土霉素发酵工艺模板.doc

1 引言生物工程产品工艺学课程设计，首先要求综合应用生物、发酵工程、代谢控制发酵工程和CAD制图等课程理论知识，以掌握微生物发酵中常见代谢控制方法、产品工艺设计方法和设计步骤，其次又要依据设计对象具体特征，凭借设计者经验（或借鉴前人经验），了解设计诀窍，对设计参数等做合理选择和优化，这往往成为设计能否成功关键所在，也是设计区分于习题关键方面。1.1 土霉素发展现实状况在上世纪6070年代，土霉素曾经在中国抗菌药市场上占据着关键位置，但自80年代中后期起，土霉素市场就开始逐步下滑，大批企业前后放弃了生产。二十一世纪初，全国土霉素产量已从20世纪80年代2万吨下降到1吨，现在产量已不到1万吨，生产企业从几十个降低到只有多个。现在关键生产企业为石家庄华曙制药、内蒙古赤峰制药、山西星火制药等。其中石家庄华曙制药规模和产量最大，达6000吨左右，约占世界总产量1/4。伴随土霉素产量不停下降，出口量也逐年降低，出口价格一路走低。1995年，中国土霉素出口价格为11.5美元/千克，1998年为10美元/千克，已降到7美元/千克。多年来，出口量和出口价格还在下滑。在中国市场上，土霉素除了作为生产强力霉素等原料外，关键用于畜禽药品和饲料添加剂，临床用药微乎其微。在发达国家，土霉素已基础不再使用，发达国家畜牧业中用也是纯度高无菌土霉素。中国生产土霉素大部分为低级产品，未来几年出口形势将十分严峻。1.2 土霉素应用（1）土霉素为四环类抗生素，生产工艺简单、生产成本较低，可作为生产其它新型抗生素原料。（2）土霉素价格低廉，能够作为饲料添加剂用于养殖业。实践表明：土霉素用于饲料添加剂，能够改善饲料转化效率，促进畜禽生长，提升畜禽抗疾病能力。（3）土霉素是广谱抗生素，对多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌全部有抗菌作用。临床上关键用于肺炎，败血症，斑疹，伤寒了，淋巴肉芽肿，砂岩及其它细菌性感染等，对伤寒有效，也可用于阿米巴痢疾和阴道滴虫病患者。另外还能抑制立克次体和砂岩病毒及淋巴肉芽肿病毒 。2 土霉素及发酵微生物介绍2.1 土霉素化学式及性状土霉素又名氧四环素，化学名是：(4s,4R，5S，5R，6S，12S）-N-4-二甲胺基-1，4，4，5，5，6，11，12-八氢，5, 6，10，12，12- 六羟基-6-甲基-1，11-二氧代并四苯-2-甲酰胺，为灰白色至黄色结晶粉末，无臭，味苦，熔点是180，在空气中性质稳定，在日光下颜色变暗在碱性溶液中易破坏失效。土霉素盐酸盐为黄色结晶，味苦，熔点190194，有吸湿性，但水分和光线不影响其效价，在室温下长久保留不变质，不失效。盐酸盐易溶于水，溶于甲醇，微溶于无水乙醇，不溶于三氯甲烷和乙醚，在酸性条件下不稳定。添加到饲料中，在室温下保留四个月，效价下降4%9%，制粒时效价下降5%7%1。土霉素化学式：C22H24N3O9，R=H，R=CH3，R=OH，齐结构示意图图1-1所表示： 图1-1 2.2 作用机理（1） 改变致病微生物结构和干扰其代谢过程，如阻碍细胞壁合成，影响细胞黏膜通透性，阻碍蛋白质合成，改变核酸代谢。（2） 能抑制动物肠道内有害微生物，激活大肠中有利于营养物质合成微生物。（3） 土霉素可使动物肠壁变薄，更有利于营养物质吸收和利用，从而提升肠道吸收效率。2.3 发酵微生物土霉素是由龟裂链霉菌产生，属于放线菌中链霉菌属，她们含有良好菌丝体，菌丝体分支，无隔膜，直径约0.41.0米，长短不一，多核。菌丝体有营养菌丝、气生菌丝之分，孢子丝再形成份生孢子。而龟裂链霉菌菌落呈灰白色，后期生褶皱，成龟裂状。菌丝成树枝分支，白色，孢子灰白色，柱形。3 土霉素生物合成代谢调控土霉素属于四环素类抗生素，是一大类广谱抗生素，她们化学结构中全部含有二甲氨基，酰胺基，酚羟基和两个含有酮基和烯醇基共轭双键系统，即全部含有氢化直骈四苯基础结构，含有共同碳架。四环素类抗生素生物和成及调控过程中，起始化合物是丙二酰胺辅酶A，它同8个丙二酰辅酶A分子反复缩合脱羧，形成一个直链化合物-多酮次甲基链，然后经过反复闭环等反应，形成四环素类抗生素。土霉素代谢调控机制控制关键有磷酸盐调整作用、ATP调整调整等2。3.1 抗生素生物合成和糖代谢路径关系在一些抗生素发酵过程中，不一样时期糖代谢路径是不一样。从菌体生长久转变为抗生素分泌期，糖代谢路径也发生改变，可见，抗生素生物合成和糖代谢路径有着一定关系。四环类抗生素这类聚酮体衍生物合成，需要还原型辅酶（NADPH），而且NADPH还可能是限制原因，它浓度大小决定体外醋酸盐进入聚酮体或脂肪酸数量。不过，NADPH又只是来自戊糖循环，该循环酶活性强弱直接影响NADPH产量，所以，过量磷酸盐或通气会严重干扰土霉素合成，使产生NADPH戊糖循环受阻。3.2 抗生素生物合成和三羧酸循环、脂肪酸代谢关系已知四环类抗生素碳架，是由乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A合成。这些前体物质是糖代谢中间体或衍生物，通常影响合成抗生素前体物质形成反应，全部会影响抗生素生物合成。有些前体物质，不仅可供合成抗生素之用，还可进入三羧酸循环等初级代谢路径而被消耗。乙酰辅酶A既可和草酰乙酸反应形成柠檬酸，然后进入三羧酸循环而被氧化，又能够形成脂肪酸和聚酮体，所以成为代谢路径中三岔路口，伴随菌体代谢机能差异而调整它代谢路径。还原型辅酶（NADPH）不足可能是产生菌选择合成四环素路径和停止合成脂肪酸关键原因。所以，从能量见解来看，利用丙二酸单位来合成土霉素，对产生菌是有利。3.3 抗生素生物合成和生物能量关系现在认为，细胞ATP（或EC）很可能是控制抗生素合成基因表示一个效应剂，低水平ATP可能是发酵单位标志，高水平ATP可能抑制抗生素形成。3.4 抗生素发酵代谢调控图（见附图1）4 土霉素发酵工艺4.1 菌种选育和制备用微生物发酵方法生产抗生素，首先要有一个性能良好菌种，从自然分离野生菌种因为生产能力低，往往不能满足工业上需求。所以工业上常见菌种全部是经过人工选育，含有工业生产要求，性能优良菌种。本设计中，土霉素发酵生产菌株为龟裂链霉菌，属放线菌。4.1.1 标本采集土壤是微生物聚集最丰富场所，菜园和农田耗作层土壤含有丰富有机物常以细菌和放线菌居多。采土时先用小铲除去表土，取515cm深处土样，选好35点，每点取土10g混在一起装入灭过菌牛皮纸袋，并统计时间、地点、植被等情况，以备考察3。4.1.2 标本预处理因为土霉素产生菌龟裂链霉菌属放线菌中链霉菌属，又因为放线菌孢子（如链霉菌）愈加耐热，所以常采取热处理方法降低材料中细菌数。取到菌样在用土壤、根土组成培养基中富集培养。要求：9cm直径平皿培养，加入3545ml培养基，培养基温度在100培养1h或40培养26h。待培养基上长出菌落后，依据龟裂链霉菌菌落外观标准判定。龟裂链霉菌菌落外观：菌落较小而致密，不易挑取，菌落呈皱状裂纹。孢子丝初旋至螺旋形。孢子长圆形至柱形，表面光滑。 由此可断定为龟裂链霉菌。4.1.3 所需菌种分离筛选抗生素生产菌方法包含抑菌圈法、稀释法、扩散法、生物自显影法等。本设计采取稀释法，稀释法又可分为液体稀释法和固体稀释平板倾注法。这里采取后者。先将待分离材料作一系列稀释(如1:10、1:100、1:1000、1: 10000)，然后分别取不一样稀释度溶液少许，和已熔化并冷却至45琼脂培养基相混合摇匀后，倒入灭过菌培养皿中，待琼脂凝固后，保温培养一定时间即可出现菌落。假如稀释适当，平皿上可出现分散单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌或微生物繁殖而成，随即挑取该单个菌落，或反复以上操作数次，便可得到纯培养。4.1.4 菌种培养以麸皮、琼脂作为天然培养基，在37保温箱中培养，至培养基中部分出现成熟颜色即可进行保藏。4.2 诱变育种从自然环境中分离菌种生产能力有限，通常不能满足生产实际需要。诱变育种是提升菌种生产能力，使所需要某一特征代谢产物过量积累有效方法之一。诱变育种理论基础是基因突变，通常包含诱变和筛选两个部分，诱变育种是诱变和筛选过程不停反复，直到取得高产菌株。4.2.1 出发菌株选择用来进行诱变出发菌株性能对提升诱变效果和效率十分关键，诱变出发菌株要有一定目标产物生产能力。因为野生型菌株生产性能较差，通常采取经历过生产条件考验菌株，这么菌株队诱变剂敏感性会有所提升。4.2.2 菌悬液制备在诱变育种中，所处理细胞必需是均匀状态单细胞悬液。分散状态细胞能够均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落。因为在很多微生物细胞内同时含有多个核，所以即使用单细胞悬浮液处理，还是轻易出现不纯菌落。有时，即使处理是 单核细胞或孢子，但因为诱变剂通常只作用于DNA双链中某一条单链，故某一突变无法反应在现代表型上。因为上述原因，故在诱变霉菌或放线菌时，应处理它们孢子。在实际工作中，要得到均匀分散细胞悬液，通常可用无菌玻璃珠震荡5min，来打散成团细胞，然后再用脱脂棉过滤，得到分散菌株。菌悬液介质通常见生理盐水。4.2.3 诱变剂处理诱变包含物理、化学、生物诱变，本设计利用物理诱变，方法及步骤以下：紫外线诱变处理：将制备好菌悬液于无菌培养皿中，置波长为253.7nm，15W紫外灯下60cm处开盖，进行振荡照射。4.2.4 突变菌株筛选诱变处理后，正向突变菌株通常为少数，需进行大量筛选才能取得高产菌株。在抗生素生产菌选育中，应筛选抗生素抗性突变株。初筛：选择适合于抗生素产生菌抑制圈法进行初筛。待筛选菌株能分泌产生一些能抑制工具菌生长物质，或能分泌某种酶并将无毒物质水解成对工具菌有毒物质，从而在该菌落周围形成工具菌不能生长抑菌圈。方法：将培养后单菌落连同周围小块琼脂用穿孔器取出，以避免其它原因干扰，移入无培养基平皿，继续培养45天，使抑制物积累，此时抑制物难以渗透到其它地方，再将其移入涂布有工具菌平板，每个琼脂块中心间隔距离为2厘米，培养过夜后，即会出现抑菌圈。抑菌圈大小反应了琼脂块中积累抑制物浓度高低。选择抑制圈大菌落接入斜面备用。复筛：将经过初筛后少数菌株接种于增殖培养基中培养13小时后，接种于锥形瓶发酵培养基中进行往复式摇床震荡培养，即得到药瓶种子。4.3 菌种保藏菌种保藏方法有：斜面菌种低温保藏法、沙土管干燥保藏法、甘油封藏法、真空冷冻干燥法等4。本设计采取砂土管干燥保藏法，这种保藏法适适用于产生孢子真丝状真菌和放线菌，或形成芽孢细菌。4.3.1 保藏原理及沙土管制备方法沙土管干燥保藏法原理是造成干燥寡营养条保藏条件。制备方法：首先将沙和土分别洗净烘干并过筛（通常沙用80目过筛，土用100目过筛），按沙和土百分比12：1混合均匀，分装于小试管中，分装高度约为1cm左右，121高压间歇灭菌23次，无菌试验合格后烘干备用。4.3.2 保藏方法和操作步骤方法：将需保藏菌种经斜面培养后用无菌水制成孢子悬液，加入经灭菌处理沙和土混合物（或纯沙亦可）作为载体，减压抽去水分，这些吸附有孢子干燥沙土载体，在低温下保留。操作步骤：斜面孢子先加灭菌蒸馏水22.5ml，沿斜面轻刮孢子后，再吸0.20.3 ml到灭菌备用沙土管中，在真空度100 Pa以下进行干燥，直至沙土管外貌呈松散状态，然后低温（4）保留。经真空干燥后沙土管，最好放在密闭容器内，通常保留期为两年左右5。4.4 培养基配置微生物生长、繁殖、代谢和产物合成全部需要营养，人工配置培养基能够为微生物提供所必需营养，除此之外，培养基还为微生物生长提供必需生长环境。培养基根据用途能够分成孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。4.4.1 孢子培养基孢子培养基配置目标是供菌种繁殖孢子，常采取是固体培养基。对这类培养基要求是能使菌体生长快速,产生数量多而且优质孢子,而且不会引发菌体变异。培养基营养不要太丰富，尤其是有机氮源要低部分，不然孢子不易形成。无机盐浓度要合适,不然会影响孢子颜色和数量。应注意培养基pH值和湿度。4.4.2 种子培养基种子培养基时供孢子发芽、生长和菌体繁殖。这类培养基碳源应该提供速效碳源如葡萄糖等；氮源也要提供部分易于利用；磷酸盐浓度能够合适高部分；总而言之要相对丰富、完全、并要考虑能够维持稳定pH值。最终一级种子培养基成份应该较靠近发酵培养基，方便种子进入发酵培养基后，能快速适应发酵环境。4.4.3 发酵培养基发酵培养基既要有利于生长繁殖，预防菌体过早衰老，又要有利于产物大量合成。要求培养基组成应丰富、完全，碳、氮源要注意速效和迟效相互搭配，少用速效营养，多加迟效营养，还要考虑合适碳氮比，加缓冲剂稳定pH值；而且还要有菌体生长所需生长因子和产物合成所需元素、前体和促进剂等。4.5 培养基营养要求4.6.1 水 水是一切生物生存基础条件，是全部培养基关键成份，也是微生物机体关键组成成份。水是良好溶剂，又是活细胞中一切代谢反应媒介物，还能够维持细胞中渗透压，同时，水比热高，又是热良导体，能有效地吸收代谢过程中产生热量，使细胞温度不致于骤然升高，能有效调整细胞内温度。4.5.2 碳源 凡能提供微生物营养所需碳元素(碳架)营养物质称为碳源。碳素是组成菌体成份关键元素，又是产生多种代谢产物和细胞内贮藏物质关键原料。抗生素发酵中可选择葡萄糖做为碳源。4.5.3 氮源氮源是组成蛋白质和核酸关键元素，酶本身即为蛋白质。所以，氮源是必不可少关键原料。常见有机氮源油花生饼粉、豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉等。常见无机氮源有铵盐、硝酸盐和氨水等。抗生素发酵中多选择玉米浆和黄豆饼粉作为氮源，其中含有磷酸肌醇对土霉素生产有主动促进作用。发酵补料过程中选择用于辅助氮源氨水。4.5.4 无机盐类及微量元素多种微生物在生长繁殖和生产代谢产物中，需要磷、镁、硫、铁、钾等无机盐和微量元素作为酶激活剂、生理活性物质组成或生理活性作用调整剂。在土霉素发酵中，很轻易受到磷浓度影响，很多此生代谢产物产生多受磷酸盐浓度影响，必需严格控制。土霉素发酵中，选择碳酸钙为原料来提供无机盐和微量元素。4.5.5生长因子和促进剂酶生产中所需生长因子大多由天然原料提供。玉米浆、麦芽汁、豆芽汁和酵母等，含有丰富生长因子。促进剂是一类刺激因子，它们并不是前体或营养，这类物质加入或能够影响微生物正常代谢，或促进中间代谢产物积累，或提升次级代谢产物产量6。4.6 龟裂链霉菌培养基及其培养条件斜面孢子培养基：麸皮85%，琼脂15%，水100%种子培养基(g/L)：KH2PO40.592，黄豆饼粉16.5，葡萄糖4.93，碳酸钙0.15，硝酸钾0.15，玉米油0.236，油酸甘油酯4.02，豆油9.045，硅油0.021。发酵培养基(g/L)：KH2PO41.63，黄豆饼粉45.30，葡萄糖16.42，碳酸钙0.15，硝酸钾0.15，玉米油0.79，油酸甘油酯3.42，豆油7.53，硅油0.056。发酵培养基补料(g/L)：油酸甘油酯16.571，豆油19.333，氨水（26%）12.2646。全部培养基全部在121，0.1MPa灭菌30min。酸性蛋白酶生产中，种子培养初始温度控制在30C左右；发酵全程31-30C分段培养。发酵周期为190h。4.7 种子扩大培养及孢子制备4.7.1 种子扩大培养种子扩大培养是指将保留在砂土管、冷冻干燥管处于休眠状态生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐层扩大培养而取得一定数量和质量纯种过程。本发酵属于二级种子罐扩大培养，三级发酵。设计步骤以下：孢子种子斜面孢子种子摇瓶一级种子罐二级种子罐发酵罐4.7.2 制备母液斜面孢子将保留在冷冻干燥管中土霉素生产菌，在无菌室超净工作台上接种于已灭菌斜面培养基上，于 3536培养，取出放入冰箱（26）保留备用。 4.7.3 制备子瓶斜面孢子将生长好且在冰箱存放一周以上母瓶取出，制成菌悬液接种于子瓶斜面上，于 3536恒温室培养，培养好子斜面，测摇瓶效价合格后保留在26冰箱中备用。 4.7.4 种子摇瓶一段时间后，将孢子用无菌水移接到装有种子培养基三角瓶中，在3437下静置培养40h，待长出大量孢子后，将其孢悬液接入一级种子罐内进行扩大培养7。4.8 发酵工艺控制微生物发酵生产中，必需硕士产菌种最好发酵工艺，如营养要求、培养温度、pH条件、对氧需求等，据此设计合理发酵工艺，使生产菌种处于最好产物合成条件下，才能取得优质高产效果。4.8.1 发酵过程中温度影响及控制对微生物发酵来说，温度影响是多方面，能够影响多种发酵条件，最终影响微生物生长和产物形成。在抗生素发酵中，细胞生长和代谢产物积累最适温度往往不一样。在生长早期，抗生素还未开始合成，菌丝体浓度很低时，以促进菌丝体快速生长繁殖为目标时，应该选择适于菌丝体生长温度当菌丝体浓度达成一定程度，到了抗生素分泌期时，此时生物合成成为关键方面，就应该满足生物合成最适温度，这么才能促进 抗生素大量合成。在土霉素发酵中，采取变温控制，种子培养初始温度控制在351C，发酵阶段发酵温度控制在3234C，在中后期保持较低温度，以延长抗生素分泌期，放罐前24h提升23C培养，能使发酵单位提升8。4.8.2 发酵过程中pH影响及控制微生物生长和生物合成全部有其最适和能够耐受pH范围，放线菌生长最适pH范围是78，土霉素发酵用菌种龟裂链霉菌生长繁殖阶段最适pH范围和产物形成阶段最适pH范围是不一致。其菌体生长最适pH范围：6.06.6，产物形成最适pH范围：5.86.1。当接种后发酵pH低于6.4时就能够开始通氨，通氨量多少参考pH值，要求100小时前pH在6.3-6.5，100小时候pH在6.2-6.3，放罐前8小时停止通氨。通常情况下，培养基成份中(C/N)高，发酵液倾于酸性，pH低；(C/N)低，发酵液倾向于碱性，pH高。pH和通气量关系是：通气量大，糖、脂得到完全氧化，最终产物为CO2和H2O；假如通气量不足，糖、脂不完全氧化，则产物为中间产物有机酸，这些使培养基pH会不一样程度降低。不一样盐利用对pH也会产生影响，如（NH4）2SO4被利用则pH下降；而部分生理碱性盐（如NaNO3）酸根被利用则造成发酵液pH上升；在碳源严重不足，微生物被迫利用氨基酸碳架，留下NH3，pH亦可能上升。pH这些改变情况，常常引发细胞生长和生产环境改变，对生产带来不利影响。所以生产中常采取部分pH控制方法，通常有：添加缓冲液维持一定pH；调整通风量维持发酵液氧化还原电在一定范围；调整培养基原始pH，保持一定(C/N)；当发酵液pH过高时用糖或淀粉来调整，pH过低时，经过氮调整。4.8.3 发酵过程中CO2影响及控制CO2是微生物代谢产物，同时也是一些合成代谢一个基质，它是细胞代谢关键指示。溶解在发酵液中CO2对氨基酸、抗生素等微生物发酵含有刺激或抑制作用。土霉素发酵中，需要控制一个最好CO2分压，才能取得最高产量。能够经过提升通气量和搅拌速率，在调整溶解氧同时，还能够调整CO2浓度，通气使溶解氧保持在临界值以上，CO2又可伴随废弃排出，使其维持在引发抑制作用浓度之下；降低通气量和搅拌速率，有利于提升CO2在发酵液中浓度。4.8.4 发酵过程中溶氧影响及控制发酵中能够改变通风量和搅拌速率，来实现对溶氧控制。（1）通风量影响：发酵过程中，通风量多少应依据培养基中溶解氧而定。通常来说，在发酵早期，即使年轻细胞呼吸强度大，耗氧多，但因为菌体少，相对通气量能够少些；菌体生长繁殖旺盛时期，耗氧多，要求通风量大些；生产旺盛时通风量因菌种和酶种而定，通常需要强烈通风；但也有例外，通风量过多反而抑制酶生成。所以，菌种、酶种、培养时期、培养基和设备性能全部能影响通风量，从而影响酶产量。用于土霉素生产微生物龟裂链霉菌为好气性微生物，生产上普遍采取自动测定和统计溶解氧仪表进行控制。土霉素发酵生产过程中，通气比应控制在1:0.8-1.0vvm。（2）搅拌影响：对于好气性微生物深层发酵，除了需要通气外，还需要搅拌。搅拌有利于热交换、营养物质和菌体均匀接触，降低细胞周围代谢产物，从而有利于新陈代谢。同时可打破空气气泡，使发酵液形成湍流，增加湍流速度，从而提升溶解氧，增加空气用量。当搅拌速度关键因菌体大小而异，因为搅拌产生切应力，易使细胞受损。同时搅拌也带来一定机械热，轻易使发酵温度发生改变。搅拌速度还和发酵液粘度相关。土霉素发酵生产过程中，搅拌转速可依据发酵不一样阶段需要进行调整，使溶解氧不低于饱和溶解氧浓度30%。4.8.5 发酵过程中泡沫影响及控制在微生物好气培养中，发酵液为往往产生很多泡沫，这是正常现象。泡沫存在阻碍了CO2排除，影响溶氧量，同时泡沫过多影响添料，也轻易使发酵液溢出罐外。所以，生产上必需采取消泡方法。消除可控制泡沫方法关键包含机械消沫和消沫剂消沫两大类。机械消沫是利用物理作用，靠机械强烈振动或压力改变促进泡沫破碎；消泡剂关键是部分天然矿物油类、醇类、脂肪酸类、胺类、酰胺类、醚类、硫酸酯类、金属皂类、聚硅氧烷和聚硅酮，其中聚甲基硅氧烷最好。中国常见聚氧丙烯甘油醚或泡敌（聚环氧丙环氧乙烷甘有醚）。理想消泡剂，其表面相互作用力应低，而且应难容于水，还不能影响氧传输速率和微生物正常代谢。土霉素发酵中，通常伴随菌体生长繁殖旺盛和抗生素积累而泡沫上升，所以消泡应视具体情况而定。4.8.6 发酵过程中染菌控制在工业发酵中，染菌轻则影响产品质和量，重则倒罐或停产，影响工厂效益。所以要严格无菌操作，种子灭菌要根本，净化空气设备，操作要慎重，设备灭菌要根本。若在前期染菌，应重新灭菌；中期染菌，应偏离杂菌生长条件；后期染菌，可提前或立即放罐。 4.9 发酵工艺步骤图（见附图2）5 土霉素提取工艺5.1 发酵液预处理和固液分离预处理目标是将难溶于水高价金属离子螯合物溶解，使土霉素以盐形式溶解到发酵液中。5.1.1 酸化（1） 酸化过程：酸化过程常采取草酸酸化，使菌丝中土霉素释放出来并生成溶于水盐，而且能析出草酸钙沉淀，从而除去发酵液中钙离子，同时草酸钙能促进蛋白质凝结，从而提升滤液质量。另外，草酸属于弱酸，其对设备腐蚀性要比硫酸、盐酸好。（2） pH控制：加入草酸目标是释放菌丝中单位，同时要确保土霉素稳定性、成品质量和提炼成本。现在，工业提炼pH控制在1.62.0范围内，pH过高对单位释放不利，pH过低会影响产品质量，同时增加产品成本9。（3） 发酵液去杂：发酵中存在着很多有机和无机物质，加入净化剂除去铁离子和蛋白质。去杂过程采取净化剂是黄血盐和硫酸锌，利用二者协同效应除去蛋白质，同时除去铁离子。5.1.2 稀释将发酵液进行合适稀释，通常稀释23倍，有利于过滤和脱色过程。5.1.3 过滤发酵液经过预处理后能够经过板框过滤机进行过滤，实现固-液分离。工业上采取低单位滤液和草酸水洗滤饼以提升收率。5.2 脱色和结晶采取122-2树脂对滤液进行脱色，其原理是利用122-2树脂为阳离子交换树脂，处理为氢型树脂后，所带氢离子和色素蛋白中氮、氧形成氢键，对过滤液中色素有吸附作用，可进行脱色。土霉素脱色液加入碱化剂15%氨水后，调pH到等电点周围，使土霉素从脱色液中直接沉淀出来。5.3 分离洗涤和气流干燥将上述结晶液甩滤后用水淋洗，再甩干，可得到湿晶体。将到湿晶体进行气流干燥，采取进风140170，出风7080气流进行湿晶体干燥，便得到土霉素碱成品。5.4 提取工艺步骤图（见附图3）总结课程论文设计是培养学生综合利用所学知识,发觉、提出、分析和处理实际问题,锻炼实践能力关键步骤,是对学生实际工作能力具体训练和考察过程。我们必需认真对待，好好把握每一个步骤，以一个工程师要求要求自己，让自己在这种难得机会中好好历练自己，让自己在学习和思索中充实。经过这次课程设计使我知道了理论和实际相结合是很关键，只有理论知识是远远不够，只有把所学理论知识和实践相结合起来，从理论中得出结论，才能真正为社会服务，从而提升自己实际动手能力和独立思索能力。在设计过程中碰到问题，能够说得是困难重重，这毕竟是专业课程设计，不能有一丝马虎和不小心。所以，难免会碰到过多种多样问题，同时在设计过程中发觉了自己不足之处，对以前所学过知识了解得不够深刻，掌握得不够牢靠。经过这次课程设计以后，一定要把以前所学过知识重新温故。 这次课程设计最终顺利完成了，在设计过程中碰到了很多问题，最终在贾万利老师辛勤指导下，还有和做同种设计题目标同学探讨下最终游刃而解了。这是我们意志、耐力和心灵上胜利，相信这些全部必将成为我们人生宝贵财富。在这次课程设计中我学了很多知识，不只是书本上知识，还有部分生活中道理，比如做什么事情全部要有始有终，要坚持到底。还要加强自己动手能力，使自己知识愈加充实，比如要熟悉掌握Word操作和AutoCAD绘图多种技巧。最终真挚感谢史楠老师指导！谢谢！参考文件1 微生物工程 曹军卫，马辉文编著 北京：科学出版社，.82 代谢控制发酵 张克旭等编著 北京：中国轻工业出版社，.53 新编生物工艺学上册 俞俊堂，唐孝宣 北京化学工业出版社 4 微生物工程 曹军卫，马辉文编著 北京：科学出版社，.85 新编生物工艺学上册 俞俊堂，唐孝宣 北京化学工业出版社 6 生物工程工厂设计概论 吴思芳主编 北京：中国轻工业出版社，.67 生物工艺原理 贺小贤 北京：化学工业出版社，8 微生物工程 曹军卫，马辉文编著 北京：科学出版社，.89 新编生物工艺学下册 俞俊堂，唐孝宣 北京化学工业出版