蒺藜皂苷胶囊的特征图谱研究.pdf

人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 缘 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期蒺藜皂苷胶囊是长白山制药股份有限公司生产的独家品种袁以中药材蒺藜渊Tribulus terrestris L.冤为原料袁采用大孔树脂吸附技术进行分离纯化袁经减压干燥制成的中药制剂袁具有活血化瘀尧通经活络等功效1袁用于中风病中经络渊轻中度脑梗死冤恢复期风痰瘀阻证的治疗遥 本研究建立蒺藜皂苷胶囊的HPLC 特征图谱袁得到的蒺藜皂苷胶囊色谱峰分布均匀袁蒺藜皂苷K 参照峰与相邻峰分离度良好袁 色谱峰信息完整袁对保证该制剂的质量具有重要意义遥1 材料与仪器1.1 样品信息蒺藜皂苷胶囊渊长白山制药股份有限公司冤遥1.2 材料与仪器岛津LC-20A 高效液相色谱仪渊ELSD6000 蒸发光检测器冤曰 岛津LC-20AD 高效液相色谱仪渊SPD-20A 检测器冤曰岛津LC-20AD 高效液相色谱仪渊SPD-M20A 检测器冤曰岛津LCMS-8040 液质联用仪曰岛津VP-ODS 色谱柱渊250mm伊4.6 mm伊5 滋m冤遥1.3 试剂与试药色谱纯乙腈渊Acetonitrile冤院HPLC grade袁fisherscientific曰色谱纯甲醇渊Methanol冤院HPLC grade曰蒺藜皂苷K渊中国食品药品检定研究院冤曰蒺藜皂苷D渊中国食品药品检定研究院冤遥2 色谱条件与系统适用性试验2.1 检测器及色谱条件的初步筛选蒺藜皂苷胶囊成品为蒺藜药材经过醇提尧大孔树脂精制等工艺得到的产品遥据文献报道2袁蒺藜中富含甾体皂苷类尧黄酮类等化学成分袁这两类成分是蒺藜的主要活性成分遥甾体皂苷类化学成分由于结构的特征袁一般在紫外区的末端有吸收袁结合近几年指纹图谱和特征图谱的文献袁多数采用紫外检测器检测袁故优先采用紫外检测器进行方法研究遥经过实验研究袁初步确定蒺藜皂苷胶囊的紫外检测器色谱条件为院 岛津VP-ODS 渊250mm 伊 4.6 mm伊5滋m冤色谱柱袁检测波长205 nm袁柱温25益袁流速1.0ml/min袁进样量10 滋l袁以乙腈为流动相A袁0.05%磷酸溶液为流动相B袁进行梯度洗脱遥 结果表明袁在确定的紫外检测器实验条件下袁蒺藜皂苷胶囊呈现较多的色谱峰袁也具有一定的野特征性冶袁但在该条件下袁未检测出蒺藜皂苷D遥 蒺藜皂苷K 峰虽有吸收袁但在末端波长下袁基线易受流动相和溶剂影响袁结合到现行蒺藜皂苷胶囊质量标准中袁采用蒸发光检测器对蒺藜皂苷K 和蒺藜皂苷D 进行含量测定控制袁故采用蒸发光检测器建立HPLC 指纹特征图谱遥2.2 色谱条件的确定2.2.1 流动相的初步筛选未查阅到蒺藜皂苷胶囊指纹特征图谱相关文献袁试验起始阶段采用通用色谱梯度对流动相进行选择遥分别以甲醇尧乙腈为流动相A袁以纯水为流动相B袁进行梯度洗脱遥 结果表明袁乙腈-水比甲醇-水系统的洗脱能力更强袁且由色谱图可知袁乙腈-水系统的流动相梯度袁在乙腈比例达到50%左右渊38 min冤完全呈现了本品的化学成分色谱峰袁相对于甲醇-水系统渊80%甲醇袁66 min冤调整空间更大袁故选用乙腈-水为流动相做进一步筛选遥2.2.2 流动相组成的确认以乙腈为流动相A袁 分别以2%异丙醇尧0.05%二乙胺尧0.1%三氟乙酸尧2%四氢呋喃尧0.1%甲酸尧水溶液为流动相B袁岛津VP-ODS 色谱柱渊250mm 伊 4.6 mm伊5滋m冤袁柱温25益袁流速1.0 ml/min 进行洗脱遥 结果可知袁流动相为乙腈-0.1%甲酸尧乙腈-0.1%三氟乙酸时比其他5 个流动相系统色谱峰个数更多袁 故选择乙腈-酸为流动相组成袁考虑到三氟乙酸酸性太强袁初步确定以乙腈-0.1%甲酸对洗脱比例进行优化遥在洗脱比例进行优化过程中袁考察不同浓度的甲酸对色谱峰的影响袁用岛津VP-ODS 色谱柱渊250mm伊4.6 mm伊5滋m冤袁对乙腈-0.05%甲酸尧乙腈-0.1%甲酸尧蒺藜皂苷胶囊的特征图谱研究王贵洲袁蔡利剑袁刘 磊袁韩大勇袁陈连香袁李丹袁铁 芳袁庞小欧袁范存刚袁周振秋袁李 影渊长白山制药股份有限公司 窑 吉林 吉林 窑 132500冤摘要院目的应用高效液相色谱法(HPLC)建立蒺藜皂苷胶囊特征图谱遥 方法以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂渊250 mm 伊 4.6 mm 伊 5 滋m冤曰柱温30益曰流速1.0 ml/min曰以乙腈为流动相A袁以0.1%甲酸为流动相B袁 进行梯度洗脱曰 用蒸发光检测器检测袁 理论板数按蒺藜皂苷K 峰计算应不低于75000遥 结果建立蒺藜皂苷胶囊的HPLC 特征图谱袁得到的蒺藜皂苷胶囊色谱峰分布均匀袁蒺藜皂苷K 参照峰与相邻峰分离度良好袁色谱峰信息完整遥 结论该方法操作简单尧稳定可靠尧精密度高尧专属性强尧分离度好袁为蒺藜皂苷胶囊的质量控制提供了依据遥关键词院蒺藜皂苷胶囊曰高效液相色谱法曰特征图谱基金项目院吉林省科技发展计划项目袁项目编号院20210204208YY遥作者简介院王贵洲袁男袁高级工程师尧主要从事中药制药尧药用植物研究遥DOI院10.19403/ki.1671-1521.2023.园缘.00缘20人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 缘 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期乙腈-0.2%甲酸在相同色谱条件下进行比较遥 结果表明袁 乙腈-0.05%甲酸为流动相分离度及峰形更差曰乙腈-0.1%甲酸袁乙腈-0.2%甲酸色谱峰无较大差异袁考虑到酸对色谱柱的影响袁 最终确定流动相为乙腈-0.1%甲酸遥2.2.3 洗脱梯度的确定经过试验研究袁以乙腈为流动相A袁以0.1%甲酸溶液为流动相B袁确定洗脱梯度遥 该条件下色谱峰分布均匀袁蒺藜皂苷K 与相邻峰分离度良好袁色谱峰信息完整遥2.2.4 流速与柱温的确定在确定的流动相条件下袁对不同柱温尧不同流速进行考察比较遥 由图谱可知袁流速一致时袁所考察的不同温度对该色谱条件下分离度无明显影响袁 本研究选择30益为该方法柱温曰柱温一致袁所考察的不同流速对分离度也无明显影响袁选用1.0 ml/min 为该方法流速遥2.2.5 蒸发光参数的确定在确定的流动相条件下袁 用岛津VP-ODS 色谱柱渊250mm伊4.6 mm伊5滋m冤袁按厂家提供的检测器条件推荐值及优化步骤袁 基线噪音以1.0 mV 为最低可接受限度袁Gain 设置为1袁分别对漂移管温度尧载气流速进行选择遥 由结果可知袁漂移管温度大于108益时袁基线噪音约0.5 mV袁故漂移管温度设为108益遥 载气流速大于或等于2.8L/min 时,基线噪音水平在1.0 mV 以内遥 对压缩空气载气流速2.8 L/min尧3.0 L/min尧3.2 L/min 进行考察比较袁载气流速2.8 L/min 时袁各峰响应值最强袁3.2 L/min 时袁 峰高明显较低袁3.0 L/min 时各峰响应值较适中袁且基线噪音低于0.5 mV遥 综合考虑基线噪音和各峰响应值袁 选择3.0 L/min 作为压缩空气载气流速遥2.2.6 色谱条件的确定综上所述袁确定蒺藜皂苷胶囊色谱条件为院柱温30益曰流速1.0 ml/min曰进样量10 滋l曰以乙腈为流动相A袁以0.1%甲酸为流动相B袁进行梯度洗脱袁蒸发光漂移管温度为108益袁载气流速为3.0 L/min遥3 供试品制备方法的确定蒺藜皂苷胶囊袁 取本品内容物约0.1 g袁 精密称定袁 置具塞锥形瓶中袁 精密加入50%甲醇10 ml袁密塞袁称定重量袁超声处理20 分钟渊功率900 W袁频率60 kHz冤袁放至室温袁再次称定重量袁用50%甲醇补足减失的重量曰摇匀袁滤过袁取续滤液袁即得遥4 色谱峰的归属与标记4.1 色谱峰的初步归属在蒸发光检测器针对对照品进行归属实验中袁仅能通过查看保留时间和对照是否一致进行归属遥为增强对照品峰确认袁 引用DAD 检测器条件下蒺藜皂苷胶囊特征图谱研究过程中的数据遥 按2.1 项下DAD检测器色谱条件袁针对对照品溶液进行归属袁由结果可知袁 蒺藜皂苷胶囊供试品色谱峰中有与槲皮素-3-O-茁-D-龙胆二糖苷尧异鼠李素-3-O-龙胆二糖苷尧异槲皮素尧蒺藜皂苷K尧槲皮素对照品保留时间一致的峰袁由于异槲皮素尧槲皮素在蒺藜皂苷胶囊供试品溶液中峰很小袁故不进行深入研究遥 对槲皮素-3-O-茁-D-龙胆二糖苷尧异鼠李素-3-O-龙胆二糖苷尧蒺藜皂苷K 进一步确认遥4.1.1 DAD 检测器下对照峰的确认分别取槲皮素-3-O-茁-D-龙胆二糖苷对照品溶液尧异鼠李素-3-O-龙胆二糖苷对照品溶液尧蒺藜皂苷K 对照品溶液尧供试品溶液尧加标供试品溶液渊取供试品溶液袁分成三份袁每份分别加入槲皮素-3-O-茁-D-龙胆二糖苷尧异鼠李素-3-O-龙胆二糖苷尧蒺藜皂苷K 对照品溶液冤遥 按2.1 项下色谱条件进样袁通过峰的紫外图进行判定遥 蒺藜皂苷胶囊供试品溶液尧加标供试品尧异鼠李素-3-O-龙胆二糖苷对照色谱峰保留时间一致袁紫外光谱图一致袁可判定为同一物质曰蒺藜皂苷胶囊供试品溶液尧加标供试品尧槲皮素-3-O-茁-D-龙胆二糖苷对照色谱峰保留时间一致袁 紫外光谱图一致袁可判定为同一物质曰蒺藜皂苷胶囊供试品溶液尧加标供试品尧蒺藜皂苷K 对照色谱峰保留时间一致袁紫外光谱图一致袁可判定为同一物质遥4.1.2 LC-MS 进一步归属用岛津LCMS-8040 液质联用仪袁 岛津VP-ODS色谱柱渊250mm伊4.6 mm伊5滋m冤袁以乙腈为流动相A袁以0.05%甲酸溶液为流动相B袁测定供试品溶液遥 采用一级质谱信息进行特征峰成分认定袁以相对分子质量推导袁进一步确定了异鼠李素-3-O-龙胆二糖苷遥4.1.3 蒸发光检测器色谱峰定位由4.1.1 DAD 检测器对照峰的定位图可知袁在该条件下袁纤细薯蓣皂苷尧甲基原薯蓣皂苷尧原薯蓣皂苷尧薯蓣皂苷尧蒺藜皂苷D 对照品均无吸收遥 为了对蒺藜皂苷胶囊色谱峰进行归属袁用蒸发光检测器进行定位确认遥取纤细薯蓣皂苷尧甲基原薯蓣皂苷尧原薯蓣皂苷尧薯蓣皂苷对照品溶液尧槲皮素-3-O-茁-D-龙胆二糖苷尧异鼠李素-3-O-龙胆二糖尧蒺藜皂苷K尧蒺藜皂苷D 混合对照溶液袁按照2.2.6 项下色谱条件进样检测遥 结果表明袁蒺藜皂苷胶囊中未出现纤细薯蓣皂苷尧甲基原薯蓣皂苷尧原薯蓣皂苷尧薯蓣皂苷对照品溶液尧槲皮素-3-O-茁-D-龙胆二糖苷尧异鼠李素-3-O-龙胆二糖尧蒺藜皂苷K尧蒺藜皂苷D 混合对照溶液保留时间一致的色谱峰遥4.1.4 蒸发光检测器下对照峰的确认分别取槲皮素-3-O-茁-D-龙胆二糖苷尧 异鼠李素-3-O-龙胆二糖苷尧蒺藜皂苷K尧蒺藜皂苷D 混合对照品溶液袁蒺藜皂苷胶囊供试品溶液袁蒺藜皂苷胶囊加标供试品溶液渊取蒺藜皂苷胶囊供试品溶液1ml袁加入槲皮素-3-O-茁-D-龙胆二糖苷尧异鼠李素-3-O-龙胆二糖苷尧蒺藜皂苷K尧蒺藜皂苷D 混合对照品溶液1ml袁摇匀袁滤过袁即得冤袁按照2.2.6 项下色谱条件进行试验袁 混合对照品溶液与供试品溶液进样10 滋l袁加标供试品溶液进样20 滋l遥结果表明袁蒺藜皂苷胶囊供试品溶液尧蒺藜皂苷胶囊加标供试品溶液与混合对照溶液中槲皮素-3-O-茁-D-龙胆二糖苷尧异鼠李素-3-O-龙胆二糖苷尧蒺藜皂苷K尧蒺藜皂苷D 色谱峰保留时间一致袁加标供王贵洲等院蒺藜皂苷胶囊的特征图谱研究21人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 缘 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期试品溶液色谱峰未出现明显变形袁故判定蒺藜皂苷胶囊中相应色谱峰为槲皮素-3-O-茁-D-龙胆二糖苷尧异鼠李素-3-O-龙胆二糖苷尧蒺藜皂苷K尧蒺藜皂苷D遥综上袁本研究通过6 个皂苷类成分和8 个黄酮类成分的色谱峰为对比袁 归属了成品中的4 个色谱峰袁分别为槲皮素-3-O-茁-D-龙胆二糖苷尧异鼠李素-3-O-龙胆二糖尧蒺藜皂苷K 和蒺藜皂苷D遥4.1.5 色谱峰的标记在本条件下袁蒺藜皂苷胶囊供试品溶液中蒺藜皂苷D 色谱峰较小袁故不进行标记遥 取槲皮素-3-O-茁-D-龙胆二糖苷尧异鼠李素-3-O-龙胆二糖尧蒺藜皂苷K 混合对照溶液对样品中的化学成分色谱峰进行确认遥 结果显示袁以槲皮素-3-O-茁-D-龙胆二糖苷峰为峰1袁异鼠李素-3-O-龙胆二糖对应的峰为峰2袁蒺藜皂苷K 峰对应的峰为峰3袁另选择色谱图中峰相应较大的4 个其他特征峰袁分别标记为3尧4尧6尧7遥 蒺藜皂苷K 分离度较好袁保留时间适中袁满足S 峰的条件袁选择作为相对保留时间计算的标准峰渊S 峰冤遥5 特征图谱的建立5.1 HPLC 特征图谱的建立综上袁对纳入标准正文的峰号重新编号袁对相对保留时间规定值的确定如下院按野3.1冶项下的方法袁制备12 批蒺藜皂苷胶囊成品的供试品溶液袁分别进样检测袁供试品溶液各特征峰全部呈现袁且色谱行为基本一致遥 根据实验分析可知袁各批蒺藜皂苷胶囊成品差异较小袁供试品特征图谱中应呈现5 个特征峰渊图1冤袁应分别与相应的参照物峰保留时间一致遥 以蒺藜皂苷K 峰为S 峰袁计算特征峰1耀5 号与S 峰的相对保留时间袁其中峰1尧峰2尧峰4 的相对保留时间应在规定值的依5%之内袁峰5 的相对保留时间应在规定值的依10%之内遥 规定值为院0.44渊峰1冤尧0.45渊峰2冤尧1.04渊峰4冤尧1.64渊峰5冤遥峰 3 为蒺藜皂苷 K图 1 对照特征图谱渊成品拟合图冤5.2 专属性实验取蒺藜皂苷胶囊及相应辅料渊根据蒺藜皂苷胶囊成品处方比例冤袁按野2.1冶项下方法分别制备供试品溶液尧辅料尧空白溶剂尧混合对照品溶液袁按野2.2.6冶项下色谱条件进样检测遥结果表明辅料及空白溶剂在检测条件下未在相应位置出峰袁供试品溶液和混合对照品溶液出峰袁说明方法专属性良好遥5.3 系统精密度取蒺藜皂苷胶囊袁按野3.1冶项下的方法制备供试品溶液袁按野2.2.6冶项下色谱条件进样检测遥 连续进样5 次袁每次10 滋l袁记录色谱图遥所得的特征峰以峰3渊S峰冤计算袁相对保留时间的RSD 小于0.6%袁相对峰面积的RSD 小于3.6%遥 表明精密度良好遥5.4 溶液稳定性蒺藜皂苷胶囊供试品溶液袁 分别在0尧2尧4尧6尧8尧10尧12h 时间节点按野2.3.5冶项下色谱条件进样检测袁每次10 滋l袁记录色谱图遥 所得的特征峰以峰3渊S 峰冤计算袁相对保留时间的RSD 小于0.6%袁相对峰面积的RSD 小于3.4%遥 结果表明供试品溶液在12h 内稳定遥5.5 重复性取蒺藜皂苷胶囊袁按野3.1冶项下的方法制备9 份供试品溶液袁按野2.2.6冶项下色谱条件分别进样检测袁各进样10 滋l袁 记录色谱图遥 所得的特征峰以峰3渊S峰冤计算袁相对保留时间的RSD 小于0.7%袁相对峰面积RSD 小于4.4%遥 表明重复性良好遥6 讨论6.1 本品化学成分较为复杂袁通过建立蒺藜皂苷胶囊的HPLC 特征图谱袁 可对本品的质量做进一步控制袁能较为全面的反应蒺藜皂苷胶囊的化学成分袁 精密度尧重复性尧专属性尧溶液稳定性及耐用性良好袁各个特征峰特征性较强遥6.2 本实验进行了相关性分析遥通过药材-中间体渊提取物冤-成品的相关性分析袁各批次提取物与蒺藜皂苷胶囊成品特征峰基本一致袁其出峰先后和保留时间具有明显的特征性遥 在药材尧中间体与蒺藜皂苷胶囊成品的色谱图比较中袁特征峰全部呈现遥7 小结综上所述袁本研究应用高效液相色谱法建立蒺藜皂苷胶囊特征图谱袁该方法操作简单尧稳定可靠尧精密度高尧专属性强尧分离度好袁可用于蒺藜皂苷胶囊的质量控制遥参 考 文 献员李春娜援蒺藜茎叶化学成分及质量分析研究D援北京院北京中医药大学袁2015援22