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基因工程课件 OOO oooo ooooo oooo ooooo课程内容安排OOO oooo ooooo oooo ooooooooo oooo o o1第一章基因工程概述oooo oooo o o基因工程1第二章 基因工程的载体和工具酶Gene enai neeri na1第三章基因工程的常规技术1第四章基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达1第五章转基因植物湖南师范大学生命科学学院1第六章转基因动物袁婺洲1第七章基因治疗1第八章蛋白质工程教材ooo oooo ooooo 第一章 基因工程概述OOO oooo ooooo oooo ooooo oooo oooo o o参考书与参考资料 000 oooo ooooo oooo ooooo OOOoooooooooooooooooooooooooo o o基因工程的发展简史什么是基因工程 基因工程的开端 基因工程的发展一、基因工程发展简史基因工程的研究意义和应用基因工程在工业领域的应用基因工程在农业领域的应用基因工程在医药领域的应用基因工程课程与其他课程之间的关系 补充材料：关于克隆人的讨论1,什么是基因工程oooo oooo I指采用类似于工程设计的方法，根据人们事凫设计的蓝图，人为地在体外将核酸分子插入质 粒、病毒或其它载体中，构成遗传物质的新组 合(即重组载体分子)，并将这种重组分子转 移到原先没有这类分子的宿主细胞中去扩增和 表达,从而使宿主或宿主细胞获得新的遗传特 性，或形成新的基因产物。又叫遗传工程(genet i c engi neer i ng)或重组DNA技术(r ecombi nant DNA t echni que)。基因工程的概念 患翁OOOO o oI通俗地说，基因工程，是指将一种生物体(供体)的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另 一种生物体(受体)内，使之按照人们的意愿稳 定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程 序，也称为分子克隆技术。|因此，供体基因、受体细胞、载体是重组DNA技 术的三大基本元件。第一章基因工程概述第1页国家理科基地教材。学.，2004年第一版。21世纪高等院校教材，I基因工程，李立家，肖庚富编著，科ooooooooooooooo0000基因工程课件，华东理工大学精品课程，张惠展。技术.基因治疗的原理与实践，杜宝恒主编，2000年天津科学转基因生物安全，曾北危编著，2004年，化学工业.基因工程，孙明主编，2006年，高等教育.年，科学.基因工程，楼士林、杨盛昌、龙敏南、章军编著，2002.基因工程原理，徐晋麟、陈淳、徐沁编著，2007年，科学简明基因工程原理，贺淹才编著，1999.科学.基因工程学原理，马建岗主编,2001年.西安交通大学.基因工程原理，吴乃虎编著,1998,第二版科学.oooooo分子克隆实验指南(III),美国冷泉港，20。2.科学.oooo基因工程的基本步骤1从复杂的生物体基因组中，经过酶切消化ooo 00 OO ooooo OOOO OOOOO oooo OOOOO O3.把重组DNA分子引入到适宜的受体（寄主）细胞 中进行扩增。O 0 ooooooo ooooooo 00000000 ooooooo等步骤，分离带有目的基因的DNA片段，或 用酶学和化学方法人工合成基因。4从繁殖的大量细胞群体中筛选和鉴定已经获得重 组DNA分子的受体细胞的克隆。2 将外源DNA分子（目的基因或片段）与能 够自我复制并且具有选择标记的载体分子在 体外连接，形成重组DNA分子。5从所筛选的受体细胞克隆提取已扩增的目的基因 后，或再将其克隆到表达载体上，导入寄主细 胞，以便在新的背景下实现功能表达，产生人们 所需的物质；或将已扩增的目的基因作进一步的 分析研究。基因工程的流程图基因扩增与研究 基因产品 性状改良与基因治疗基因工程诞生的标志2.基因工程的开端理论上三大发现：遗 传物质是DNA,DNA的 双螺旋结构与半保留 复制机理以及中心法 则的发现。I技术上三大发明：限 制性核酸内切酶及各 种工具酶的发现；载 体分子的研究与发 现；逆转录酶的发现k,.00。-/oooooo 1 972年，P.Berg领导的研究小组，在世界上第一次成功地实 现了DNA的体外重组他们使用限制性核酸内切酶EcoR I,6 体外对猿猴病毒SV40的DNA和X噬菌体的DNA分别进行酶切，然 后再用T4DNA连接酶把两种酶切的DNA片段连接起来，从而获得 了世界上第一个体外重组的杂种DNA分子。他们因此获得1980 年诺贝尔化学奖（同Sanger、Gi I bert分享）。ooooooooooooooo o 1 973年，S.Cohen等人将大肠杆菌的抗四环素的质粒PSC1Q1和鼠伤寒沙门氏菌的抗链霉素和磺胺的质粒RSF1010,在体外 用限制性核酸内切酶EcoRI切割，连接成新的重组质粒，然后 转化到大肠杆菌中，在含四环素和链霉素的平板培养中，选出 了抗四环素和链霉素的重组菌落。这是基因工程发展史上第一 次实现重组体转化成功的实验，基因工程从此诞生了。一转成重 A子 第个化功的组D N分o o ooooooo ooooooo oooooooo ooooooo3.基因工程的发展ooooooo oooooooo oooooooooooooo基因工程的发展：1.1 9727 976年，日本人，somatostat i n（抑促生长素）；2,1 978年，美国人，生长激素基因（HGH）；3.1 980年，美国/瑞士人，a干扰素一基因；4,1 984年，日本人，白细胞介素2（IL-2）；基因工程的腾飞：1.1 982年，美国人，大鼠生长激素基因转入小鼠；2.1 983年，美国人，Ti质粒导入植物细胞（细菌Neor基因）3.1990年，美国人，腺昔脱氨酶（ADA）基因治疗，重度联合免疫 缺陷症（SDID）4,1991年,美国倡导，人类基因组计划llPbp,15年时间30亿USD；5.1 997年，美国人，威尔穆特克隆多利绵羊和转基因波莉绵羊二、基因工程的研究意义和应用oo8888ooooooooooooooo C第一章 基因工程概述 第2页L基因工程在工业领域的应用1.医学：抗病毒、抗癌因子、新型抗生素、疫苗、抗衰老保健品、心 脏血管药物、生长因子诊断剂2.轻工食品：氨基酸、助鲜剂、甜味剂、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、蛋白酶。油脂或脂肪酸等3.能源：石油二次开采、纤维素分解、太阳能转换、乙醇高效生产4.环保：微生物生态种群（石油、农药、尼龙等降解质粒）5.信息：蛋白芯片、基因芯片日本政府称基因工程为战略工业wee?人本为红/彳用可聊3I 0传工餐mi t人nu成h 包LB 1共大规模生产生物活性物质天然细胞分 离 工 程分离工程酶工程工程细胞生物活性物质天然细OOO oooo ooooo oooo ooooo oooo oooo o o包基因工程、，蛋白质工程 途径工程发酵工程 细胞工程孤八和，兴!”、0.xnefi amkm:中“妾赳焦影Mr；S泣虫入体内,。5TL午 品凰琳彩电“11二皿机A，孙狞成女戏ma肯我,姑川以 十员工tl.q m，*“EMT 国版个 3tA：兑！i：JH-二maax亚分。oon nm,-gggc*a1-k M上 3b OOOO7.RRR*=a,二；：g1*1，0 0-WJfq UmD-r1*e.41mA HX.A、*AlEhMg JTYW.JHftl.e4*r rej RWr.-a.心 Rbt，,4UD就3ixAmi xi U _H 1”ram car*,f c.i rr:“3 0MRi 3.、1工”IWXI 1tr 1 Mui U g一 4rwM M:“x=TKtLxau-A、”euWwr llqiax*，XJ美国已批准上市的基因工程药物（续表）ooo oooo ooooo oooo ooooo oooo续*4455开熨小产龙0i rmr?*Cj mzni rrv*GrtrfmGewud*办分IllUulM Sci i h Xli rr.,Itnni外unaixui fi Ki i r*Rmtfj GnUan 3 0u：MdOi CfV Owi，UCKJ 输r JrrF眼MAS：blxc dci,MAU.Li hy,r MAH.r(vCcwoccc 3dlr”小所 啊3_*才 修 FYi i rv“mhxMXJ GoaL*14 4aBm j*48W，年产引HItltrMeea勺而sik#jaLA”，llm/l E3NjB州位.”1bm|腔立NHW充wi ei*MJUKT 1X1*j,HTV田，S打正g生aLtllCI SiKMU丽 tXtri lA、MVi快产士牛产Mgtw+rWi ntWEri Fv.ri cv*gwrv*IFWy1 1MEWtHft.*IWlrXi*一r”._晔工wXT中国已批准上市的基因工程药物（续表）888o5学，/杳MIf Mri rre.ir-1.1-IM M2尸铲m，F斤；rl成型,enil mr Y HIW7 rXH四用化与，ttw而旧工很：二4 r4 1 r。13,域1什堵口小牛 f网KI*i m心c i r制膜;”疗u出*讪肝极加上日iMjWCSF丁IWU-.i*七色也白值nrfK震上，l 附 Al/MEc后IB，RI 小怏10JTW、*“6中色艮式2*4l|由点&wiu*,*l2.基因工程在农业领域的应用OOO 8888o 0000 ooooo oooo oooo o oI第二次农业大革命：1.抗病毒、抗除草剂、抗广谱虫害抗逆 植物等；2.农作物品种改良；高营养、长保存、抗环境压力、花卉颜色与形状；3.畜牧业；高蛋白乳汁、鱼生长激素、饲料利用率4.固氮第一章基因工程概述第3页o c=国已兼Si府:且人大区用转茶区电断1触5feusPKMfi4中b或111IU1种1，；-1997年2月23日,英国的胚胎学家伊恩-维尔穆特右毙。博士报道克隆绵羊多利的诞生；0000ooooI 1 997年2月25日，德国政府官员要求禁止克隆人。加拿大政府官员要求禁止克隆人；I 1 997年2月27日，法国总统希拉克反对将克隆技术 应用于人类；I 1 997年3月5日，阿根廷议会立法禁止克隆人；意 大利卫生部长罗西.槟迪宣布禁止克隆实验；丹 麦暂停克隆研究；I 1 997年3月7日，阿根廷总统卡洛斯.梅内姆下令 禁止克隆人；日本学术审议会禁止为克隆人研究 提供经费；OOO oooo ooooo ooooI 1 997年3月11日，马来西亚政府反对任何企图克量光鸵。人类的尝试；世界卫生组织总干事中岛宏宣称反 对克隆人的研究；欧盟委员会声明反对克隆人。|美国总统克林顿在维尔穆特克隆羊出现后，召集 一群科学家，限他们在90天之内就该不该让“克隆 人”成为可能给出一个答案；|法国总统密特朗在听到杰里.豪关于人体胚胎复 制的消息时曾打电话说：“这个消息令人毛骨悚 然。”I 一波未平，一波又起。1 998年1月6日，美科学家里查德堂而皇之地在美国科学杂 志上公开声明，准备进行克隆人的研究！OOO oooo BOOOO ooo oooo)000)000 o 0I比尔.盖茨说：“当然应该克隆人。如果谁 第一个掌握了这个技术，他就是我真正的、也是唯一的竞争对手。”I英国和俄罗斯也不反对克隆人。克隆人的正面影响I再生人类，抚平丧子之痛 I试管婴儿，不孕者的救星 I冷冻胚胎，优生选择 I代理母亲，借腹怀胎 I复制明星，圆追星梦 I添加基因，创基因贵族 I基因再造，器官移植888oOOOO ooooooooo o o意大利医生塞维里 诺安蒂诺里3/9/02被传说的克隆婴儿OOO法国科学家布里吉特布瓦 瑟利耶2002年12月25日通过 电话告诉法新社，世界上第 一个克隆婴儿“夏娃”已经降 生。03年1月3日她又宣布，第二个克隆人降生。I世界上第一例试管婴 儿名叫露易斯-布朗，是1 978年7月25日在英 格兰诞生的；试管婴儿8888o0000 ooooooooooooo o oi 1 985年4月，我国台湾 也诞生了第一例试管 婴儿；1 988年8月，我 国北京医科大学也报 道了试管婴儿的诞生。第一章基因工程概述第5页克隆人的正面影响再生人类，抚平丧子之痛试管婴儿，不孕者的救星冷冻胚胎，优生选择代理母亲，借腹怀胎复制明星，圆追星梦添加基因，创基因贵族基因再造，器官移植ooooooo 00000000 ooooooooooooooo C冷冻受精卵，筛选胚胎I订做亲爱宝贝-爱丽丝的故事：对冷冻胚 胎的身高，体重，外表，生理及身体的特 征，天生的性格与智能特征，易患复杂及传 染疾病的先天倾向，单一基因严重异常的概 率等作一预测与综合评价，从而决定选择哪 一个受精卵进行胚胎移植。OOO OOOO COOOO OOOO OOOOO QOOO OOOOO O克隆人的正面影响再生人类，抚平丧子之痛 试管婴儿，不孕者的救星ooo OOOO OOOOO OOOO OOOOO OOOO OOOO0 o代理孕母OOOO OOOOO OOOO OOOOO OOOO cooo冷冻胚胎,代理母亲,复制明星,添加基因,基因再造,优生选择 借腹怀胎 圆追星梦 创基因贵族 器官移植i到1 99 6年4月为止，美国比佛利山”代理姬母&暨捐卵中心，已经安排了 456例代理孕母宝宝 的诞生；而在肯塔基州，代理孕母协会也已 安排了500多例宝宝出生。美国的代理孕母 产业方兴未艾，从Inter net网上可找到美 国代理孕母中心公司的网址：ht i d:/www.$ur r ogach.nom上面列有各州代理孕母中介商和全套服务 的经纪商。克隆人的正面影响再生人类,试管婴儿,冷冻胚胎,代理母亲,复制明星,添加基因,基因再造,抚平丧子之痛 不孕者的救星 优生选择 借腹怀胎 圆追星梦 创基因贵族 器官移植ooooooo oooooooo ooooooooooooooo o再生人类，抚平丧子之痛试管婴儿，不孕者的救星 冷冻胚胎，优生选择 代理母亲，借腹怀胎 复制明星，圆追星梦 添加基因，创基因贵族 基因再造，器官移植oooooooo oooooooo O ooooooo ooooooo器官再造艾妮莎.艾亚拉(Ani ssa Ayal a)的故同：1 988年的春天，艾妮莎还是一名高二的学生时，突然患了骨髓淋巴癌。要彻底治疗，必须彻底清 除其原有的骨髓干细胞.换以新的相容的骨髓细 胞。艾妮莎的父母四处奔走，搜寻骨髓捐赠者，但两年的努力均告失败。艾妮莎的45岁的父亲与 42岁的母亲决心与命运一博，再度怀孕，于199。年4月生下了艾妮莎的妹妹玛瑞莎。14个月以后，妹妹与姐姐做了骨髓移植手术，艾妮莎终于健康 地活下来了。ooooooo oooooooo ooooooooooooooo o克隆人的负面影响I社会问题：基因父母，生父母，养父母I伦理问题：妈妈还是姐姐或？I人的价值问题：买卖的商品而非爱的结 晶？个性的发挥等。I人的进化问题I预防犯罪oo8888ooooooooooooooo c第一章 基因工程概述 第6页第二章基因工程载体和工 具酶湖南师范大学生命科学学院 袁婺洲o o ooooooo ooooooo oooooooo ooooooooooooooo oooooooo o ooooooo ooooooo本章目录22221载体1.1质粒载体1.2 噬菌体载体1.3 其他载体2.2工具酶2.2.1 限制性核酸内切酶2.2.2 DNA聚合酶和KI enow大片段2.2.3 DNA连接酶2.2.4 碱性磷酸酶2.2,5 末端脱氧核昔酸转移酶载体的功能及特征ooooooo ooooooo oooooooooooooo ooooooo oooooooooooooo oo o第二章基因工程载体和工具酶第一节载体o运送外源基因高效转入受体细胞O为外源基因提供复制能力或整合能力O为外源基因的扩增或表达提供必要的条件ooooooo克隆载体应具备的条件O具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）O具有与特定受体细胞相适应的复制位点整合位点O具有较高的外源DNA的装载能力O具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点O具有合适的筛选标记ooooooooo o ooooooo oooooooI细菌染色体外的遗传因子，闭合环状双链DNA 大小：1-200k b能自主复制，但要利用寄主细胞复制染色体的同 一组酶系复制分松弛型和严谨型两种松弛型：10200拷贝（加氯霉素扩增）严谨型：1-10拷贝|有某些基因，如抗药性基因，对寄主的生长是有 利的天然质粒o o ooooooo ooooooo oooooooo ooooooo0 O ooooooo ooooooo质粒D N A的存在状态L 1 UN*Uj-:.E/eK包”A4%”If-.i r-s*!：.“，:3 l 1,L 4 N (oouoooo oooooooo oouooooooooooo0 o第二章基因工程载体和工具酶第1页质粒的基本特征1.质粒的自主复制性：ooooooooooooooColE1.pMB1,pSC101等不同启动子pMB1质粒DNA复制启动控制 松弛型质粒启动子的突变Pcop cop P/Orep rep ori质粒的基本特征2.质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于 一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。以大肠杆菌的质粒为例：i ColEK pMBI拥有相似的复制子结构，彼此不相容i pSCIOK F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相容o o ooooooo ooooooo oooooooo ooooooo质粒的基本特征3.携带特殊的遗传标记：抗生素标记基因1）氨玉青霉素抗性基因2）四环素抗性基因3）氯霉素抗性基因4）卡那霉素和新霉素抗性基因5）I acZ基因（a互补显色，载体上I acZ，产物的N端 14Qaa,为。片段，宿主染色体或F因子上N端突变的I acZ AM15的3或B片段，互补显色。互补宿主有 JM101JM103,JM105,JM109.NM522 等变异的大肠杆菌）o o ooooooo ooooooo oooooooo oooooooLac Z基因的显色原理:IPTG：计内距pQ或代.乳他行 也与ItlX-gal：5-浪7武-3叩味小D-T乳樵什 底物I生色泌口冲孔插介型分睥X-剑形成瑟日、物ooooooo ooooooo oooooooo oooooooo o(1)补.c complementationl.ac/，因的扑5 galact osidase IO24aa（X一匕,补，a-c ompiement ulion）a.-./m.im、口”.,、卜 m.mi（中1心川）卜，丁三型匕1二拉双是mir,H-j p-产乳的TM阴J内飞史伟乙问半见为补I：.i nserti on vector（一）插入型载体ooo OOOO OOOOO ooco OOOOO OOOOClcavo.I 屯 aleNormal 入 DNA C4U k bjj k tnserti on vector!35-40 k b)Non-essenti al regk ri(b)ZfltlODolcocn(c)XZAPIIJ41 k befeli cro o 0000-ooooooo ooooooo/ac年因编码0-半乳糖苦酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到/acZ基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体QDNA则产生蓝色透明斑二)W-j奂 空 i-!L_ _cos(cnlral stuffcr c朵含入DNA和II?匕外源l）NA.在Ch a r on4 载体中克隆 外源DNA-A!二)i U二 A3.Ml3单链噬菌体0 o M13噬菌体的生物学特性：生物结构i M13噬菌体的外型呈丝状I M13噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成才i M13噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长片I M13 DNA全长6407个核甘酸i M13 DNA上至少有10个基因/22700个外壳蛋白分子第二章基因工程载体和工具酶第5页大肠杆菌的Ml 3单链噬菌体DNAQoooooo M13 DNA载体的构建：i III VI I IV II X V VII IX野生型 M13RF-DNA I VIII Ii III VI I IV II X V VII IXM13mp系列载体|VIII II II I polyli nk er lacZooooooo4.柯斯质粒c osmidi 1 978 年由 Col I i ns 和 Hohn 改建正常的质粒与噬菌体的cos位点构成有Amp,Tet抗性基因|Co$位点可识别噬菌体的外壳蛋白，可被包装o o ooooooo ooooooo oooooooo ooooooo柯斯质粒（cosmi d）的结构ooooooo oooooooo oooooooo o ooooooo柯斯质粒载体的特点:o o ooooooo ooooooo o o o o o o o o ooooooo1.8 k b的QDNA片段+pBR322片段装载范围为31-45 k b能像QDNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞能像质粒那样在受体细胞中自主复制重组操作简便，筛选容易装载量大（45 k b）且克隆片段具有一定的大小范围不能体内包装，不裂解受体细胞5.人工微小染色体 YAC,yeast arti fi ci al chromosome BAC,bacteri a arti fi ci al chromosomei PAC,P1 arti fi ci al chromosomei MAC,mammal cell arti fi ci al chromosomei Fosmi d,F因子改建而来ooooooo0000000酵母人工染色体（YAC）YAC载体应含有下列元件：酵母染色体的端粒序列 酵母染色体的复制子 酵母染色体的中心粒序列 酵母系统的选择标记 大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的选择标记0 o ooooooo ooooooo o o o o o o o o oouoooo第二章基因工程载体和工具酶第6页酵母人工染色体的应用I*切&|,二C:.一 JGltMti nsa i nBa m Atli li ci Ml Cbrnanai ai ai i a Cfoooooooooooooooo o 088888。克隆载体的发展历史:第一代:环状质粒，装载几个到十几个k b片段;第二代：经过改建的病毒，装载能力2 Ok b左右;第三代:cosmi d,装载能力30-40k b;第四代：YAC,装载能力1-2 Mb;ooooooo ooooooo ooooooo第五代：新型载体：BAG,PAC,MAC,Fosmi d等，装载能力 80-200k boooooooo oooooooooooooo ooooooo6,穿梭质粒载体(sh ut t le pl a smi dv ec t or)是一类由人工构建的具有两种不同复制 起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主 细胞中存活和复制的质粒载体。大肠杆 菌-酿酒 酵母穿梭 质粒载体郝而肾细胞o o OQOOOOO7.II1.2.3.表达载体表达载体是将目的基因在人工控制下置于生物宿主中大量:的载体.表达载体三个系统：oooooooo 0000000产o O ooooooo oooooooDNA复制及质粒DNA的筛选：有DNA复制起点ori,及Amp,Tet抗 性基因目的基因的转录:这一系统包括启动子,抑制物基因和转录终止子.启动子位于目的基因的上游，常用的如Placz等.蛋白质的翻译:包括核糖体识别位点SD,翻译起始密码子和终止密 码子.I属于PDS质粒家族I大肠杆菌T5启动子和转录终止信号I表达的蛋白带有一个六聚 组氨酸接头GEX-4T-1原核表达 载体：I具有可高效诱导表达的 tac启动于；I采用温和洗脱条件可将 融合蛋白从亲和介质中 洗脱下来，最大限度减 少对蛋白活性的影响；I具有专一性的凝血酶识 别位点，可从融合产物 中得到纯化的目标蛋白含有氨茉青霉 素抗性的 pDNA3.1(-)真 核表达质粒第二章基因工程载体和工具酶第7页pFCPP.I、,“：htltwi mli urGbnLar-.:，），心5FM与 oCaBcfi卷兜 A表达载体与目的基因的连接o o ooooooo ooooooo oooooooo oooooooftoBlKI.加强GF P表达的 哺乳动物细胞 融合蛋白表达 质粒；HK-K 所PECFP4HX7k liI|I 12-iL、j vci rt Ja;河七工:蜀r；图 pWncwHnt SK 唯齿粒假体的分子智柯示意图.f；K表不多 克隆拉点区的一种双向，口117.息是按属S.“一KpuT的方直转余.(-1-)十年镣联电体fl复制2M的的神*1反的麻向.fl+J有点表东/WHuExi pi邛碍枇双体怅刖刁体夫感染乔丰拙.归H,能郛回收到 辰7出氏的。匚文*i i fffi 由点勉衣示与刖121|,城川九使体与mj 直体开感生奇土制UII-J,可问收到麻福因的无值洋帆,，质粒DNA的纯化I RNA酶去RNAI SDS-蛋白复合物蛋白酶K去蛋白质酚氯仿抽提纯化试剂盒|紫外分光光度计测A260与A280值：14或20o o ooooooo ooooooo质粒DNA提取的策略I质粒DNA的提取细菌细胞破碎一碱使染色体DNA变性-一一离心分离.收集质粒DNA-纯化.保存|真核细胞DNA的提取研磨使细胞破碎蛋白酶K去核蛋白一分离蛋白质与DNA.纯化-沉淀.纯度检测o o ooooooo ooooooo oooooooo ooooooo质粒DNA沉淀二倍体积的无水乙醇与DNA相混合。使乙醇的终含量占 6 7%左右。室温静置30分钟。乙醇沉淀时，加NaAc or NaCI至终浓度为(M-0,25M,是 为了中和DNA分子在碱性条件下所带的负电荷，减少DNA 分子同性电荷的相斥力。06倍体积的异丙醇沉淀，-20。C半小时。o O ooooooo ooooooo o o o o o o o o oooooooDNA分离I琼脂糖凝胶电泳I聚丙烯酰胺凝胶电泳I氯化钠密度梯度离心ooooooooooooooDNA浓度检测0 o ooooooo ooooooo o o o o o o o o oouoooo|琼脂糖凝胶电泳0.05-0.Ipg|EB标准DNA浓度比较：1 ng 紫外分光光度计测A260:0.1-1 i deal,0.05-1.5 accepted纯度：分光光度计不但能确定核酸的浓度，还可以通过 A260/A280估计核酸纯度。纯DNA其比值为1.8,纯RNA为2.0。如比值高于1.8,说明DNA样品中含RNA,而样品中的酚和蛋 白质将会导致比值降低。第二章基因工程载体和工具酶第8页DNA大小测量凝胶上与标准分子量比较I X Hi ndlll 1OObp ladderi自己的mark erooooooo ooooooo oooooooo o忸 2 1 俱化乙版外的化*纳和段什干M福人作P隼*什JweHE*v MIlli!(I II I；i H!I II H IHi II，知的5rsNi 史mLdU在紫外透射仪下看DNA时，DNA亮度与哪些国 关？COO娶君。Oo OOOO OOOOo oooooooo ooooooo oooooooooooooo oo oDNA浓度 DNA大小 波长 纯度 EB量等有关第二章基因工程载体和工具酶第二节工具酶oooooooooooooooo O ooooooo oooooooI用于核酸操作的工具酶I限制性核酸内切酶I DNA连接酶I DNA聚合酶|碱性磷酸酯酶|末端转移酶1.限制性核酸内切酶识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链1 968年，Smi th等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出Hi nd II 和Hi nd 111主要存在于原核细菌中，细菌的限制与修饰作用，帮助细菌限制外来DNA的入侵oooooooo oooooooooooooooooooooo o限制性核酸内切酶的命名u o ooooooo ocuoooo oooooooo ooooooo限制性核酸内切酶的种类0 o ooooooo ooooooo oooooooo ooooooo属名 种名 株名 Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株 Hind III Eco R IEscher ichia coli Ri同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶 1 986年，615种限制酶,98种甲基化酶；1 998年,1 0000种细菌或古细菌中存在3000种酶；|2005年1月，共发现4342种限制酶和甲基化酶，其中限制酶有 368 1 种，|商业化的限制醐有588种，在II型限制酶中共有221种特异性。第二章基因工程载体和工具酶第9页限制性核酸内切酶的分类OOOOOOOOOOOOOO主要特性1型H型III型限制修饰多功能单功能双功能蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子ATP Mg2+SAMMg2+ATP Mg2+SAM识别序列TGAN8TGCT回文对称序列GAGCCaacn6gtgcCAGCAG切割位点距识别序列1 k b处识别序列内或附近距识别序列下游随机性切割特异性切割24-26bp处II型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构EcoR I的切割位点 EcoR I的识别序列 51.GCTG AATTCG AG.3 3.CG ACTT A AG CTC.5Io oOOOOOOO OOOOOOO oooooooo OOOOOOOO 0OOOOOOO 0000000 O00OOO00 OOOOOOO回文诗及回文对联I湖北咸丰县有一首万柳堤即景回文诗：春城一色柳垂新，色柳垂新自爱人。人爱自新垂柳色，新垂柳色一城春。I回文对联雨滋春树碧连天；天连碧树春滋雨。I回文绝句明德昭远道，远道化德明；明德化道远，道远昭德明Ec oRI等产生的5,粘性末列51.G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G.3 I I I I I I I I I I I I3,.C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C.5EcoRI 37 5,.G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-GIlli Illi3,.C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C退火4-7 n OH P5,.G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G.3 I I I I I l I I I I I I3,.C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C.5I I P OHo O 0000000 0000000Pst I等产生的3,粘性末端 I 5,.G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G.3I I I I I I I I I I I I3C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C.5*Pstl 37 JJ5,.G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G.Illi Illi3,.C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C.OOOOOOOOOOOOOO o o o o o o o oOOOOOOOo o退火4-7 OH P5,.G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,I I I I I I I I I I I I31.C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5 P OHPv uII等产生的平头末端I5.G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G.3 I I I I I I I I I I I I31.C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C.5 IPvuII 37 口51.G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G.3 I I I I I I I I I I I I3,.C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C.5u OOUOOOOO 0000000 0O0OOOO0 0O0OOOO限制性核酸内切酶酶切位点出现频率44=25646=4096OOOQOOOOOOOOOOngQ，I H,unAM ua r r o iiM(r 3uer im Jg和做氟游f 副学马巾一x.R等线乳0#.第二章基因工程载体和工具酶 第10页OOOOOOOOOOOOOOO同裂酶（同切点酶）：来源不同，识别顺序相同或相近，切割序列相同，产生相同或 不同的粘性末端。或者说：不同来源的限制酶可以切割相同 的序列。o O 088888。同尾酶：来源各异，识别靶序列各不相同,性末端。OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOo o Sau3A I:S%ATC-3 3，-CTAGf 5I i BamH I:5-GG&TCC-3i 3-CCTAGG-5II i Bgl II:S-AGATCT-3i 3CTA25i BamH I:S-GATCC-Si 3-CCTAG-5影响限制性核酸内切酶活性的因素i DNA的纯度（蛋白质、酚、氯仿、EDTA、SDS高浓度的盐 离子等）i DNA的甲基化程度|酶切消化反应的温度i DNA的分子结构|限制性核酸内切酶的缓冲液OOOOOOOO OOOOOOOo o OOOOOOO OOOOOOO影响限制性核酸内切酶活性的因素1.DNA样品的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA,SDS、NaCI等i加大酶的用量，l.gDNA用10U酶i加大反应总体积i延长反应时间OOoooooo影响限制性核酸内切酶活性的因素：2,缓冲液Tri s-HCI 50 mM pH 7.5MgCI2 10 mM 0-50 mM 低盐酶NaCI 0-150mM J 100 mM 中盐酶DTT 1 mM L 150 mM 高盐酶Volume 20-100 glTT 37 0C 1-1.5 hr1U核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1 mg 标准DNA所需的酶量OOOOOOOOOOOOOOOo o 0000000 OOOOOOOGooo00000000_ _基阳也皆醐内切s氏一堂,夕相寂ra_ QA 1 一H VTQ!WOIOCti uiW!19VHIMOH-rICMlM*1 MHrTTS论 IUUIIIIletH ijitc；7.5 r 17.9o 0000 oOOOOOOO OOOOOOO OOOOOOOO OOOOOOOII型核酸内切酶的多酶联合酶解对盐浓度要求不同的酶,可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐醐再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切U OOOOOOOO OOOOOOO OOOOOOOO OOOOOOO第二章基因工程载体和工具酶 第11页2、DNA连接酶i作用：负责双链DNA中相邻3、-0H与5、-磷酸基团之间的磷酸二 酯键的形成。o o0000000 0000000 00000000 0000000平头双链DNA片段的连接操作i粘性末端的连接属于分子内部的连接Qoooooo0000000只能连接切口（ni ck or ni k e）不能连接缺口（gap）KMT-X平头末端的连接则属于分子间的连接提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会平头末端人工粘性末端的连接0000000 00000000 0000000o o 0000000同种内切酶生产的粘性末端的连接TdT dTTP TdT dATPGTTTTTTTTTT 3 Cl G|CAAAAAAAAAA 3,C 3 TTTTTTTTTTG I 3 AAAAAAAAAAcI G5 I GAATTC I GAATTCII CTTAAG I CTTAAGl I 5EcoRI5 AATTC I G 5 AA1AA 5 G I CTTAA 5o o0000000 0000000 00000000 0000000退火 J.T4-DNA连接酶OGTTT