体内药物分析方法.ppt

任务任务3-6：体内药物分析方法：体内药物分析方法 常用体内样品的制备与贮藏常用体内样品的制备与贮藏 1体内样品分析的前处理体内样品分析的前处理 2体内样品分析方法与方法验证体内样品分析方法与方法验证 3概述概述体内药物分析体内药物分析方法建立方法建立与验证与验证净化与浓集净化与浓集原形原形,代谢物代谢物体液或组织体液或组织色谱色谱;免疫分析免疫分析;生物生物 全面验证和部分验证全面验证和部分验证 原形药物或其代谢物原形药物或其代谢物 缀合物缀合物,蛋白结合物蛋白结合物 体内样品体内样品存在形式存在形式样品制备样品制备分析方法分析方法去蛋白去蛋白;萃取萃取;膜分离膜分离水解水解;化学衍生化化学衍生化血液是主要样品血液是主要样品尿液尿液,唾液唾液,头发和脏器头发和脏器概述概述体内药物分析的特点体内药物分析的特点主要来自于主要来自于体内样品的特点体内样品的特点特点特点第一节第一节常用体内样品的制备与贮藏常用体内样品的制备与贮藏 体内样品的种类体内样品的种类1体内样品的采集与制备体内样品的采集与制备 2体内样品的贮藏与处理体内样品的贮藏与处理 3体液体液组织组织排泄物排泄物一、体内样品的种类一、体内样品的种类血液血液;唾液唾液脑脊液脑脊液;胃液胃液;胆胆汁汁;乳汁乳汁;精液精液;泪液泪液尿液尿液粪便粪便;汗液汗液胃胃;肠肠;肝肝;肾肾;肺肺,脑脑;肌肉肌肉;头发头发常见体内样品常见体内样品1.血样的采集血样的采集 静脉静脉,1-5ml 1/10 2.血浆的制备血浆的制备 抗凝剂抗凝剂,1000 g离心离心 5-10min 淡黄色上清液淡黄色上清液 3.血清的制备血清的制备 30min-1h 1000 g离心离心 5-10min 上层淡黄色液体上层淡黄色液体 4.全血的制备全血的制备 抗凝剂抗凝剂,不离心不离心1.尿样的特点尿样的特点 原形原形,代谢物及代谢物及缀合物缀合物 药物浓度较高药物浓度较高 收集量大收集量大(15L)2.尿样的采集尿样的采集 自然排尿自然排尿 规定时间段规定时间段(6-8h)(时间尿时间尿)3.尿样的贮藏尿样的贮藏 加入适当防腐剂加入适当防腐剂 TDM测定测定S代替代替P进行临床监测进行临床监测 1.唾液的组成唾液的组成 腮腺腮腺,舌下腺和舌下腺和颌下腺颌下腺 2.唾液的采集唾液的采集 漱口漱口15min,安安静状态静状态,自然自然流出的唾液流出的唾液 物理或化学方物理或化学方法刺激法刺激 3.样品的制备样品的制备 3000r/min离心离心10min,上清液上清液 1.样品的制备样品的制备 制成水性基质制成水性基质匀浆溶液匀浆溶液 2.样品的处理样品的处理 (1)沉淀蛋白法沉淀蛋白法 (2)酸酸/碱水解法碱水解法 (3)酶水解法酶水解法 蛋白水解酶中蛋白水解酶中的枯草菌溶素的枯草菌溶素 血样血样尿样尿样唾液唾液组织组织二、体内样品的采集与制备二、体内样品的采集与制备50-60 20-40 三、体内样品的贮存与处理三、体内样品的贮存与处理(一一)冷藏与冷冻冷藏与冷冻 短期保存短期保存:冰箱冰箱(4)冷藏冷藏 长期保存长期保存:冷柜冷柜(-20/-70-80)冷冻冷冻,小体积分装小体积分装1.血浆血浆/血清血清:分离分离(2h),硬质玻璃硬质玻璃/聚乙烯管聚乙烯管(EP),冷冻冷冻2.尿样尿样:冷藏冷藏(2436h)加防腐剂加防腐剂3.唾液唾液:冷冻保存时冷冻保存时,解冻后充分搅匀后再用解冻后充分搅匀后再用(二二)去活性去活性 采样后立即终止酶的活性采样后立即终止酶的活性 常用方法常用方法:液氮速冻液氮速冻,微波照射微波照射,匀浆匀浆/沉淀沉淀,加酶活性加酶活性阻断剂阻断剂(氟化钠氟化钠)或抗氧剂或抗氧剂(VC),煮沸煮沸 第二节第二节体内样品分析的前处理体内样品分析的前处理 体内样品预处理的目的体内样品预处理的目的1常用体内样品预处理方法常用体内样品预处理方法 2p 前处理前处理(分离分离,浓集浓集,改性改性)为药物的测定提供条件为药物的测定提供条件p 前处理是体内药物分析过程中重要且繁复的工作前处理是体内药物分析过程中重要且繁复的工作 仪器污染仪器污染,劣化劣化(去蛋白去蛋白)提高测定灵敏度提高测定灵敏度/选择性选择性化学改性化学改性(衍生化衍生化)血浆蛋白结合物血浆蛋白结合物;缀合物缀合物使待测药物使待测药物/代谢物代谢物释放释放测定药物测定药物/代谢物代谢物总浓度总浓度 1.1.使待测使待测使待测使待测组分游离组分游离组分游离组分游离 2.2.满足满足满足满足测定方法测定方法测定方法测定方法的要求的要求的要求的要求 3.3.改善改善改善改善分析环境分析环境分析环境分析环境 一、体内样品前处理的目的一、体内样品前处理的目的样品介质组成复杂样品介质组成复杂:分离分离待测组分浓度低待测组分浓度低:浓集浓集 前处理前处理二、二、体内样品前处理的方法体内样品前处理的方法 去除蛋白质法去除蛋白质法 分离与浓集法分离与浓集法 缀合物水解法缀合物水解法 (一一)(二二)(三三)化学衍生化法化学衍生化法 (四四)(一一)去除蛋白质法去除蛋白质法l加入与水混加入与水混溶的有机溶剂溶的有机溶剂,蛋白析出蛋白析出药药物释放物释放l乙腈乙腈,甲醇甲醇,丙酮丙酮,四氢呋四氢呋喃等喃等 l血浆血浆/血清与血清与有机溶剂的体有机溶剂的体积比积比1(2-3)l饱和硫酸铵饱和硫酸铵,硫酸钠硫酸钠,硫酸镁硫酸镁,氯化钠等氯化钠等l血清与饱和血清与饱和硫酸铵溶液的硫酸铵溶液的比比1 2 l10%三氯醋三氯醋酸或酸或6%高氯高氯酸溶液酸溶液l血清与强酸血清与强酸的比的比1 0.6l上清液呈强上清液呈强酸性酸性(pH4)l酸性分解的酸性分解的药物不宜用药物不宜用 l热变性蛋白热变性蛋白质沉淀质沉淀l通常通常90l方法简单方法简单l只能除去热只能除去热变性蛋白变性蛋白l待测物热稳待测物热稳定性好定性好 1.1.溶剂沉淀法溶剂沉淀法溶剂沉淀法溶剂沉淀法 2.2.中性盐析法中性盐析法中性盐析法中性盐析法 3.3.强酸沉淀法强酸沉淀法强酸沉淀法强酸沉淀法 4.4.热凝固法热凝固法热凝固法热凝固法 (二二)分离与浓集法分离与浓集法液相萃取法液相萃取法固相萃取法固相萃取法 超滤法超滤法1.2.3.1.液相萃取法液相萃取法溶剂的选择原则溶剂的选择原则溶剂的用量溶剂的用量 水相的水相的pH(1)(2)(3)提取操作提取操作(4)(1)溶剂的选取原则溶剂的选取原则对药物分子未电离形式可溶对药物分子未电离形式可溶,对电离形式不溶；对电离形式不溶；沸点低沸点低,易挥发易挥发;与水不相混溶与水不相混溶;无毒无毒,不易燃烧不易燃烧;具有化学稳定和惰性具有化学稳定和惰性;不影响紫外检测不影响紫外检测 溶剂紫外截止波长(nm)沸点()极性增加正己烷21069环己烷21081甲苯285111异丙醚*22068乙醚*22035醋酸戊酯285149三氯甲烷24561甲基异丁基酮230116醋酸乙酯26077正丁醇215118*:含过氧化物；含过氧化物；:肝脏毒性肝脏毒性,有致癌作用有致癌作用 辅助试剂的使用辅助试剂的使用 乙醚乙醚(1.2%水水):氯化钠氯化钠混合溶剂的使用混合溶剂的使用 正己烷正己烷-异丙醇异丙醇(95:5)(2)溶剂的用量溶剂的用量l有机相与水相有机相与水相(样品样品)体积比为体积比为1:15:1l碱性药物碱性药物pH高于高于pKa 12单位单位l酸性药物酸性药物pH低于低于pKa 12单位单位l碱性下提取碱性下提取,可减少内源性物质可减少内源性物质(酸性酸性)的干扰的干扰l碱性下不稳定碱性下不稳定,在中性用三氯甲烷和异丙醇提取在中性用三氯甲烷和异丙醇提取(3)水相的水相的pHl提取提取1 1次次l若提取回收率较低若提取回收率较低(低于低于50%),提取提取23次次l脂溶性干扰物脂溶性干扰物,可进行小体积水溶液反提取可进行小体积水溶液反提取(4)提取操作提取操作 2.固相萃取法固相萃取法固相萃取法的原理固相萃取法的原理 固相萃取法操作步骤固相萃取法操作步骤 注意事项注意事项(1)(2)(3)固相萃取法的特点固相萃取法的特点(4)自动化固相萃取自动化固相萃取(5)(1)固相萃取法的原理固相萃取法的原理含药物体内样品通过小柱时含药物体内样品通过小柱时,受到受到“吸附吸附”,“分配分配”,“离子交换离子交换”或其它亲和力或其它亲和力作用作用,药物及内源性物质同时被保留在固定相药物及内源性物质同时被保留在固定相(填料填料)洗脱方式有两种洗脱方式有两种:冲洗溶剂洗去干扰物冲洗溶剂洗去干扰物,再用对药物再用对药物亲和力更强的溶剂洗脱药物亲和力更强的溶剂洗脱药物;药物直接被洗脱药物直接被洗脱,干扰物保留干扰物保留(2)固相萃取法操作步骤固相萃取法操作步骤l 第第1步步:甲醇润湿小柱甲醇润湿小柱,活化填料活化填料;净化填料净化填料l 第第2步步:水水/缓冲液冲洗小柱缓冲液冲洗小柱,去除甲醇去除甲醇;甲醇含量甲醇含量 过低过低(低于低于5%)致致C18链弯曲折叠链弯曲折叠,回收率降低回收率降低l 第第3步步:加样加样,使样品通过小柱使样品通过小柱,并弃去滤过液并弃去滤过液l 第第4步步:水水/缓冲液冲洗缓冲液冲洗 小柱小柱,去除内源性及其去除内源性及其 它干扰物质它干扰物质l第第5步步:洗脱溶剂洗脱洗脱溶剂洗脱 待测物待测物,收集洗脱液收集洗脱液,平衡平衡(3)注意事项注意事项l 样品样品(血浆血浆)通过萃取柱的流速在通过萃取柱的流速在 1-2ml/min;l 冲洗液和洗脱剂的强度与用量适当冲洗液和洗脱剂的强度与用量适当,否则导致药物损失否则导致药物损失/选择性下降选择性下降,通常选用可与水混溶的洗脱剂通常选用可与水混溶的洗脱剂;l 萃取碱性药物时萃取碱性药物时,洗脱剂中常加酸洗脱剂中常加酸,有机胺有机胺,氨水氨水,醋酸铵或离子对试剂醋酸铵或离子对试剂(4)自动化自动化固相萃取法固相萃取法l对于单个样品处理对于单个样品处理,SPE操作省时操作省时l对于大量样品的处理对于大量样品的处理l半自动半自动SPE:萃取过程机械化萃取过程机械化l全自动化仪器全自动化仪器:通过柱切换技术通过柱切换技术 实现固相萃取与实现固相萃取与HPLC联用联用柱切换柱切换:固相萃取固相萃取-LC/MS/MS(5)自动化自动化固相萃取法固相萃取法3.超滤超滤法法lultrafiltration是一种膜分离技术是一种膜分离技术l按照截留分子量按照截留分子量,选择半透膜选择半透膜,可分离可分离30 1000kD的可溶性生物大分子的可溶性生物大分子l无化学试剂无化学试剂,无相变化无相变化提取操作提取操作(4)l简便简便,游离药物分析的首游离药物分析的首选方法选方法;尤其适合尤其适合TDM(三三)水解法水解法l 简便简便,快速快速l 水解过程中水解过程中发生药物分解发生药物分解l 专一性较差专一性较差l 葡萄糖醛酸苷葡萄糖醛酸苷酶或酶或/和硫酸酯酶和硫酸酯酶l 专属性强专属性强l 时间较长时间较长l 可引入粘蛋白可引入粘蛋白l 溶剂萃取过溶剂萃取过程中缀合物程中缀合物(尤尤其硫酸酯其硫酸酯)直接直接分解分解l 测定尿药总量测定尿药总量,水解缀合物水解缀合物l 趋向于直接测定缀合物趋向于直接测定缀合物 1.1.酸水解法酸水解法酸水解法酸水解法2.2.酶水解法酶水解法酶水解法酶水解法 3.3.溶剂解法溶剂解法溶剂解法溶剂解法 (四四)化学衍生化法化学衍生化法l GC:提高药物的挥发性提高药物的挥发性;增加药物的增加药物的 稳定性稳定性;生成非对映异构体生成非对映异构体l HPLC:提高检测灵敏度提高检测灵敏度;改善色谱分离改善色谱分离 容量容量分析法分析法第三节第三节体内样品分析方法与方法验证体内样品分析方法与方法验证分析方法的建立分析方法的建立一、一、分析方法的验证分析方法的验证 二、二、一、分析方法的建立一、分析方法的建立分析方法的选择分析方法的选择分析方法建立的一般程序分析方法建立的一般程序(一一)(二二)(一一)分析方法的选择分析方法的选择l HPLC,GCl HPLC-MSn,GC-MSl RIA,EIA,FIA;适用于大分子适用于大分子l TDM应用较多应用较多l 抗生素生物利用度抗生素生物利用度,等效性等效性,TDM l 应用较少应用较少常用的检测方法常用的检测方法:色谱分析法色谱分析法,免疫分析法免疫分析法和生物学方法和生物学方法(二二)分析方法建立的分析方法建立的一般程序一般程序 l 待测物待测物,内标内标(必要时必要时)的标准物质的标准物质 l 色谱柱色谱柱(填料填料),流动相流动相,溶剂溶剂,进样量进样量 l 试剂试剂/溶剂试验溶剂试验;生物介质试验生物介质试验l 质控样品试验质控样品试验l 代谢产物对待测物代谢产物对待测物,内标物的干扰内标物的干扰l 配伍用药的干扰配伍用药的干扰l分析方法的建立和验证过程系同步进行分析方法的建立和验证过程系同步进行 l为便于讨论为便于讨论,以色谱分析法为例分别叙述以色谱分析法为例分别叙述1.色谱条件色谱条件 的筛选的筛选2.色谱条件色谱条件 的优化的优化3.实际样品实际样品 的测试的测试二、分析方法的验证二、分析方法的验证特异性特异性标准曲线与定量范围标准曲线与定量范围定量下限定量下限 (一一)(二二)(三三)精密度与准确度精密度与准确度 (四四)样品稳定性样品稳定性(五五)提取回收率提取回收率(六六)l方法方法l样品样品二、分析方法的验证二、分析方法的验证分析过程的质量控制分析过程的质量控制未知样品浓度超限的处理未知样品浓度超限的处理药用内源性物质的测定药用内源性物质的测定 (七七)(八八)(九九)微生物微生物/免疫学方法的验证免疫学方法的验证(十十)名词解释名词解释(十一十一)l分析分析l其他其他(一一)特异性特异性l 比较标准物比较标准物质与质与6个不同个个不同个体的空白生物体的空白生物介质和介质和QC样品样品l 软电离质谱软电离质谱(LC-MS)介质介质效应效应 l 比较比较QC样样品和至少品和至少6个个不同个体用药不同个体用药后的实际样品后的实际样品 l 必要时必要时LC-DAD/MS确证确证峰的单一峰的单一/同一同一 l 比较待测药比较待测药物物,同服药物同服药物,待测药物的待测药物的QC样品和添样品和添加有同服药物加有同服药物的干扰样品的干扰样品 l 特异性(specificity),又称专属性或专一性,通常与选择性(selectivity)互用 1.1.内源性物质内源性物质内源性物质内源性物质 2.2.未知代谢物未知代谢物未知代谢物未知代谢物 3.3.伍用药物伍用药物伍用药物伍用药物 4.参比方法参比方法 l 参比方法横参比方法横坐标坐标(x),拟定方拟定方法纵坐标法纵坐标(y),最最小二乘小二乘 y=a+bx l a恒定干扰恒定干扰 l b比例干扰比例干扰(如如,标记抗原不纯标记抗原不纯,交叉交叉免疫免疫)(二二)标准曲线与定量范围标准曲线与定量范围1.标准曲线的建立标准曲线的建立(二二)l 少数方法(如,IA)外,通常为线性模式 l 线性回归:最小二乘法或加权最小二乘法 l 自变量(x)为药物浓度,因变量(y)为响应信号强度(1)系列标准溶液:n6(不包括0点);等比系列(23);通常为1001000倍(2)内标溶液:浓度相当于系列标准溶液的几何平均浓度(3)系列标准样品:空白生物介质,加入系列标准溶液(4)标准曲线的绘制:药物浓度,以单位体积(如血浆)或质量(如肝脏)的生物介质中加入标准物质的量表示(二二)标准曲线与定量范围标准曲线与定量范围2.限度要求限度要求l通常用至少6个浓度建立标准曲线n非线性相关非线性相关(如如IA)可能需要更多浓度点可能需要更多浓度点l定量范围覆盖全部待测样品浓度范围n定量上限定量上限(ULOQ)高于用药后的峰浓度高于用药后的峰浓度(Cmax)n定量下限定量下限(LLOQ)低于低于Cmax的的10%5%(1/101/20)l标准曲线各浓度点的回归计算值(x)与标示值(x)之间的偏差bias=(x-x)/x100%在可接受的范围之内n最低浓度点的偏差在最低浓度点的偏差在20%以内以内n其余浓度点的偏差在其余浓度点的偏差在15%以内以内(三三)定量下限定量下限1.测定法测定法n取同一生物介质,制备至少5个独立的标准样品,其浓度应使信噪比(S/N)大于5,依法进行精密度与准确度验证l 定量下限(LLOQ):标准曲线上的最低浓度点l 符合准确度和精密度要求2.限度要求限度要求n准确度应在标示浓度的80%120%范围内,相对标准差(RSD)应小于20%(四四)精密度与准确度精密度与准确度1.测定法测定法n高中低3个浓度的QC样品,制备至少5个独立的样品n低低:LLOQ的23倍;高高:ULOQ的80%;中中:几何平均浓度n同法独立测定3天l 方法精密度除评价批内(日内)RSD外,同时还应评价 批间(日间)RSD2.限度要求限度要求n准确度:低,80%120%;中高,85%115%nRSD:低,20%;中高,15%(五五)稳定性稳定性1.测定法测定法(高低浓度高低浓度)n室温考察1个工作日(如1,2,4,8或24h)n冷藏(4)数个工作日(标准储备液至整个分析完成)n冷冻(-20/-80)至整个分析完成n冻-融至少经历3个循环 l 短期稳定性:在1个分析批内,样品室温等待处理;处理后溶液在特定(HPLC进室)温度等待进样期间稳定性l 长期稳定性:在整个样品分析期间,体内样品的长期储藏,冻融;以及标准储备液的稳定性2.期限要求期限要求n短期:通常1工作日,不超过3工作日;长期:整个分析完成期限(六六)提取回收率提取回收率1.测定法测定法n高中低3个浓度的QC样品,制备至少5个独立的样品n另取空白生物介质,照QC样品同法处理,加入等量的标准溶液(必要时除去溶剂)n同法处理高中低3个浓度的标准对照样品(不含生物介质)l 样品处理方法的评价重点在于结果的精密与重现;而非待测物提取的完全与否 2.限度要求限度要求nRSD:低,20%;中高,15%(七七)分析过程的质量控制分析过程的质量控制n每个未知样品测定一次,必要时进行复测n来自同一个体的体内样品在同一分析批中测定n每个分析批,建立批标准曲线;并随行3浓度QC样品 QC样品每个浓度至少双样本,并均匀分布在未知样品顺序(低高/高低顺序均匀穿插整个分析批)中n一个分析批内未知样品数目较多时,应同时增加各浓度QC样品数,使QC样品数大于未知样品总数的5%nQC样品测定结果的偏差不大于15%,低浓度点偏差不大于20%;允许1/3非同浓度QC样品结果超限n不符合上述要求,则该分析批样品测试结果作废(八八)未知样品浓度超限的处理未知样品浓度超限的处理u标准曲线不能外延,浓度超限的样品处理后再测定n浓度高于ULOQl部分样品用空白生物介质稀释至规定体积再测定l同时制备浓度高于ULOQ的QC样品,同法稀释(浓度不低于LLOQ)后测定n浓度低于LLOQl增加样品体积(制备样品浓度高于LLOQ);同法进行QC样品和空白介质试验l特异性不降低,准确度和精密度符合要求l生物利用度/生物等效性研究,不需处理(九九)作为药用的作为药用的内源性物质的测定内源性物质的测定 1.对生物介质进行处理对生物介质进行处理2.生物介质通过活性炭滤过、透析等技术去除所含的该内源性物质后,作为空白生物介质使用2.使用特定生物周期阶段的生物介质使用特定生物周期阶段的生物介质3.适用于呈周期性变化的内源性物质(如雌激素)3.使用替代介质使用替代介质 如兔血浆,人血清蛋白,缓冲液,0.9氯化钠溶液等;测得的浓度需进行校正4.采用标准加入法采用标准加入法 适用于内源性物质含量较低的药物;结果为总浓度(十十)微生物学微生物学/免疫学方法的验证免疫学方法的验证n微生物学或免疫学分析法的标准曲线本质上是非线性非线性的,应尽可能采用更多的浓度点建立标准曲线n如果重复测定重复测定能够改善准确度,则应在方法验证和未知样品测定中采用同样的步骤(如双样本分析)n微生物学或免疫学分析方法验证实验应包括在几天内进行的6个个分析批分析批,每个分析批应包括4个个浓度浓度(LLOQ、低、中、高浓度)的质控双样本(十一十一)名词解释名词解释1n标准物质(reference standard):用于制备标准样品和QC样品的待测物的参比标准l在结构上可以是待测物本身,也可以是其游离碱或酸,盐或酯l常用的标准物质主要有三种来源:法定标准物质(如ChP标准品或对照品,USP标准品);市售标准物质(来自于具有良好信誉的供应商);或分析实验室或科研机构自行合成和/或纯化的具有一定纯度的化合物n生物介质(biological matrix):生物来源的物质,能以可重复的方式采集和处理;如血浆,血清,尿,粪,各种组织(十一十一)名词解释名词解释2n介质效应(matrix effect):样品中存在除待测物以外的其他干扰物质对响应造成的直接或间接的影响n标准样品标准样品(standard sample):在空白生物介质中加入已知量待测物标准物质制成的样品l用于建立标准曲线,计算质控(QC)样品和未知样品中待测物的浓度 n质控样品质控样品(quality control sample):即QC样品,在空白生物介质中加入已知量待测物标准物质制成的样品l用于监测生物分析方法的效能和评价每一分析批中未知样品分析结果的完整性和正确性(十一十一)名词解释名词解释3n介质控样品池(pool of QC sample):由不负责待测样品(未知样品)测试的人员(独立测试人员)在试验研究的初始制备,并与未知样品在相同条件下同时保存l制备QC样品池时,不能使用制备标准曲线用的标准溶液,应另行制备(独立制备)l需制备额外的QC样品时,应在初始制备的QC样品使用完之前制备,并与初始制备的QC样品同时测定,经检验应无显著性差异n未知样品(unknown sample):亦称研究样品(study sample),是作为分析对象的体内样品(十一十一)名词解释名词解释4n制备样品(processed sample):待测样品经过各步骤(提取,纯化,浓缩等)处理,制成的直接用于仪器分析的试样 n分析批(Analytical run/batch):包括未知样品,适当数目的标准样品和QC样品的完整系列l由于仪器性能的改善和自动进样器的使用,一天内可以完成几个分析批;一个分析批也可以持续几天完成,但连续测量不宜超过3天