酶（200 U/L），用枪抽吸混匀，于PCR仪上42 保温60 min，结束后 70 保温 5 min 灭活反转录酶。以-actin 为内参照基因，SYBRGreen 实时荧光定量PCR 扩增，扩增体系 20 L。反应条件：95 预变性10 min，40个循环95 变性15 s，60 退火60 s），每 15 s 升温 0.3，具体步骤参见试剂盒说明书。以目的基因相对表达水平作为判断标准，采用2-Ct的方法计算 CRH、ACTH、CORT mRNA相对表达水平。2.3.4免疫组化检测肝组织中 CRH、ACTH、CORT蛋白相对表达水平取大鼠肝组织，依次经 4%多聚甲醛固定、脱水、包埋、切片（厚度8 m），制备成石蜡切片，将石蜡切片脱蜡复水，柠檬酸钠溶液抗原修复，5%BSA 封闭，一抗（CRH 1 200；ACTH 1 200；CORT 1 200）4 孵育过夜，二抗孵育，DAB显色，苏木素复染，脱水封片，于显微镜下观察拍照。采用 Image pro plus 软件分析 5 组照片的平均光密度值并计算蛋白相对表达水平。2.4统计学方法应用SPSS 23.0统计软件进行数据处理。计量资料符合正态分布以（x s）表示，2组比较采用 t检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。P0.05表示差异具有统计学意义。3结果3.15 组大鼠肝组织病理学形态正常组肝小叶结构正常，肝索排列整齐，肝细胞为多边形，细胞边表1引物序列基因名称-actinCRHACTHCORT引物序列正向：5-TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG-3反向：5-GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3正向：5-CCGCTACAACACGACAAACAA-3反向：5-GTAGGATGAAAGCCGAGATGAGG-3正向：5-CAGGACCTCACCACGGAAAG-3反向：5-TCAGTCAAGGGCTGTTCATCTC-3正向：5-TAAGCGGCAGGAAAGACCAC-3反向：5-ACTTGCACGAGGAGAAGGTTT-3引物长度/bp24026611395退火温度/6060606014王春桔 等：复方熊胆茵陈颗粒对代谢相关脂肪性肝病大鼠HPA轴相关激素影响的研究第 4 期界清晰，细胞核明显，未见肝细胞变性、炎性浸润及肝脏组织坏死；模型组肝组织损伤严重，大部分肝小叶结构破坏严重，肝索排列紊乱，大量细胞空泡，图1黑箭头所示处肝细胞胞质肿胀明显，呈气球样变及空泡变性，出现脂肪性肝病病变；低剂量组肝细胞呈放射状排列，细胞核基本清晰，胞质肿胀、空泡变性减少；中剂量组肝细胞呈放射状排列，细胞核位置、形态正常，细胞肿胀减轻，散在少量气球样变及空泡；高剂量组肝索排列整齐，明显改善了肝细胞气球样变和空泡变性。见图1。3.25组大鼠血清ALT、AST、CRH、ACTH、CORT水平比较见表2。3.35 组大鼠肝组织 CRH、ACTH、CORT mRNA 相对表达水平比较见表3。3.45 组大鼠肝组织 CRH、ACTH、CORT 蛋白相对表达水平比较见表4。4讨论中医学认为脂肪肝的病因病机主要为饮食失节、情志内伤、肝脾不调等。脂肪肝发病表现为气血津液代谢障碍，符合肝失疏泄的特点，气滞、痰湿、血瘀分别在脂肪肝不同阶段发病中起着关键的作用10。脂肪肝的治疗以化湿清热、疏肝理气、健脾化痰、活血化瘀、补肾益精等法为主，并根据病证虚实、寒热、阴阳等辨证加减用药。近年来对于肝实质及其相关证候的研究发现：肝主疏泄的功能与神经、下丘脑以及内分泌免疫网络的调节功能有着十分密切的关系11-13。HPA轴是反应机体应激状态的中枢神经系统，与大脑的情感认知和外周器官的功能密切相关。MAFLD 患者HPA 轴过度激活且激活程度与肝组织病理改变密切相关，应激激素可以直接诱导非酒精性脂肪肝的发病，导致肝脏出现实质性损伤。CRH、ACTH、CORT的高表达可以通过影响脂质代谢与转运，加剧胰岛素抵抗程度，进而加重非酒精性脂肪肝的病变9-10。因此，研究HPA轴相关激素失调诱发或加重MAFLD的可能机制，或许能进一步阐明 MAFLD的发病机制，为临床治疗奠定实验基础。本实验结果显示：模型组大鼠 CRH、ACTH、CORT表达升高，表明HPA轴过度激活，通过影响脂质代谢与转运、胰岛素抵抗等诱导模型组大鼠肝脏表25组大鼠血清 AST、ALT、CRH、ACTH、CORT水平比较（x s）组 别正常组模型组低剂量组中剂量组高剂量组n1010101010ALT/（U/L）27.703.9251.534.821）46.036.042）36.785.192）31.023.532）AST/（U/L）149.2712.35246.5943.971）213.1118.202）183.1212.342）160.1522.762）CRH/（ng/mL）9.600.2610.080.351）9.810.469.670.383）9.630.242）ACTH/（pg/mL）57.261.7782.275.921）66.554.392）60.005.582）4）59.554.502）5）CORT/（ng/mL）11.811.1517.802.061）14.094.872）14.362.142）15.793.402）注：与正常组比较，1）P0.01；与模型组比较，2）P0.05，3）P0.01；与低剂量组比较，4）P0.05；与中剂量组比较，5）P0.05。注：A 正常组；B 模型组；C 低剂量组；D 中剂量组；E 高剂量组。图 1 5组大鼠肝组织 HE 染色图（400）表35组大鼠肝脏 CRH、ACTH、CORT mRNA 相对表达水平比较（x s）组 别正常组模型组低剂量组中剂量组高剂量组n1010101010CRH1.190.202.250.411）1.760.072）1.640.293）1.390.143）ACTH1.160.162.110.271）1.640.202）1.580.183）1.320.193）CORT0.690.231.390.261）0.940.172）0.890.102）0.800.192）注：与正常组比较，1）P0.01；与模型组比较，2）P0.01，3）P0.05。表45组大鼠肝脏 CRH、ACTH、CORT 蛋白相对表达水平比较（x s）组 别正常组模型组低剂量组中剂量组高剂量组n1010101010CRH0.340.040.730.061）0.500.052）0.420.052）0.360.072）3）ACTH0.300.090.710.041）0.450.092）0.400.102）0.310.082）CORT0.170.030.390.051）0.210.012）0.200.032）0.190.052）注：与正常组比较，1）P0.05；与模型组比较，2）P0.05；与低剂量组比较，3）P0.05。15福建中医药第 54 卷出现脂肪性病变；给予 ACF 干预后，CRH、ACTH、CORT表达降低，说明ACF能抑制HPA轴的过度激活，进而治疗MAFLD。综上所述，ACF可通过抑制HPA轴过度激活，降低HPA轴相关激素表达来治疗MAFLD大鼠肝损伤。但 MAFLD 的发病原因复杂，仍需进一步研究来阐明其作用机理。参考文献1中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组，中国医师协会脂肪性肝病专家委员会.非酒精性脂肪性肝病防治指南（2018更新版）J.中华肝脏病杂志，2018，26（3）：195-203.2阙金花，黄鸣清，郑海音，等.复方熊胆茵陈颗粒的保肝、降血脂、抗脂肪肝药效学研究 J.中国医院药学杂志，2015，35（19）：1736-1740.3刘艳，洪振丰，施文荣，等.复方熊胆茵陈颗粒对高脂模型大鼠肝脂肪含量及脂酶活性的影响 J.福建中医药大学学报，2013，23（3）：21-22.4LIU L，ZHAO J，LI Y，et al.Artemisia capillaris formula inhibits hepatic steatosis via an miR-122-induced decrease in fatty acid synthase expression in vivo and in vitro J.Mol Med Rep，2016，13（6）：4751-4758.5伍娟，赵锦燕，洪振丰，等.复方熊胆茵陈颗粒对非酒精性脂肪性肝炎大鼠 TNF-的影响 J.福建中医药，2018，49（3）：38-41.6苏森森，潘渠.益生菌对宿主心理健康及脑功能的积极影响及其机制 J.中国微生态学杂志，2017，29（4）：476-480，493.7孙波，陈亭，王婷，等.肠道菌群与脑-肠轴相互作用关系研究进展 J.中国微生态学杂志，2016，28（10）：1206-1211.8马燕，郭莉娜，刘漪沦.肠道菌群与抑郁症发生的研究进展 J.实用医学杂志，2018，34（2）：324-327.9KONOPELSKA S，KIENITZ T，HUGHES B，et al.Hepatic 11be-ta-HSD1 mRNA expression in fatty liver and nonalcoholic steato-hepatitis J.Clin Endocrinol（Oxf），2009，70（4）：554-560.10 吕宝伟，冯春青，孙建光.基于“肝主疏泄”理论探讨脂肪肝分期治疗 J.吉林中医药，2018，38（3）：266-269.11 张惠云，乔明琦，孙丽，等.肝气郁证模型大鼠下丘脑单胺类神经递质分析 J.中医杂志，2008，49（2）：150-152.12 徐唱，张启明，徐茂青.基于心理应激探讨肝主疏泄与神经退行性疾病的相关性 J.环球中医药，2021，14（2）：230-235.13 田蕾，吴昊，韦昱，等.从心理应激理论探讨中医肝主疏泄功能的研究思考 J.世界中医药，2016，11（9）：1905-1908.Effect of Compound Xiongdan Yinchen Granules on Hormone Related to HPA Axis in Rats with Metabolic-Associated Fatty Liver DiseaseWANG Chunju1,WU Juan1*,LOU Ying1,YANG Meifeng1,LIU Yun1,WU Ling21 Clinical Skills Teaching Center of Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,Fujian 350122,China;2 School of Nursing,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,Fujian 350122,ChinaABSTRACTObjective:To study the effect of Compound Xiongdan Yinchen Granules on HPA axis related hormones in rats with metabolic-associated fatty liver disease(MAFLD).Methods:A tatol of 51 SD rats were randomly divided into normal group(n=10),model group(n=11),low-dose group(n=10),medium-dose group(n=10)and high-dose group(n=10).The normal group was fed with basic diet,and the model group and each dose group were fed with high-fat diet for 6 weeks.After successful modeling,the low,medium and high dose groups were given 4.73,9.46 and 18.92 g/L compound Xiongdan Yinchen Granules by intragastric administration according to the body weight of 1 mL/100 g,while the normal and model groups were given 2 mL normal saline by intragastric administration for a total of 4 weeks.HE staining was used to observe the pathological changes of liver tissue of rats.Serum levels of alanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST),corticotropin releasing hormone(CRH),adrenocorticotropin(ACTH)and cortisol(CORT)were detected.qPCR and immunohistochemistry were used to detect the expression of CRH,ACTH,CORT mRNA and protein in the liver tissues of rats.Results:Compared with the normal group,the hepatic cord arrangement of rats in the model group was disordered,the adipose vacuoles filled the visual field,and the involvement of the hepatic lobule was more than 50%,which was consistent with the pathological grade+of fatty liver disease.Compared with the model group,the adipose vacuoles of hepatocytes in each dose group were reduced,the hepatic cords were arranged neatly,and the hepatic lobules were clearly visible.Compared with the normal group,the serum levels of AST,ALT,CRH,ACTH and CORT in the model group significantly increased(P0.01).Compared with the model group,the serum levels of AST,ALT,ACTH and CORT in all dose groups significantly decreased(P0.01),and the serum levels of CRH in the medium and high dose groups significantly decreased(P0.05,P0.01).Compared with the normal group,the mRNA expression levels of CRH,ACTH and CORT in the liver of the model group significantly increased(P0.01).Compared with the model group,the mRNA expression levels of CRH,ACTH and CORT in the liver of the low,medium and high dose groups significantly decreased(P0.05,P0.01).Compared with the normal group,the protein expression levels of CRH,ACTH and CORT in the liver of the model group significantly increased(P0.05).Compared with the model group,the protein expression levels of CRH,ACTH and CORT in the liver of all dose groups significantly decreased(P0.05).Conclusion:Compound Xiongdan Yinchen Granules can improve the liver tissue injury and reduce the secretion of CRH,ACTH and CORT in serum and liver tissue of MAFLD rats,suggesting that the mechanism of Compound Xiongdan Yinchen Granules in the treatment of MAFLD may be related to the improvement of the dysfunction of HPA axis.KEY WORDSmetabolic-associated fatty liver disease;Compound Xiongdan Yinchen Granules;CRH;ACTH;CORT16