急性加重期支气管扩张患者下呼吸道菌群解析.pdf

中国科技期刊数据库 医药 73 急性加重期支气管扩张患者下呼吸道菌群解析 林 琼 福建医科大学附属福州市第一医院呼吸与危重症医学科，福建 福州 350009 摘要：摘要：目的 本研究利用 16SrRNA 基因测序技术对急性加重期支气管扩张患者的肺泡灌洗液特定的基因片段进行测序，对急性加重期支气管扩张症患者下气道细菌微生物群落的组成进行定性、鉴别。研究急性加重期支气管扩张症患者的细菌多样性和丰富程度，可能有助于更好地对该疾病的临床治疗提供可靠参考。方法 选取我院从 2019年 1 月至 2021 年 1 月期间收治的急性加重期支气管扩张患者和同时间收治的非急性加重期支气管患各 60 例为研究对象。通过利用 16SrRNA 基因测序技术对急性加重期支气管扩张患者的肺泡灌洗液特定的基因片段进行测序，比较两组受试者的下呼吸道菌群变化。结果 在门水平条件下，对照组下呼吸道菌群在多样性方面预研究组相比有一定差异，差异具有统计学意义(P0.05);对照组和研究组在拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门方面具有显著差异，差异具有统计学意义(P0.05)，对照组和研究组在属水平方面，研究组在不动杆菌属、窄食单胞菌属、链球菌属、棒状杆菌属等方面预对照组之间有显著差异(P0.05)。而对照组在肺炎链球菌、类白喉杆菌、乳杆菌等占比方面明显高于研究组，与研究组具有显著差异(P0.05)。结论 急性加重期支气管扩张症患者下呼吸道菌群多样性较非急性加重期支气管扩张症患者下降，急性加重期支气管扩张症患者下呼吸道病原菌以鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌为主。关键词：关键词：16S；rRNA；基因测序；急性加重期支气管扩张症；链球菌属；棒状杆菌属 中图分类号：中图分类号：R563.9 临床研究发现，由于支气管扩张具有病程长、病变不可逆等特点，特别是患者容易发生反复的感染等情况而被临床上重点关注。临床研究发现广泛性支气管扩张在一些特定情况下可损害患者的肺组织和功能，造成严重的后果，该疾病如不能进行及时有效的治疗将严重影响患者的生活质量，危害患者的生命健康。其急性加重是患者入院治疗的主要原因。而抗感染是治疗支气管扩张加重的首要原则，尽早明确感染病原体种类可指导临床早期正确地选择抗生素治疗。目前很多研究证实菌群结构和功能跟宿主生理功能和机体状态密切相关。菌群平衡的打破是疾病发生的基础同时又是其主要表现形式。本次研究利用 16S rRNA 基因测序技术对急性加重期支气管扩张患者的肺泡灌洗液特定的基因片段进行测序，对急性加重期支气管扩张症患者下气道细菌微生物群落的组成进行定性、鉴别。研究急性加重期支气管扩张症患者的细菌多样性和丰富程度，可能有助于更好地理解急性加重的支气管扩张患者的临床意义及可能支持制定抗菌治疗指南。方法如下所示。1 资料与方法 1.1 一般资料 取我院从 2019 年 1 月至 2021 年 1 月期间收治的急性加重期支气管扩张患者和同时间收治的非急性加重期支气管患各 60 例为研究对象。其中将急性加重期支气管扩张患者分为研究组，其中男 39 例，女 21 例，研究组患者年龄均在 15 至 88 岁之间，平均年龄 52.114.5 岁；研究组患者病程均在 1 至 40 个月之间，平均病程 8.62.1 月。将非急性加重期支气管患患者分为对照组，患者中男 35 例，女 25 例，对照组患者年龄均在 15 至 84 岁之间，平均年龄 55.410.2 岁.对照组患者病程均在 1 至 41 个月之间，平均病程 8.62.0 月。两组患者在性别、年龄、病程方面无差异,具有可比性。1.2 纳入标准 根据我国成人支气管扩张症诊治专家共识进行诊断：结合患者长期慢性咳嗽、咳痰，或伴反复咯血或喘息病史；听诊闻及湿性啰音等体征；相关实验室检查进行综合分析诊断，HRCT 是主要的诊断手段。1.3 排除标准 a 年龄18 岁；b 牵拉性支气管扩张；c 肺切除 中国科技期刊数据库 医药 74 术后；d 伴有胸廓、胸膜疾病；e 无法行气管镜检查。1.4 研究方法 标本采集：支气管肺泡灌洗液标本的采集步骤，支气管镜操作按照常规检查进行。受试者麻醉充分后仰卧位平躺于检查床上。操作者将纤维支气管镜经受试者鼻腔送入，到达经胸部 CT 扫描证实为支气管扩张部位，从病灶的两个或两个以上节段收集 BAL 液。由助手连接无菌管并向支气管镜内注入50ml无菌生理盐水（0.9%），由操作者回收支气管肺泡灌洗液，重复上述操作 2 次，即共注入,150ml 生理盐水（最终注入生理盐水的量根据受试者身体状态及反应而定，必要时终止检查），留取肺泡灌洗液标本于无菌管中。将所取得的 BAL 样品被分成两个单独的瓶子：一个样品被处理用于定性和定量培养；另一个是冻结在-80C 内 1 小时进行后续的分子分析。1.5 数据处理 本研究中的所有数据均采用统计学软件SPSS25.0版执行。对计量资料如符合正态分布采用（s）表示，组间的比较采用单样本方差检验，两两比较采用 t 检验，组间比较采用非参数检验。组间总体分布差异比较采用2 检验，以 P0.05 认为差异具有统计学意义。2 结果 2.1 门分类水平两组菌群丰度比较 在门水平条件下，对照组下呼吸道菌群在多样性方面预研究组相比有一定差异，差异具有统计学意义(P0.05)。具体情况见下表 1 所示。2.2 属分类水平两组菌群丰度比较 在属水平方面，研究组与对照组相比在不动杆菌属、窄食单胞菌属、链球菌属、棒状杆菌属等几个方面亦存在明显差异。具体情况见下表 2、3、4 所示。3 讨论 临床研究显示非囊性纤维化支气管扩张症是一种目前在临床上最为常见的呼吸系统疾病之一，该疾病的主要临床提特征是会诱导患者反复的发生支气管炎症，进而会导致患者的支气管壁结构发生破坏，导致患者的支气管异常并发生支气管持久性扩张1。该疾病的主要临床症状为慢性咳嗽、咳大量浓痰和(或)反复 x表 1 门分类水平两组患者菌群丰度比较（s）组别 变形菌门 厚壁菌门 软壁菌门 拟杆菌门 梭杆菌门 酸杆菌门 蓝藻门 研究组 89.2310.23 10.332.61 0.350.03 1115325 2.350.36 1.510.65 1.100.32 对照组 23.664.55 36.657.82 5.610.65 10.353.65 2.220.32 1.320.62 1.210.45 t 7.584 8.632 8.254 0.652 0.684 0.452 0.361 P 0.000 0.000 0.000 0.568 0.541 0.714 0.842 表 2 属分类水平两组患者菌群丰度比较（s）组别 不动杆菌属 窄食单胞菌属 假单胞菌属 链球菌属 棒状杆菌属 伯克霍尔德菌属 蓝细菌属 研究组 40.1510.54 31.257.52 5.620.85 5.211.25 0.650.30 0.620.12 0.550.21 对照组 5.622.01 0.650.05 1.650.04 21.014.65 8.212.32 0.680.21 0.650.15 t 8.541 8.214 6.325 8.147 7.584 0.411 0.546 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.758 0.554 表 3 门分类水平两组患者菌群丰度比较（s）组别 乳杆菌属 无色杆菌属 沙雷菌属 类杆菌属 支原体属 肠杆菌属 梭杆菌属 肠球菌属 研究组 1.230.23 0.330.05 0.520.14 0.310.02 1.210.54 0.650.05 0.140.06 0.650.08 对照组 1.660.55 2.650.35 0.510.21 1.360.21 3.251.21 0.650.08 1.350.24 1.210.44 t 0.354 5.321 0.321 0.841 0.684 0.441 0.332 0.354 P 0.847 0.000 0.874 0.471 0.547 0.754 0.831 0.847 xxx中国科技期刊数据库 医药 75 咯血。如果前期不能进行及时有效的治疗，患者可能会随着疾病的不断发展最终可导致患者发生呼吸功能障碍或者发生心源性心脏病的概率显著增加2。虽然现在临床上对引起目前该疾病的具体发病机制尚未被研究透彻，但目前临床上有许多学者提出了该疾病的发生发展是“恶性循环”的原因导致的观点3，该观点认为患者发生反复感染或者持续性慢性炎症为及时有效的进行治疗，或者患者患有进行性的肺组织损伤之间所形成的恶性循环。形成一个周而复始的恶性循环。这种恶性循环，构成了一个复杂、慢性而持续的交互作用，从而导致支气管扩张发病及病程迁延进展。可引起支气管扩张的原因有：大气道先天发育异常、异物与误吸、既往存在下呼吸道严重感染、结核和非结核分枝杆菌感染、免疫缺陷性疾病、结缔组织病、炎症性肠病、纤毛功能异常等等。国内支气管扩张最常见的病因为特发性、感染后和免疫缺陷4；感染后支气管扩张，特别是结核感染可能为我国主要的病因5。越来越多的学者认识到细菌感染在支气管扩张症发病及急性加重中起着不可忽视的作用。一些细菌种类与支气管扩张症下气道感染有关。反复的下呼吸道感染是支气管扩张症反复急性加重和入院治疗的重要原因。越来越多的证据表明，健康人的肺不是无菌的，且肺部微生态菌群对肺部健康和肺疾病均起作用6。这些研究结果得益于分子生物学技术的发展、基因组研究方法的突飞猛进，使得我们可直接从微生物生活的环境中采样并基于其各自特异性的的遗传特征识别微生物类别，并对其复杂群落中的作用进行功能注释7。这些发现使得人们对肺部疾病理解逐渐由传统的单种病原菌向微生物群落失调方向转化。尽管微生物宿主关系在感染性疾病的发病机制和进展中的重要性，但这些方法尚未应用于支气管扩张患者的肺微生物组的定义8。下呼吸道微生物菌群改变也可能存在于支气管扩张急性加重期患者。传统的培养方法鉴定出了铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、肺炎球菌、金黄色葡萄球菌和卡他莫拉菌。上述研究表明，针对支气管扩张急性加重期患者的下呼吸道微生态研究是有必要的，且下呼吸道微生态作为人体微生态的一部分，这项研究极有可能对急性加重期支气管扩张患者的疾病发生、发展及治疗起重要作用。本研究采用与培养无关的、基于DNA的分子技术，16S rRNA 基因测序技术对急性加重期支气管扩张患者支气管肺泡灌洗液特定的基因片段进行测序，将测序信息与相应的数据库进行注释，研究急性加重的支气管扩张症患者的细菌多样性和丰富程度。可能有助于更好地理解急性加重的支气管扩张患者的临床意义。目前有关人下呼吸道微生态的研究主要集中在肺囊性纤维化病、支气管哮喘和慢性阻塞性肺疾病等慢性肺部疾病，而对支气管扩张患者下气道细菌微生物群落研究较少，本研究同时具备学术思想及研究内容的先进性。以往研究多采用痰液作为检测标本，而痰液标本极易受口腔和上呼吸道定植菌污染，影响结果判断。有研究认为痰和诱导痰是上支气管树（主要指支气管分叉以上气管）样本，其菌群并不代表下支气管树粘膜菌群，并且支气管肺泡灌洗液标本显示的结果最接近于支气管粘膜的结果。本研究通过收集急性加重期支气管扩张患者支气管镜 BAL 样本，BAL 样本是该疾病人群肺部微生物态的一个特别准确的反映。本次研究结果显示：在门水平下，对照组下呼吸道菌群在多样性方面预研究组相比有一定差异，差异具有统计学意义。对照组和研究组在拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门方面以及在不动杆菌属、窄食单胞菌属等方面与对照组相比有显著差异。而对照组在肺炎链球菌、类白喉杆菌、乳杆菌等占比方面明显高于研究组，与研究组具有显著差异。综上所述，急性加重期支气管扩张症患者下呼吸道菌群多样性较非急性加重期支气管扩张症患者下降，急性加重期支气管扩张症患者下呼吸道病原菌以鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌为主。表 4 属分类水平两组患者菌群丰度比较（s）组别 普雷沃菌属 葡萄球菌属 卟啉单胞菌属 变形杆菌属 研究组 0.250.02 0.330.08 0.030.001 0.330.05 对照组 1.650.05 1.650.54 2.140.87 0.000.00 t 7.654 5.365 8.014 6.325 P 0.000 0.000 0.000 0.000 x中国科技期刊数据库 医药 76 参考文献 1亓倩,汪雯,李陶,等.成人支气管扩张症的临床特点J.山东大学学报(医学版),2015(7):68-86.2蔡柏蔷,何权瀛,高占成,等.成人支气管扩张症诊治专家共识(2012 版)J.中华危重症医学杂志(电子版),2012(5):315-328.3李詝,李久荣,高金明.北京协和医院 136 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