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发酵饲料生产工艺和应用

灵璧县立腾同创农牧科技有限责任企业
二0一二年十一月

目 录

安徽省立腾同创农牧科技 介绍
安徽省立腾同创农牧科技 企业文化
安徽省立腾同创农牧科技十年发展战略
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安徽省立腾同创农牧科技第一个发展五年发展计划
第一章 发酵饲料生产菌种及发酵工艺
第二章 发酵饲料生产技术

第一章 发酵饲料生产菌种及发酵工艺
第一节 概述
一、 发酵饲料定义
发酵饲料定义是：在人为可控制条件下，以植物性农副产品为关键原料，经过微生物代谢作用，降解部分多糖、蛋白质和脂肪等大分子物质，生成有机酸、可溶性多肽等小分子物质，形成营养丰富、适口性好、活菌含量高生物饲料或饲料原料。
采取发酵技术生产动物饲料或饲料原料，其特征关键是：
（1）含有大量活性微生物；
（2）多数以厌氧发酵方法进行生产；
（3）未经干燥物料含水量通常在30%以上；
（4）物料酸性物质显著增加，营养组成更合理；
（5）生产原料以植物性农副产品为主。
也有发酵成品是经过干燥处理，比较经典有发酵豆粕和发酵棉粕。在发酵过程中有大量活性乳酸菌和酵母菌发生代谢作用，经过干燥以后，乳酸菌基础全部失活了，不过它们也属于发酵饲料。
二、 发酵饲料概述
发酵饲料生产工艺基础全部是以固态发酵方法进行，生产菌种以乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌为主，绝大多数采取厌氧或兼性厌氧发酵。发酵物料含水量为30%~50%，发酵时间和温度受环境影响很大，基础不进行人为控制和调整。
在实际生产中也有采取好氧发酵方法进行，生产菌种以霉菌和假丝酵母为主，生产用蛋白原料关键是部分乳酸菌和酵母菌难以降解杂粕和胶质蛋白。不过生产设备复杂，物料温度和湿度改变很大，控制及其困难。成品关键是作为饲料蛋白原料替换物，能降低饲料生产成本，但基础不含有生物学活性和功效。
本节关键叙述厌氧固态发酵工艺，常规发酵饲料生产步骤如：
原料→消毒→冷却接种→培养→干燥→包装
工业化规模微生物发酵过程基础上全部是纯培养过程，原料需要消毒，空气需要过滤等。这些操作全部是为了确保在发酵产品生产和储存过程中不受杂菌侵袭和干扰，但也正是这些常规操作使产品生产成本居高不下，影响了微生物发酵产品在动物喂养中大剂量使用。
大量试验证实，在不考虑动物喂养成本前提下，大剂量（在配合饲料中添加5.0%以上）使用高活菌含量微生物发酵饲料能够显著改善动物生产性能，提升动物健康水平，甚至能够进行无抗生素喂养。不过采取传统生产工艺取得高活菌产品其生产成本通常全部在10元/kg以上，假如以10%百分比使用在配合饲料中，每吨配合饲料成本最少需要增加800元，这个增加值对传统畜禽养殖业来说是难以接收。降低发酵饲料生产成本最直接方法就是简化生产工艺，其中原料蒸煮、消毒和干燥是最耗能操作过程，是造成生产成本增加关键步骤，也是造成生产设备投资增加关键原因。如能简化生产操作工艺步骤，同时又能确保产品质量安全稳定，就能使发酵饲料生产和应用含有强大市场竞争力。

第二节 发酵饲料生产菌种
发酵饲料生产菌种很多，关键有：乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌和霉菌。
一、 乳 酸 菌
现在生产中使用乳酸菌最少有30多个。按乳酸菌代谢路径，大致可归纳为四种类型：同型乳酸发酵、专性异型乳酸发酵、兼性乳酸发酵和双歧杆菌异型乳酸发酵。
（一） 同型乳酸发酵
C6H12O6 ——→2CH3CH(OH)COOH
一分子葡萄糖分解成两分子乳酸，整个过程不产气，发酵转化理想，产物最适宜，效率最高。经典生产菌种关键有：德氏乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、嗜热乳杆菌、粪肠球菌、乳酸乳球菌。
（二） 专性异型乳酸发酵
C6H12O6 ——→CH3CH(OH)COOH+CH3COOH+CO2↑
一分子葡萄糖转化成一分子乳酸和一分子乙酸，另外还释放一分子二氧化碳。相比同型乳酸发酵，这种发酵转化效率要低得多，而且还有产气损失。经典生产菌种关键有:发酵乳杆菌、高加索酸奶杆菌、短乳杆菌、巴氏乳杆菌。
（三） 兼性乳酸发酵
兼性乳酸发酵能同时进行同型乳酸发酵和异型乳酸发酵，这两种代谢进行程度和百分比取决于菌种性质和外界培养条件。经典生产菌种有：植物乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖杆菌、清酒乳杆菌。
（四） 双歧杆菌异型乳酸发酵
2C6H12O6——→2CH3CH(OH)COOH+3CH3COOH
比较经典生产用菌种是动物双歧杆菌。双歧杆菌培养要求很严格，对厌氧要求极高，现在还极难在实际生产中应用。
乳酸菌分布广、种类多，有杆状和球形两大类。有单个、成对和链状排列，基础上全部是厌氧菌或微需氧菌。在饲料青储、发酵开始时就繁殖，到饲料因密封缺氧后仍然能繁殖，只是增殖速度慢部分，而乳酸生成速度却快部分。
乳酸菌能分解饲料原料中糖，形成乳酸。乳酸能提升饲料营养价值和适口性，同时还能抑制大肠杆菌和沙门氏菌等有害微生物生长代谢，使饲料产品能长久保留。在饲料青储和发酵过程中，同型和异型乳酸发酵同时存在，产物除乳酸外还有少许乙醇和CO2。
二、 芽 孢 菌
现在在生产中应用芽孢菌有近十种，以杆菌为主，关键为以下三种：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌。芽孢杆菌能耐受高温，在有氧和无氧条件下全部能存活。在营养缺乏、干旱等条件下形成芽孢，在条件适应时又能够重新萌发成营养体。利用芽孢杆菌发酵饲料目标关键是为了消耗培养体系中残留氧气，为乳酸菌发明一个厌氧环境。另外，多年来研究还发觉，有些芽孢杆菌能产生杀灭大肠杆菌和沙门氏菌等有害微生物细菌素（也称抗菌肽），这些抗菌肽有很强针对性，只对一些类型微生物细胞有破坏作用，对酵母菌和乳酸菌没有影响。
三、 酵 母 菌
酵母菌是一类单细胞真菌，形态多个多样，关键有球形、卵形和丝状形（如假丝酵母），以出芽无性繁殖为主，最适宜生长温度为25~35℃，pH偏酸性（4.0~6.0）。酵母菌基础上全部是兼性厌氧菌，在有氧条件下快速增殖，在无氧情况下进行酒精发酵（EMP）。现在在生产中应用有20多个，关键为以下三种：酿酒酵母、热带假丝酵母、产朊假丝酵母。啤酒酵母和面包酵母是最常见酿酒酵母。热带假丝酵母和产朊假丝酵母生长速度很快，在适宜温度和营养条件下，它们世代倍增时间不超出3h，尤其适合处理食品加工业产生废水。
酵母菌个体比乳酸菌大得多，直径通常为2~6μm，体积几乎是乳酸菌1000倍左右。工业生产中常见酵母菌关键有酿酒酵母和假丝酵母，酿酒酵母是生产啤酒、白酒等含乙醇类发酵物关键菌种；假丝酵母关键用于好氧发酵生产动物饲料或废水处理。
四、 霉 菌
现在在生产中应用霉菌有近十种，关键为：米曲霉、黑曲霉、白地霉。通常来说利用霉菌发酵，基础上全部是有氧发酵，发酵过程会产生大量代谢热，生产过程中料曲温度控制往往是生产成败关键。霉菌发酵现在采取浅盘发酵，料曲厚度不超出5cm。假如采取厚层发酵，需采取强通风装置，生产能耗很大，从这一点上说，霉菌发酵不适于生产饲料或饲料原料。
现在，实际生产中利用霉菌关键是利用它能合成纤维素酶、半纤维素酶和蛋白酶特征，利用廉价粗蛋白原料作为发酵底物，生产高活性蛋白饲料或粗酶制剂。
五、 选择生产菌种基础标准
（一） 安全性（必需同时符合以下两个要求）
（1） 菌体本身不产生有毒有害物质。
（2） 不会危害环境固有生态平衡（关键针对一些基因工程菌）。
（二）有效性（能满足一个要求即可）
（1） 菌种本身含有很好生长代谢活力，能有效降解大分子好抗营养因子，合成小肽和有机酸等小分子物质。
（2） 能保护和加强动物微生物区系正平衡。
这种功效关键是指能有效维护和提升有益微生物在动物消化道中数量优势，其可经过两种方法达成：一个方法是利用发酵饲料生产菌种本身就是从喂养目标动物消化道中分离出来有益菌，经过饲喂高百分比发酵饲料直接提升有益微生物数量，形成数量优势；另一个方法是利用生产菌种或代谢产物能够选择性地抑制或杀灭有害微生物，形成有益菌数量优势。实现第二种路径方法能够多个多样，比较常见有：耗尽氧气，降低体系氧化还原电位；降低环境pH值；代谢物中含有能选择性杀灭大肠杆菌和沙门氏菌等有害微生物抗菌物质等。
第三节 发酵饲料生产菌种之间相互关系
现在人类可利用这些发酵技术基础上全部是纯培养技术，而实际上在自然界中极难找出单一微生物存在生态环境。据已经有微生物研究报道，地球上存在微生物超出100万种，而人类所分离纯种累计不超出10万种，做过比较系统研究不超出1万种。依据现在已经有研究结果，大致能够把微生物之间关系分为以下多个：中性共生、同住、互惠共生、共生、竞争、拮抗和寄生。
一、 中 性 共 生
这是指两种或两种以上微生物同时存在于同一个环境中，不过它们之间没有直接生态关系，各自生活互不干扰。
比如淡水中生长衣藻和水生细菌。
二、 同 住
这是指两种微生物同处于一个栖所内，其中一个获益，另一个不受影响。常见现象是一个微生物产生一个代谢物供另一个微生物作为营养物质，或产生适合于另外一个微生物生长环境。发酵饲料生产中比较常见例子有以下多个：酵母菌能在高浓度糖液（25%左右）中生长。当糖被酵母菌消耗以后，糖浓度降低就有利于不耐受高渗透压微生物（如乳酸菌）生长。
能分泌淀粉酶微生物（芽孢菌）水解淀粉产生寡糖和单糖，为另外部分只能利用还原性单糖微生物生长提供营养。
还有一个比较特殊同住微生物，好气性菌可消耗氧气，降低环境氧化还原电位，使之适合于厌氧微生物生长。这种同住关系只能产生在开始阶段，在后期就不是同住关系了。这种现象在发酵饲料到生产过程中常常碰到，也是利用微生物组合发酵生产发酵饲料关键理论基础。
三、 互 惠 共 生
这是两种微生物互惠互利现象，比较经典菌种是阿拉伯糖乳杆菌和粪链球菌组合。阿拉伯糖乳杆菌不能合成苯丙氨酸，粪链球菌不能合成叶酸。阿拉伯糖乳杆菌不能在缺乏苯丙氨酸培养基上生长，粪链球菌也不能在没有叶酸培养基上生长。不过把它们组合在一起，却能够共同在没有苯丙氨酸也没有叶酸培养基上生长，因为它们能相互为对方提供必需限制性营养物质。这种现象在自然界中普遍存在，发酵饲料菌种组合应该多考虑这种组合优势。
四、 共 生
共生是指两种微生物在同一个严酷环境中相互相依为命。比较经典例子是地衣，它是蓝细菌（或蓝藻）和真菌共同组成一个形态和生理单位。蓝藻或蓝细菌细胞仅限于特定层内，地衣内菌丝交织成菌丝组织，形成一个稠密外皮层。皮层下为蓝藻细胞层，在下面为菌丝疏松交织菌髓层。真菌能够从蓝藻取得碳水化合物，真菌菌丝所摄取水和无机盐又能够提供给蓝藻，所以地衣能耐干旱、潮湿和抗严寒。这种现象在发酵饲料生产过程中极难碰到，少有实用例子。
五、 竞 争
当两种微生物对某种环境因子有相同要求时，就会发生生存竞争。因为微生物世代时间比较短，代谢强度大，所以生存竞争往往表现很猛烈。
在一个生存环境内，不一样时间会出现不一样优势种。这种优势微生物在某种环境下能最有效地适应该时环境，而环境条件一旦改变，就可能被另一个微生物替换并发育成新优势种。现在工业化发酵生产之所以采取纯种培养，其关键原因就是消除其它微生物竞争。目标代谢物合成能力强微生物其生长速度往往比较低，最少比同类野生菌低。野生菌代谢活动是很“经济”。假如从生长速度分析，它们物质和能量利用效率要远高于生产菌种。不过，因为生产成本限制，发酵饲料生产往往不能采取纯种培养，所以微生物之间生存竞争不可避免。
怎样巧妙利用微生物之间生存竞争是研究微生物发酵饲料生产一个很关键课题。从理论上分析，经过控制调整微生物生存环境能够调整物料中微生物种类和数量分布，从而达成利用微生物有益菌群种群优势发酵饲料目标，不过到现在为止，相关方面成熟技术还是极少。
六、拮 抗
一个微生物能够产生不利于另一个微生物生存代谢物质，或经过代谢活动改变生存环境，而这种环境不利于其它周围微生物生长，这种现象就称为“拮抗”。如：青贮饲料接种乳酸菌和醋酸菌在发酵过程中，不停降低pH值，结果绝大多数不耐酸微生物不能生存，甚至趋向死亡。酵母菌在无氧条件下将糖发酵成酒精，当酒精浓度达成一定数值时，其它微生物就不能生存。
研究发觉拮抗还含有显著选择性，农业部饲料工业中心分离取得枯草芽孢杆菌MA139能分泌杀灭大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌抗菌肽（细菌素），但对本身、酵母菌和乳酸菌生长代谢基础没有影响，这种拮抗选择性是发酵饲料研究所期望。
七、寄 生
一个微生物生活在另一个微生物体内或体外，依靠摄取寄生细胞营养进行生长繁殖，并使后者遭受损害甚至死亡，这种现象称之为寄生。这种现象在饲料发酵过程中可能存在，现在在研究中还没有碰到。
微生物是发酵饲料动力起源，研究发酵饲料中微生物相互关系是取得高质量发酵饲料必需前提，也是饲料发酵生产关键。
第四节 发酵饲料生产工艺
一、 固态厌氧发酵高活性生物饲料
相对于好氧发酵，厌氧发酵能耗低，微生物代谢产生热量也要小得多，生产过程往往不需要翻拌散热。另外，发酵产品只要密封适当，即使长久存放也不会腐败变质。
现在比较经典固态厌氧发酵生物饲料成功例子关键有两种：一个是适合养殖户自产自用袋装发酵饲料；另一个是属于规模化流水线生产袋装发酵饲料。它们接种微生物基础一致，关键有酵母菌、乳酸菌和芽孢杆菌。
适合养殖户自产自用发酵袋是一个一般密封包装袋，物料接种以后装袋，再将袋口用绳扎紧，物料含水量为30%~40%。开始时，酵母菌消耗袋内残留氧气进行增殖和呼吸代谢，同时也为乳酸菌发明一个厌氧生活环境。然后，酵母菌在无氧条件下进行糖酵解，产生酒精和CO2，乳酸菌也同时增殖、代谢，产生有机酸。伴随袋内气压不停增加，不停有CO2带着酒精和有机酸排出袋外，管理饲料喂养员能够依据排出酸香味来判定物料发酵成熟度。

有氧发酵阶段：
C6H12O6+6O2——→6CO2+6H2O
无氧发酵阶段：
C6H12O6 ——→2CO2+2C2H5OH(乙醇)
在夏季，发酵3~5d就有显著酸香味。在冬季，时间需要延长。假如环境温度低于12℃，发酵就有可能归于失败。酵母在低温下长久代谢低迷，不产生CO2，使得外界O2长时间和接种乳酸菌接触，会造成乳酸菌活力大减，甚至死亡。
事实证实，假如环境温度适宜，时间控制适当，采取上述袋装式土措施发酵，也能够取得质量很好微生物发酵饲料，活性乳酸菌含量能达成108cuf/g以上。将其在生羊配合饲料中添加15%~20%，生羊采食量能显著提升，最多能提升10%以上，而且增重速度和健康水平也有显著提升。这种工艺即使简单，不过受限制原因很多，质量标准也极难把握，实际推广有一定困难。
为了使这种袋装发酵技术进入程序化、工业化应用，发酵饲料质量能得到有效确保，必需完成以下多个前提：发酵过程不受环境温度限制；产品质量不受存放时间限制，或保质期能达成三个月以上；产品在储存和运输过程中不受外界空气干扰。
农业部饲料工业中心微生物发酵饲料课题组发明了呼吸膜可移动式固态厌氧发酵饲料（也称袋装发酵饲料）生产技术。

这种发酵技术具体工艺步骤图1-1。
发酵原料
粉碎机
过 渡 仓
电 子 秤
搅拌机
菌种液
计量和
包装机
成品

原料接种以后直接进入包装袋中，包装袋上附加一个能够调整气压硅胶膜。在发酵过程中，微生物会产生CO2等气体，使得袋内气压大于外界常压。当袋内气压达成某一临界值时，气体经过硅胶膜排到外界。不过外界气体一直没有机会进入发酵体系，从而也就排除了外界杂菌干扰。
研制特定微生物菌种组合能使乳酸菌快速繁殖，占据数量优势，原料不需要消毒就能够直接用于接种培养。
这种工艺很简单，假如以日产30t计算，设备投资不超出40万元，尤其适合在中国广大农村推广使用。

第三章 发酵饲料生产技术
第一节 发酵饲料用乳酸菌分离筛选
乳酸菌是一类最常见益生菌，生物饲料发酵生产通常全部离不开乳酸菌。乳酸菌种类很多，市场上流行产品也极多，最少有20多个。大量试验证实，只有动物消化道国有微生物才能在消化道内定植，外源微生物只能短时间存活在消化道内，不可能长久融合到动物消化道微生态系统中。筛选发酵饲料生产菌种，其主体应该起源于最终适用动物消化道，而乳酸菌细菌是动物消化道内起关键作用微生物。
一、 样品采集
为了取得适宜生产用乳酸菌，样品采集很关键。适合于实际生产乳酸菌必需起源于健康动物消化道，最好是在发生了瘟疫养殖场而幸存畜禽。发生瘟疫养殖场，动物大百分比死亡，幸存畜禽虽少，不过生命力很顽强，是极好生产菌种采集样本。
以下以筛选符合生羊健康养殖需要生物饲料用乳酸菌为例，叙述样品采集和乳酸菌分离。在试验室中对生羊进行攻毒试验，在饲料中不停加大大肠杆菌（试验用E.ColiK88,这是一个常见攻毒试验用大肠杆菌）用量，以检验生羊抵御力。经过5~7d试验，生羊健康水平越来越差。我们选择其中两头最健康生羊进行屠宰，在无菌环境中提取它胃液、小肠液和大肠液，快速保留在无菌生理盐水（NaCl浓度为0.9%）中。
目标乳酸菌通常全部是厌氧菌，为了确保乳酸菌活力，需要尽可能降低生理盐水氧化还原电位。最简便方法是在溶液中加入适量半胱氨酸，半胱氨酸有巯基（—SH），有很好还原力，能够消除溶液中残余氧。
二、 乳酸菌分离纯化
样品中目标乳酸菌含量通常全部不是很高，而且还污染了其它杂菌。为了提升筛选成功几率，在样品进行分离纯化以前，能够对样品进行选择性增殖培养，以增加目标乳酸菌含量。
样品增殖培养比较简单，把经过合适处理样品接种到适于目标乳酸菌生长培养基中。比较常见是牛奶增殖培养液，在无抗生素牛奶中补充6%~8%蔗糖，高温消毒、冷却，然后用氮气或二氧化碳驱除溶液中残留空气，再接入适量采集样品，在30~32℃条件下厌氧培养10~24h。假如样品中目标乳酸菌含量比较低，能够合适延长培养时间。
样品经过预增殖培养以后，目标乳酸菌含量显著提升，能够进入下一步分离纯化操作。
乳酸菌分离培养基通常采取MRS琼脂培养基，其营养组成和pH以下：蛋白胨：5.0g/L；牛肉浸膏：4.0g/L；酵母膏：2.0g/L；葡萄糖：12.0g/L；玉米浆：10.0mL;司盘80：1ml;磷酸氢二钾：1.0g/L；三水乙酸钠：3.0g/L；柠檬酸三铵：1.0g/L；硫酸镁：0.1g/L；硫酸锰：0.03g/L；琼脂：18.0g/L。pH6.2±0.2。
加热溶解上述各组分，配制成均匀溶液，分装在厌氧滚管中（每个管中加5~6mL）。在115℃消毒杀菌30min。冷却至50℃左右后，在冰水中滚动滚管，使固体培养基均匀凝固在管壁上。
为了指示培养基氧化还原电位，能够在培养基中加入极少许刃天青（一个显色剂），浓度0.02%就足够了。在低电位时培养基显蓝色，随氧化还原电位不停上升，培养基颜色逐步由蓝转为浅蓝、粉红、红色。假如培养基颜色转成粉红就基础不合格了。同增殖培养过程一样，在MRS分离培养基中加入适量半胱氨酸能够在一定时间内维持环境低电位。
分离纯化培养基准备好以后，就能够进行目标乳酸菌分离操作了。
在超净工作台上（或其它无菌环境中），对经过增殖培养样品进行梯度稀释，稀释液还是用无菌生理盐水，把稀释后样品接种到厌氧滚管中，密封（滚管有密封盖）。在30~32℃条件下培养1~2d。
为了提升筛选几率，能够同时做多个稀释梯度样品培养。假如两天以后不出现理想菌落，能够再延长培养时间。
即使乳酸菌最适宜生长温度是37~40℃，不过在分离筛选过程中，培养温度应合适调低，以降低其生长速度，这么菌落之间差异能够更明晰，也更有利于挑选理想菌种。
经过上述分离操作，我们取得了5株乳酸菌，它们分别是：
1.起源于羊胃格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）;
2.起源于十二指肠罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）;
3.起源于小肠屎肠球菌（Enterococcus faecium）;
4.起源于空肠嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）;
5.起源于结肠发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentium）。

三、发酵力和耐酸稳定性分析
为了后续生产应用需要，我们对分离取得乳酸菌进行发酵力测定和耐酸稳定性试验。发酵力测定比较简单，关键测定其乳酸菌产量，具体方法以下：
接种分离取得细菌纯种于试管培养液中，30~32℃恒温培养12h，然后再扩大接种到牛奶瓶中，30~32℃恒温培养6h，测定乳酸含量。
在乳酸发酵过程中乳酸通常以乳酸钙形式存在， 经过去除发酵液中葡萄糖和蛋白质，并加入合适浓度硫酸酸化，钙离子转化成难溶硫酸钙沉淀，使溶解度不高乳酸钙全部转变为乳酸。乳酸在铜离子催化下，和浓硫酸作用生成乙醛，乙醛能和对羟基联苯作用生成在 565 nm 处有特征吸收紫色物质。在一定浓度范围内，乳酸含量和 565 nm 处波长吸光度呈线性关系，所以，能够经过测定 565 nm 处吸光度来测定乳酸含量。
试验室乳酸含量测定
一、原 理
稀乳酸在 浓硫酸作用下加热，能够变成乙醛。乙醛和羟基联苯作用能够生成红色复合物，在565nm条件下比色测定，能够确定乳酸含量。
二、试 剂
1. 4.0%硫酸铜溶液
将4g无水硫酸铜溶解在水溶液中，定容至100ml。
2. 羟基联苯（C6H5·C6H4OH）溶液
将1g羟基联苯溶解于100ml浓度为0.08mol/LNaOH溶液中，储存在褐色试剂瓶中。
3.乳酸标准液
将280mg纯乳酸锂溶于水中，配成250mL溶液，其乳酸浓度为1mg/mL，存放于4℃冰箱中。在做标准曲线时将溶液稀释10倍，使乳酸含量为100μg/mL。在分别取1，2，3，4，5，6mL稀释液，稀释配制成1，2，3，4，5，6μg/mL乳酸标准液。
4.浓硫酸溶液
在比色管中分别加入1mL乳酸标准液和0.05mL硫酸铜溶液，然后加入6mL浓硫酸，放置5min，冷却至20℃以下。
三、标准曲线制备和乳酸含量测定
在上述比色管中加入0.05mL羟基联苯溶液，混合均匀，在室温下放置6~8h，过夜。在565nm波长下进行比色测定，绘制标准曲线。
（1） 最大吸收波长确实定
乳酸发酵液样品显色后，表明，最大吸收波长为 565 nm。

图2-1最大吸收波长确实定

（2） 最好显色条件选择
结果表明，氢氧化钙和浓硫酸加入量对显色反应影响显著，其它原因作用不显著，最好显色条件为A2B3C2D1E1F3，即氢氧化钙 0.05g，20%硫酸铜 0.8 ml，浓硫酸 6 ml，对羟基联苯 0.125 ml，静置时间 15 min，加热显色时间 5 min。
（3） 乳酸标准曲线制备
乳酸标准应用液浓度在 10~80 μg/ml范围内和吸光度值基础呈线性关系，当浓度大于等于 60 μg/ml时吸光度值大于 1，考虑到仪器误差原因，故制备标准曲线时浓度范围取在 15、20、25、30、35、40、45、50 μg/ml，得到图乳酸标准曲线，求得标准曲线回归方程为A=0.0189C－0.0808(A为吸光度值，C为乳酸浓度，n=8)，r=0.9989，在 15~50μg/ml范围内呈良好线性关系。

（图2-2：乳酸标准应用液浓度和吸光度值之间关系）

（图2-3：乳酸标准曲线）
本试验对发酵液进行预处理，排除蛋白质和葡萄糖干扰，使测定结果更靠近真实值；优化了显色条件，使测定时操作简便，正确度高，显色稳定，正确度高，适合于发酵液中乳酸含量测定。
耐酸稳定性分析关键是考虑乳酸菌在实际使用过程中过动物胃酸成活问题。生长育肥羊胃酸pH比较低，通常微生物极难在其中存活，这种功效实际上也利于生羊健康，使它能够在卫生条件比较差环境中生存。不过这种特征不利于外源有益微生物存活，外源有益菌必需先经过胃液考验才能达成其发挥作用场所（肠道）。所以耐胃酸稳定性也是决定乳酸菌实际使用效果一个关键指标，具体检验方法以下：取1.0mL活菌数量已知培养液，在无菌条件下，接种到生长羊、牛胃液中，在37℃恒温培养。同时做6个平行，每隔1h取样1次，分析乳酸菌数量改变。
在生长羊胃液中，上述5株菌全部表现了很好稳定性，其存活率全部在50%以上（见表2-4）
表3-4 多种乳酸细菌在生长羊胃液中稳定性
时间/h
1
2
3
4
5
6
格氏乳杆菌存活率/%
88.2
82.6
91.4
95.8
112
136
罗伊氏乳杆菌存活率/%
88.4
81.3
71.4
66.9
57.2
46.8
屎肠球菌存活率/%
86.5
62.1
76.3
71.2
64.8
55.6
嗜酸乳杆菌存活率/%
91.2
88.6
84.2
76.8
71.3
64.2
发酵乳杆菌存活率/%
94.6
92.8
91.4
88.5
86.3
84.6
本组试验均是在羊消化道中分离取得乳酸菌全部是天然菌，没有经过基因工程改造，属于安全菌株。遗传性能稳定，不会伴随传代而发生变异，安全无毒。能够大量应用在牛、羊等饲料中。
另有研究提出在模拟胃酸中（pH值和真实胃液胃酸相同）进行稳定性试验，其结果不能代表乳酸菌在真正胃液胃酸中稳定性，其原因是真实胃液中蛋白酶对外来生物活性物质含有极强分解作用，破坏了相当部分外来多酶蛋白和部分细菌素活性。这是自然界一个自我保护功效。
第二节 发酵饲料用芽孢杆菌分离筛选和安全性评价
芽孢杆菌也是一类比较常见发酵饲料生产菌，不过这类菌应用效果和菌种起源、喂养环境和动物类型全部有很大关系。即使种类很多，不过真正能表现出稳定、优良效果还极少。
另外，芽孢杆菌不一样于乳酸菌和酿酒酵母（或啤酒酵母），乳酸菌和酵母菌安全稳定性通常全部很可靠（部分耗氧发酵丝状酵母除外），不过芽孢杆菌安全稳定性却一直是行业主管部门关注关键。
芽孢杆菌通常全部不是动物消化道内固有菌，它们发挥作用原因至今还没有统一定论。不过现在大家对两点原因是比较认可：产生能杀灭大肠杆菌和沙门氏菌等有害微生物抗菌肽类物质（或称为细菌素）；消耗环境中氧气，为乳酸菌生长繁殖发明厌氧环境。芽孢杆菌分离筛选关键也是依据上述两个标准。
安全性评价关键依据抗生素敏感性和致毒性，相关技术全部比较成熟。
一、样品采集和初筛
和乳酸菌分离筛选一样，目标芽孢杆菌也是从发生了瘟疫动物养殖场或进行攻毒试验幸存动物体中筛选。
1.样品采集和初筛
在发生了大批死亡养殖场里，我们从土壤和粪便中采集样品，共需采集24个样品，每个样品约2g，在无菌条件下分别保留在20mL无菌生理盐水中，并用冰块降温，在12h内进行后续培养分离，具体方法以下：
（1）取0.5ml样品液，加入到5ml复合营养肉汤（MNB）中。MNB培养基组成和pH：
葡萄糖：5.0g/L;蛋白胨：5.0g/L；牛肉膏：3.0g/L;酵母浸粉：1.0g/L;MgSO4·H2O:0.005g/L。pH:7.0±0.2
把上述组分均匀溶解在水溶液中，在120℃消毒30min，然后冷却到常温，备用。
（2）从24种样品中分离得到芽孢杆菌菌株约120株，这些芽孢杆菌均含有革兰氏阳性、过氧化物酶阳性、产生好氧芽孢特征，不过仅有6株对E.coliK88含有强烈抑制作用，它们全部基础含有了芽孢杆菌特征，将此6株菌株编号为：MA23、MA139、MA257、MA59、MA633和MA744，并将这6株作为后续复筛备选菌种。
二、菌种复筛
在芽孢杆菌复筛过程中，设计了待筛菌和4种指示菌同时混合培养方法，这种设计目标：①发明丰富营养条件便于候选菌株富集生长；②采取指示菌混合培养，给候选芽孢杆菌营造一个竞争环境，有利于产生高抗菌活性芽孢杆菌，并能在有限环境中为争夺营养条件，拮抗其它细菌而存活下来。
同时在不一样试管中分别接种4种指示菌（见表3.5），浓度约为106cfu/mL。
表2-5 4种指示菌及其起源
指 示 菌
学 名
来 源
金黄色葡萄球菌
鼠伤寒沙门氏菌
大肠杆菌 K88
大肠杆菌 K99
Staphylococcus IVDC C56005
SalmonellatyphimuriumIVDC C79-13
Esherichia coli IVDC C83901
Esherichia coli IVDC C83529
中国兽医微生物菌种保藏中心
中国兽医微生物菌种保藏中心
中国兽医微生物菌种保藏中心
中国兽医微生物菌种保藏中心
在上述4个指示菌中，大肠杆菌K88抵御力最强，金黄色葡萄球菌抵御力最弱。
制备指示菌悬液时，用接种针从斜面上挑取少许指示菌，分别接种到营养肉汤培养基（MNB）中，37℃培养18~24h，确保菌悬液浓度为108cfu/mL左右。
接种菌液后，在37℃混合震荡培养48h，培养液然后置于70℃水浴中保温30min，杀死营养细胞。存活芽孢经过10倍稀释，取一定稀释液涂布于MNA固体培养基（在MNB培养液中加入1.8%左右琼脂）平皿表面，使之形成单菌落。依据菌落形态差异，挑起产芽孢、革兰氏阳性单菌落，接种到试管斜面中，编号后保留在4℃冰箱中。
然后在采取平板扩散方法，将分离出来芽孢杆菌用灭菌牙签蘸取少许分别点种到倒好MNA平板中（平板在使用前置于37℃下培养24h，除去部分水份方便于抗菌物质在培养基中扩散），37℃培养24h，然后把平板倒扣于盛一薄层氯仿培养皿盖上并熏蒸约40min，方便杀死活细胞并能让菌落固定于平板表面，然后移去培养皿盖并让平板里残余氯仿挥发30min（以挥发根本）。在平板表面铺一层刚培养好指示菌培养液，均匀充满后倾倒出剩下菌液，晾干平板，置平板于37℃培养16~18h，观察点种芽孢杆菌周围抗菌圈大小和清楚程度，来判定受试菌对指示菌抗菌能力。
这6种芽孢杆菌当中，MA139对4株指示菌表现出最强抗菌能力（见表2-6、图2-7）。
表2-6 初分离出6株芽孢杆菌对4株指示菌抑菌圈直径
菌株
抑菌圈直径/mm

E. coliK88
E.coliK99
Staph.aureus
S.typhimurium
MA23
29.8±0.6
35.6±0.7
46.8±0.5
40.6±0.8
MA139
32.0±1.0
35.9±0.7
47.5±0.5
42.5±0.7
MA357
28.2±0.4
35.0±0.6
45.4±0.8
40.8±0.7
MA559
31.3±0.9
33.6±0.8
44.4±1.1
38.3±0.9
MA634
29.6±0.7
31.5±1.2
45.6±0.6
38.6±1.0
MA744
31.0±1.0
33.6±0.6
45.7±0.8
38.4±1.1
注：表中值为平均值±标准差。
图2-7 MA139对指示菌抑制作用（A、B、C、D分别代表对大肠杆菌K88、K99、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌抑制作用）

三、芽孢杆菌抗逆性试验
和乳酸细菌耐受性试验一样，芽孢杆菌也需要进行类似检验。芽孢杆菌必需在胃肠道存活，同时还必需能够经受住小肠液对菌体破坏作用，也就是要求芽孢能够抵御小肠液中胆盐和胰液素对它毒害作用。
分别提取生长羊（体重40~60kg）胃食糜和小肠食糜，分别是用4层无菌医用纱布挤压过滤，取滤液，检验芽孢杆菌耐受性。生羊胃液中含有食糜量对胃酸pH有很大影响，食糜量越少，酸度越大。为表现良好代表性，生羊胃液样本数能够合适多部分（通常取10份）混合以后在用纱布挤压过滤。
经过筛选出来细菌MA139，活化两次后接种于MNB培养基中，37℃下225r/min震荡培养36h，将培养液置于80℃水浴保温15min，离心搜集芽孢（相对离心力为2500×g，5min），菌体用磷酸缓冲液（PBS:0.144%Na2HPO4,0.024%KH2PO4,pH7.0）洗涤两次，最终复溶在PBS缓冲液中，即为菌悬液，用于后续抗逆耐受性试验。
从试验结果发觉，在胃液中保持3h，活性芽孢数量基础没有下降，证实其对胃酸耐受性很好。在小肠液中，起始24h内不生长，而24h后开始生长，培养液变得浑浊。在试验第5天，取样染色分析，发觉培养液中有大量芽孢增殖。表明MA139在小肠液中开始受到了一定抑制，不过伴随培养时间延长，能够适应这种环境。表明MA139芽孢能够在羊小肠中存活并经过营养体增殖。
四、芽孢杆菌判定
经过上述分离筛选，我们取得了比较有价值杆菌MA139，不过这株杆菌还没有经过生理生化判定，我们只是从筛选过程中表现发酵特征方面初步认为是芽孢杆菌。在投入应用前，我们必需做严格判定。
1. 形态学判定
首优异行形态学判定，观察其单菌落形态，并对活细胞进行革兰氏染色及芽孢染色。MA139细胞呈直杆状，芽孢椭圆形近中生，孢囊不膨大。在MNA培养基上培养12h，产生黏液，细胞形态为长杆状；24h后菌落圆形，隆起，表面皱褶，不透明，干燥；培养至36h，菌体均以休眠体芽孢形式存在，菌落呈白色[图2-8（1）]。在液体静止培养时有菌膜形成。

图2-8

2. 生理生化判定
形态判定结果（图2-8）符合芽孢杆菌特征，接着进行生理生化判定。生理生化判定比较复杂，包含操作步骤很多。参考《常见细菌细菌系统判定手册》中方法，对试验菌种进行糖醇发酵试验、需氧性测定、V-P试验、淀粉水解试验、明胶水解试验、过氧化氢酶试验、柠檬酸盐利用试验、石蕊牛奶试验等。
芽孢杆菌判定用培养基以下：
（1） 糖醇发酵培养基及葡萄糖产气试验
培养基组成：（NH4）2HPO4 1.0g/L;MgSo4·7H20 0.2g/L；酵母浸膏0.2g/L。
配好后加入2%溴百里香兰指示剂1mL/L，调整pH为7.2，分别加入1%底物（糖醇或葡萄糖），根据底物类型分装试管，并将杜兰管口朝下放入试管，115℃灭菌30min。
（2）运动型培养基 琼脂：3g/L;牛肉膏：3.0g/L;氯化钠：5.0/g；蛋白胨：10g/L。pH7.0~7.2。121℃灭菌15min。
（3）V-P试验培养基 蛋白胨：5.0g/L；K2HPO4:5.0g/L;葡萄糖：5.0g/L。pH7.0±0.2。2mL/支分装试管，121℃灭菌15min。
（4）耐盐性试验培养基 营养肉汤培养基分别加入2%、5%、7%、10%NaCl,pH7.0~7.2。121℃灭菌15min。
（5）石蕊牛奶试验培养基 石蕊乙醇溶液25mL，脱脂牛奶1000mL，4mL/支分装试管，115℃灭菌15min。
（6）柠檬酸盐试验培养基 NaCl:5.0g/L；MgSO4·7H20:0.2g/L；（NH4）H2PO4：1.0g/L；K2HPO4：1.0g/L；柠檬酸钠：5.0g/L溴百里草酚兰（浓度为4%）。pH6.8±0.2。分装试管，121℃灭菌15min。
（7）明胶水解培养基 蛋白胨：0.5%；明胶：10%~15%。pH7.0~7.2。分装试管，115℃灭菌20min。
（8）淀粉水解试验培养基 可溶性淀粉：20g/L；KNO3：1.0g/L；NaCl:0.5g/L；K2HPO4：0.5g/L；MgSO4·7H2O:0.1g/L；琼脂：2.0g/L。pH7.0~7.2。121℃灭菌15min。
（9）厌氧生长试验培养基 营养肉汤培养基，分装厌氧试管，充氮除氧，121℃灭菌15min。
生理生化试验结果见表2-9。
表2-9 试验菌生理生化试验结果
项 目
MA139
项 目
MA139
葡萄糖发酵
+
葡萄糖产气
-
麦芽糖发酵
+
运动性
+
棉籽糖发酵
+
厌氧生长
-
乳糖发酵
+
淀粉水解试验
+
甘露醇发酵
+
H2