三七总皂苷和马齿苋多糖合用的抗炎功效评价.pdf

香料香精化妆品FLAVOUR FRAGRANCE COSMETICS2024年4月第2期Apr.2024,No.2原料与配方89www.ffc-www.ffc-作 者1.昆明医科大学科技成果孵化中心，云南昆明 650500；2.昆明医科大学人文与管理学院，云南昆明 650500；3.云南悦芳季生物资源开发有限公司，云南昆明 650501夏金凤1 陈 影2 杨万松3 张钰雯1 陈 真1#三七总皂苷和马齿苋多糖合用的抗炎功效评价摘 要为了探讨不同质量浓度下三七总皂苷和马齿苋多糖的协同抗炎组方，将不同质量浓度的三七总皂苷（1、5、25、125 g/mL）和马齿苋多糖（2、10、50、250 g/mL）两两复配，以 100 g/mL 地塞米松为阳性对照，通过测定炎症因子 TNF-的抑制率评估 16 种复配组合物的抗炎功效，并采用协同分数（synergy score 值）系统定量评价复配组合物中 2 种成分的相互作用。结果显示，当质量浓度为 125 g/mL 的三七总皂苷与 50 g/mL 或 250 g/mL 的马齿苋多糖复配时，均对 TNF-具有显著的抑制效应，抑制率分别为 45.18%和 61.42%，其抑制作用与 100 g/mL 的地塞米松（抑制率为 53.17%）无显著性差异（P0.05），synergy score 值分别为 15.58 和 26.44。综上，125 g/mL 的三七总皂苷与 50 g/mL 或 250 g/mL 的马齿苋多糖合用时协同抑制 TNF-的产生，但其余 14 种更低剂量的复配组合仅表现为相加作用。关键词协同作用 三七总皂苷 马齿苋多糖 炎症因子Anti-Inflammatory Effect of Panax Notoginseng Saponins Combined with Portulaca Oleracea PolysaccharideXIA Jinfeng1 CHEN Ying2 YANG Wansong3 ZHANG Yuwen1 CHEN Zhen1#(1.Incutation Center for Scientific and Technology Achievement,Kunming Medical University,Kuming 650500,Yunnan,China;2.School of Humanities and Management,Kunming Medical University,Kunming 650500,Yunnan,China;3.Yunnan Yuefangji Biotechnology Co.,Ltd.,Kuming 650501,Yunnan,China)Abstract:To investigate the synergistic anti-inflammatory effects of Panax notoginseng saponins(PNS)and Portulaca oleracea polysaccharide(POP)at different dosage concentrations.PNS(1,5,25,125 g/mL)and POP(2,10,50,250 g/mL)were respectively combined in pairs at different concentrations,and 100 g/mL dexamethasone was used as a positive control.The inhibition rate of TNF-of 16 combinations was studied,and the interaction of the two components was quantitatively evaluated by the synergy score system.PNS at 125 g/mL combined with POP at 50 g/mL or 250 g/mL effectively suppressed TNF-production,and the inhibitory rates were 45.18%and 61.42%respectively.The inhibitory effect was not significantly different from that of dexamethasone 100 g/mL(53.17%)(P0.05).Synergy scores were 15.58 and 26.44,respectively.It was suggested that 125 g/mL PNS combined with 50 g/mL or 250 g/mL POP could synergically inhibit the production of TNF-,作 者 简 介夏金凤（1996），女，硕士，主要从事化妆品原料的功效与安全性评价。#通信作者：陈真（1980），男，博士，高级工程师，主要从事产学研合作及科技成果转化研究。联系电话：[phone]E-mail:DOI:10.20099/j.issn.1000-4475.2023.0063收稿日期：2023-03-08；修回日期：2023-05-10原料与配方2024 年 4 月香料香精化妆品90www.ffc-www.ffc-but the other 14 lower dose combinations only showed the additive effect.Keywords:synergistic effect Panax notoginseng saponins Portulaca oleracea polysaccharide inflammatory factor将天然植物来源的活性成分用作化妆品原料是当前化妆品研发的热点领域，我国约有 82.64%的化妆品添加植物提取物，且采用 2 种或 2 种以上植物提取物复配的化妆品占比 80.17%1。几种原料复配后，可能产生协同作用使功效增强，但也可能产生拮抗作用使功效减弱，甚至发生不良反应2。因此，很多配方师在设计化妆品时凭经验将几种植物提取物按一定比例复配，忽略了相似活性成分之间可能存在协同或拮抗的相互作用。马齿苋（Portulaca oleraces）提取物和三七（Panax notoginseng）总皂苷是常用的植物来源化妆品原料，都具有舒缓和抗炎作用。马齿苋提取物对透明质酸酶的抑制率最高可达 90%以上3，对敏感性皮肤有较好的缓解和改善作用。马齿苋多糖（POP）可通过降低血清促炎因子 IL-6、IL-17、TNF-表达水平，升高抗炎因子IL-10表达水平，从而发挥抗炎功效4。三七总皂苷（PNS）可抑制 NF-B p65 的磷酸化5，阻止 p65 转位入核，降低iNOS-NO、NF-B 信号通路的表达，从而发挥抗炎效果。POP 和 PNS 都可以降低炎症因子的表达而发挥抗炎功效，两者可能存在协同作用，但目前关于两者联用的协同作用鲜有研究报道。以 PNS 和 POP（马齿苋提取物中主要成分6）2 种植物来源的活性成分作为研究对象，采用脂多糖（LPS）诱导巨噬细胞 RAW 264.7 释放炎症因子 TNF-细胞模型7评估抗炎功效；并结合协同分数（synergy score 值）8，评价这 2 种成分不同剂量复配组合的相互作用。从细胞水平研究二者的抗炎协同增效作用，以期对相关化妆品的开发应用提供基础数据。所筛选出的具有增强协同作用的配比方案，可用于开发宣称具有“舒缓”功效和“适用于敏感皮肤”的化妆品；也为今后设计多种相似活性的化妆品成分的复配方案时，提供一种科学的思路和有效的评价方法。1 试验部分1.1 主要材料、试剂与仪器PNS（批号 SS9450，淡黄色粉末，纯度98%）、POP（批号 SP9810，白色至类白色粉末，纯度 98%），索莱宝科技有限公司；TNF-ELISA 检测试剂盒，欣博盛生物科技有限公司；CCK-8检测试剂盒、地塞米松，索莱宝科技有限公司；二甲基亚砜（DMSO）、脂多糖（LPS，大肠杆菌来源），德国 Merck Life Scienc 公司；小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系 RAW264.7（型号为 KCB 200603YJ），中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库；DMEM 培养基，白鲨生物科技有限公司；胎牛血清，赛默飞世尔科技有限公司；磷酸盐缓冲液（PBS），江苏凯基生物技术有限公司。细胞培养板（96 孔、24 孔），T25 培养瓶、T75 培养瓶，康宁生命科学有限公司；酶标仪，美国谷子公司；CO2培养箱，德国美墨尔特生物有限公司；37 恒温箱，上海森信仪器公司；离心机，上海科学仪器厂；自动高压灭菌器，中检西南计量有限公司；移液枪和枪头，白鲨生物科技有限公司；涡旋混合器，其林贝尔仪器制造有限公司。1.2 试验方法1.2.1 测试品制备刺激物：精准称量 10 mg LPS，以 5 mL PBS溶解，配置成质量浓度为 2 mg/mL 的 LPS 母液。取 100 L 分装到 0.5 mL 的 EP 管中，在-20冰箱保存。使用前用培养基稀释至质量浓度为 5 g/mL 作为刺激物。试验组：分别精准称取 10 mg PNS 和 POP，分别以 0.5、1 mL DMSO 溶解，配置成质量浓度为20 mg/mL的PNS母液和10 mg/mL的POP母液。各取 100、200 L 分装到 0.5 mL EP 管中，在-20冰箱保存。使用前用培养基梯度稀释成目标浓度的测试溶液，用于细胞活力检测，及不同复配组合的抗炎活性评价。阳性对照组：精准称量 5 mg 地塞米松，以 1 mL DMSO溶解，取100 L分装到0.5 mL EP管中，在-20冰箱保存。使用时用培养基稀释至质量浓度为 100 g/mL，加入刺激物作为阳性对照。1.2.2 细胞培养将 RAW264.7 细胞加入到含体积分数 10%胎牛血清的 DMEM 高糖培养液中，置于培养箱（37 ，体积分数 5%CO2）中常规培养。待细胞融合度达 80%90%，用细胞刮刮下瓶底贴壁细胞消化传代，每周传代或换液 2 3 次。第 2 期原料与配方夏金凤，等：三七总皂苷和马齿苋多糖合用的抗炎功效评价91www.ffc-1.2.3 RAW264.7 细胞活力检测在细胞融合度达 80 90%时，用上述细胞传代的方法得到细胞悬液，将细胞密度调整为6.5104个/mL，加入 96 孔板中，每孔 200 L 细胞悬液，继续置于培养箱（37，体积分数 5%CO2）中培养 24 h。先吸取 96 孔板中旧的培养液，后每孔加 200 L 含不同质量浓度受试物的完全培养液（试验组），不含受试物的 200 L 完全培养基为阴性对照，每组设 3 个复孔作为平行组。置于培养箱中恒温培养 24 h。吸取上清液丢弃，每孔加入 100 L 培养基和 10 L CCK-8 溶液混合物，孵育 2 h，用酶标仪测定其在 450 nm 处吸光度 A值。用式（1）计算各测试组细胞存活率，每组试验独立重复 3 次，数据以（xs）表示。当细胞存活率 80%时，可认为测试样品在该含量下对RAW264.7 细胞增殖无影响。细胞存活率=A试验组-A空白组A阴性对照组-A空白组100%（1）1.2.4 体外细胞试验验证受试物对 TNF-的抑制情况上述细胞培养方法，在细胞融合度达80%90%时，取细胞悬液，调整细胞密度至 9104个/mL，加入 24 孔板中，每孔 1 000 L 细胞悬液，置于培养箱（37 ，体积分数 5%CO2）中恒温培养 24 h。等到孔板中细胞铺板率满足试验要求时，模型组和空白组换入新的完全培养基，阳性对照组加入含有 100 g/mL 地塞米松的完全培养基，试验组加入含有 PNS（1、5、25、125 g/mL）与 POP（2、10、50、250 g/mL）两联复配的 16 种复配组合的培养基，预处理细胞 2 h。除空白组外，模型组和试验组都加入 LPS（5 g/mL）的完全培养基继续孵育 16 h。收集上清液，于 3 000 r/min 离心 10 min 后取上清液保存。按照 ELISA 试剂盒说明书进行 TNF-含量检测。每组试验独立重复 3 次，数据以（xs）表示。按式（2）计算 TNF-抑制概率。抑制率=试验组 TNF-含量平均值模型组 TNF-含量平均值100%（2）1.2.5 协同作用分析采 用 SynergyFinder 分 析 工 具（https:/synergyfinder.fimm.fi）分 析 PNS 和 POP 合 用 的协同作用。该工具是一个可公开访问的药物组合分析网络平台，用于交互式分析和可视化多药联合反应数据。对药物联合（组合）使用进行量化，以定量描述 2 种成分组合使用的相互作用8。synergy score10，说明该组合具有协同作用；-10 synergy score 10，说明该组合为相加作用；synergy score-10，说明该组合为拮抗作用。1.2.6 数据处理试验数据采用 SPSS 17.0 软件进行统计学分析，计量资料采用（xs）表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，以 P100%，说明促进了细胞增殖。在后续测试中，将选择该质量浓度为 PNS 和 POP 在复配组合设计中的最大质量浓度，在此基础上进行等比稀释和两两复配后，细胞存活率均大于 80%（见表 1），并开展后期的试验。质量浓度/(g mL-1)图 1 PNS 与 POP 质量分数对 RAW264.7 细胞存活率的影响2.2 不同质量浓度 PNS、POP 对 TNF-的抑制结果2.2.1 炎症模型LPS 是一种源自革兰氏阴性细菌细胞壁外壁的多糖成分，常被用做诱导目标细胞引发炎症反150100500细胞存活率/%PNSPOP阴性对照组31.2562.51252505001000原料与配方2024 年 4 月香料香精化妆品92www.ffc-www.ffc-应的刺激物9，以 LPS 诱导 RAW264.7 小鼠巨噬细胞模型被广泛用于评价和筛选化妆品及其原料的舒缓抗炎功效10-12。当 LPS 刺激 RAW264.7 细胞 16 h 后，模型组（LPS刺激）的TNF-含量与空白组（不加LPS刺激）相比升高 133.61 倍，符合 T/SHRH 034-2021化妆品舒缓功效测试体外 TNF-炎症因子含量测定脂多糖诱导巨噬细胞 RAW264.7 测试方法团体标准的有效性验证要求7，证明在本试验条件下，5 g/mL 的 LPS 刺激 RAW264.7 细胞产生炎症因子 TNF-的研究模型成立。2.2.2 对 TNF-的抑制结果及协同作用分析不同质量浓度的 PNS 和 POP 均能抑制 LPS诱导的 RAW264.7 产生 TNF-（见表 2）。依据 T/SHRH 034-2021 标准7，当 TNF-抑制率 25%，判定为测试成分有舒缓功效。单独使用 PNS 在25、125 g/mL 时，TNF-抑制率大于 25%；单独使用 POP 在 250 g/mL 时，TNF-抑制率也大于25%。当 PNS（125 g/mL）与 POP（250 g/mL）复配时，对 TNF-的抑制率是 61.42%，大于 PNS和 POP 在该剂量下单独使用的抑制率之和，其synergy score 值为 26.44（见图 2）。PNS（125 g/mL）与 POP（50 g/mL）复配时，其 synergy score 值为 15.58，表示以上复配组合具有协同作用。其余14 个复配组合，计算结果在-10 synergy score值 10 范围内，说明这些复配组合仅存在相加作用，并无协同作用。表 1 不同浓度的 PNS 与 POP 两两复配后对 RAW264.7 细胞存活率的影响 单位：%原料及其质量浓度POP/(g mL-1)021050250PNS/(g mL-1)0100.00091.741.61112.399.82106.017.36118.845.44195.2311.5291.297.7887.424.2591.669.6799.936.055106.074.38109.661.91104.343.38105.817.27105.612.8125108.834.24104.4511.82104.494.5699.267.2299.263.5512586.246.91100.824.93100.043.3297.073.8892.9311.77 表 2 不同质量浓度 PNS 与 POP 两两复配后对 LPS 诱导 RAW264.7 细胞释放 TNF-抑制率 单位：%原料及其质量浓度POP/(g mL-1)021050250PNS/(g mL-1)00013.371.9617.901.4316.957.7825.655.81122.318.0714.219.844.662.0913.855.5125.226.99521.891.4310.0011.7212.474.617.194.1622.825.572526.448.6720.066.1310.275.6810.382.8633.855.4412530.946.7330.369.6927.553.0845.183.6861.425.55地塞米松是临床常用的抗炎药物，以地塞米松（100 g/mL）为阳性对照组，对 TNF-的抑制率为 53.17%。由图 3 可以看出，产生协同作用的2 种组合 125 g/mL PNS+50 g/mL POP（协同组 1）和 125 g/mL PNS+250 g/mL POP（协同组 2）都能显著地降低（P0.05）。植物中提取的天然抗炎原料可以通过不同靶点、多途径联合作用，对炎症发挥较好的协同治疗作用，以较低的药物剂量实现相同甚至更好的治疗效果。网络药理学研究表明三七和马齿苋合用可通过参与白细胞迁移、氧化应激反应、转录因子活性等多种途径调控炎症反应1，马齿苋多糖可能主要对 TNF-炎症因子的释放起主导作用4；而三七总皂苷对抑制 NF-B p65 靶点起主导作用5，提示两者在复配时，三七总皂苷和马齿苋多糖并非通过共同干预同一靶标发挥协同作用，而是侧重于调控不同靶点，影响不同分子网络，互补调节炎症反应从而发挥网络协同效应，这可能也是第 2 期原料与配方夏金凤，等：三七总皂苷和马齿苋多糖合用的抗炎功效评价93www.ffc-化妆品植物原料组方复配的精髓所在。POP 在更低质量浓度进行复配时，并不具备协同抗炎作用，仅表现为相加作用。参考文献1 李雪,王燕萍,杨兆均,等.20142021 年含植物原料的国产普通化妆品现状分析 J.日用化学工业,2022,52(8):875-881.2 KASIRAM M Z,HAPIDIN H,ABDULLAH H,et al.Tannic acid enhances cisplatin effect on cell proliferation and apoptosis of human osteosarcoma cell line(U2OS)J.Pharmacological Reports,2022,74(1):175-188.3 王领,李富恒,程华,等.马齿苋提取物制备工艺、安全性及抗敏功效的研究 J.天然产物研究与开发,2014,26(4):583-587.4 杨阳.马齿苋多糖改善溃疡性结肠炎小鼠的作用及相关机制研究 D.大庆:黑龙江八一农垦大学,2022.5 冯晓异,赵微,何朋伦,等.三七总皂苷调节 iNOS-NO-NF-B 信号通路抑制 LPS 诱导的 RAW246.7 细胞炎症研究 J.药物评价研究,2020,43(4):670-675.6 周春丽,苏虎,王德解,等.马齿苋有效成分的提取及定量分析 J.时珍国医国药,2008(8):1933-1934.7 上海日用化学品行业协会.化妆品舒缓功效测试:体外TNF-炎症因子含量测定脂多糖诱导巨噬细胞 RAW264.7 测试方法:T/SHRH 034-2021 S.国标委全国团体标准信息平台,2021.8 IANEVSKI A,GIRI A K,AITTOKALLIO T.SynergyFinder 3.0:an interactive analysis and consensus interpretation of multi-drug synergies across multiple samples J.Nucleic Acids Research,2022,50(1):739-743.9 LEON C G,TORY R,JIA J,et al.Discovery and development of toll-like receptor 4(TLR4)antagonists:a new paradigm for treating sepsis and other diseases J.Pharmaceutical Research,2008,25(8):1751-1761.10 李晓敏,张红霞,范莹,等.芦荟胶抗炎功效研究 J.日用化学工业(中英文),2022,52(12):1320-1325.11 薛文斌,卢正君,董长青.甘草及姜根提取物复配乳液舒缓功效研究 J.中国化妆品,2021(12):115-119.12 陈庆生,孟潇,刘婷,等.一种抗敏修护组合物对敏感性皮肤的舒缓修护功效的研究 J.日用化学工业,2021,51(12):1221-1227.图 2 不同质量浓度 PNS 与 POP 复配的 synergy score 值等高线图A.模型组（LPS 5 g/mL）；B.阳性对照组（LPS 5 g/mL+地塞米松 100 g/mL）；C.（LPS 5 g/mL+协同组 1）；D.（LPS 5 g/mL+协同组 2）图 3 各功效组分 TNF-的抑制率情况注：“*”表示经方差分析，P0.05。3 结论经试验发现，125 g/mL 的 PNS 和 50 g/mL或 250 g/mL 的 POP 进行复配时，能表现为协同抗炎作用，可有效抑制 LPS 刺激诱导的巨噬细胞 RAW264.7 释放炎症因子 TNF-，其抑制效果与 100 g/mL 的地塞米松相当。但是，当 PNS 和120100806040200PNS/（g mL-1）synergy score 值3020100-100 50 100 150 200 250POP/（g mL-1）3 0002 0001 0000TNF-含量/（pgmL-1）ABCD*nsns773.081 651.00905.15637.03*