NLRP3炎症小体在小鼠手...诱导全身性炎性反应中的作用_蒋鑫.pdf

宁夏医科大学学报45卷手术是现代医学治疗疾病的重要方式，但手术创伤引发的并发症近年越来越受到关注，大量临床研究表明，术后并发症多以炎性反应为基础1-2，如心脏手术后的急性肾损伤3、认知功能障碍以及腹部大手术后的肺损伤4-5。因此，如何有效防治术后炎性反应成为亟须解决的临床问题6-7。NLRP3（NOD-like receptor protein 3）是NOD 样受体蛋白家族成员，其在 NLRP3 炎症小体中承担着接收炎性信号的作用8。NLRP3 主要由 3 个结构域组成，包括中央核苷酸结合和寡聚化（NACHT）结构域，富含亮氨酸的重复序列（LRR）以及 pyrin 结构域（PYD）9。当肿瘤坏死因子-（tumor necrosis factor-，TNF-）和白细胞介素（interleukin，IL）-1 等炎性信号刺激 LRR 后，NACHT 结构域会促使 PYD 结构域与凋亡相关斑点样蛋白（ASC）结合，将半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1 前体（pro-caspase-1）剪切成活化的caspase-110-11，活化的 caspase-1 将促进 IL-1 和IL-18 剪切成熟12，诱发炎性级联反应13-15，造成多个器官损害16-18。虽然 NLRP3 炎症小体活化是炎性发展的关键因素之一，但 NLRP3 炎症小体是否参与外周手术诱导全身无菌性炎性反应尚不明确。为此，本研究通过动物实验来探讨 NLRP3 炎症小体在外周手术介导的全身性炎性反应中的作用，以期为炎性相关术后并发症的防治提供实验基础。1材料与方法1.1材料本研究通过了宁夏医科大学伦理委员会批准（2018-020）。14 只 8 周龄雄性 C57BL/6J 小鼠（253）g 采购并饲养于宁夏医科大学实验动物中心。NLRP3 抗体（ab263899）购于 Abcam 公司。BCA 蛋白定量试剂盒购自凯基生物技术股份有限公司。IL-1（EK0394）和 IL-18（EK0433）ELISA试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。总RNA 提取试剂盒（AP-MX-MS-RNA-10G）购自康宁公司，第一链 cDNA 合成试剂盒、定量 PCR 试剂盒（AQ601）均购自北京全式金生物技术股份有限公司，所有引物由通用生物（安徽）股份有限公收稿日期：2022-11-21基金项目：国家自然科学基金项目（81860213）；宁夏自然科学基金项目（2022AAC02061）作者简介：蒋鑫（1990），男，在读硕士研究生，研究方向：术后认知功能障碍的机制与预防。E-mail：jiangxin_通信作者：马刚，男，硕士研究生导师，研究方向：术后认知功能障碍的机制与预防。E-mail：NLRP3 炎症小体在小鼠手术模型诱导全身性炎性反应中的作用蒋鑫1，2，任艺1，3，柳媛媛4，汪蕊1，3，马刚2（1.宁夏医科大学临床医学院，银川750004；2.宁夏医科大学总医院麻醉科，银川750004；3.宁夏医科大学总医院消化内科，银川750004；4.宁夏医科大学基础医学院，银川750004）摘要：目的探讨全身性炎性反应中 NLRP3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体的作用。方法将8 周龄雄性 C57BL/6J 小鼠随机分为对照组和手术组（每组 7 只），双侧颈动脉暴露手术后 24 h 收集小鼠血浆、肝脏、脾脏和脑组织，采用定量聚合酶链式反应法（qPCR）检测不同组织中白细胞介素（interleukin，IL）-1和 IL-18 的 mRNA 表达水平，采用 Western blot 检测 NLRP3 蛋白表达水平，酶联免疫吸附法（ELISA）检测 IL-1 和 IL-18 浓度。结果与对照组相比，手术组小鼠血浆 IL-1 表达水平增高（P0.01），肝脏和脾脏 IL-1 mRNA、IL-18 mRNA 和 NLRP3 蛋白也增加（P 均0.05）。在脑组织中，与对照组相比，手术组小鼠 IL-1 和 IL-18的 mRNA 水平均增高（P均0.05）。ELISA 法检测结果显示，手术组小鼠脑组织 IL-1 和 IL-18 蛋白水平均高于对照组（P 均0.01）。Western blot 结果显示，手术组 NLRP3 蛋白水平较对照组增多（P0.05）。结论手术介导的全身性炎性反应与 NLRP3 炎症小体途径有关。关键词：手术；NLRP3 炎症小体；全身性炎性反应中图分类号：R364.5文献标识码：ADOI：10.16050/ki.issn1674-6309.2023.04.007文章编号：1674-6309（2023）04-0370-06论著第 45 卷4 期2023 年 4 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University3704期司合成。1.2方法1.2.1动物模型建立小鼠饲养环境整洁安静，饲养条件维持 12 h/12 h 白昼循环光照，室温（242），相对湿度 60%80%，小鼠自由摄食和饮水。适应性饲养 1 周后，随机分为对照组和手术组（7 只/组）：对照组不做任何处理；手术组依据文献方法19，采用双侧颈动脉剥脱手术，即禁食 12 h 后称重，然后经腹腔注射 4%的水合氯醛（按剂量：0.1 mL/10 g）麻醉，颈前部剃毛，采用碘伏消毒。麻醉诱导 10 min 后，切 2.2 cm 的中线颈部切口，分离出 1 cm 长的双侧颈动脉，在避免损伤迷走神经的情况下，机械刺激血管壁 100 次。生理盐水冲洗伤口后，缝合手术部位。全程在无菌条件下进行，持续 30 min。麻醉期间，恒温加热毯维持小鼠体温在 37 C。处理 24 h 后，麻醉小鼠并采集小鼠血液样本，颈椎脱臼处死小鼠后收集肝组织、脾组织及脑组织用于后续实验。1.2.2定量 PCR 检测不同组织 IL-1 和 IL-18mRNA 表达采用动物组织总 RNA 提取试剂盒在术后 24 h 提取小鼠肝脏、脾脏和脑组织中总RNA，参照第一链 cDNA 合成试剂盒说明书进行逆转录反应。取逆转录反应产物，参照 mRNA 实时荧光定量试剂盒说明书实施 qPCR 扩增。反应程序：94 30 s，94 5 s，60 30 s，共 44 个循环，GAPDH 为 mRNA 内参，经 2 Ct计算mRNA 相对表达量（表 1）。引物上游引物 5-3下游引物 5-3IL-1GAAATGCCACCTTTTGACAGTGTGGATGCTCTCATCAGGACAGIL-18AGTGAACCCCAGACCAGACTTCAGGTGGATCCATTTCCTCAAGAPDHGGTGAAGGTCGGTGTGAACGCTCGCTCCTGGAAGATGGTG表 1qPCR 采用的引物序列1.2.3Western blot 检测不同组织 NLRP3 蛋白表达情况术后 24 h 收集各组小鼠肝组织、脾组织和脑组织，用超声研磨仪在 4 条件下研磨1 min，并于冰上进行 30 min 裂解。随后，4、12 000g 离心 10 min 并收集上清液。BCA 法测定总蛋白浓度，进行 SDS-PAGE（120 V，60 min）。经 90 min 转膜后，用 50 g L-1脱脂牛奶封闭 1 h；兔抗 NLRP3 单克隆抗体（110 000）、兔抗-actin多克隆抗体（110 000）、兔抗 GAPDH 多克隆抗体（110 000）4 孵育过夜。洗膜后，加入 HRP标记的山羊抗兔 IgG（120 000），室温孵育 1 h。TBST 清洗后加入 ECL 反应底物并在暗室曝光和底片扫描，通过 Image J 计算蛋白质条带灰度值。1.2.4炎性因子 IL-1 和 IL-18 表达的检测采用 ELISA 检测试剂盒检测 IL-1 和 IL-18 浓度，收集各组全血和脑组织进行样品制备；血浆：全血于 4 1 000g 离心 10 min，取血浆检测；脑组织：组织按比例（100 mg 组织加入 1 mL 裂解液）与组织裂解液混合冰上裂解 30 min，4 11 000g 离心 5 min 取上清液检测。ELISA 试剂盒室温（2528）平衡 30 min；配制 1洗涤液；取出所需板条放置在框架内。设置标准孔和样本孔并加入标准品或待测样本；加入生物素标记抗体；37 恒温孵育 30 min；加入洗涤液反复洗板5 次；加入酶标抗体；恒温孵育结束后反复洗板5次；加入底物 A 和 B，混匀后封住反应孔孵育15 min；加入终止液终止反应，混匀后立即上机检测各孔的光密度（OD）值。以标准品浓度为横坐标，对应 OD 值为纵坐标在 Excel 工作表中绘制标准曲线，R20.99，按照曲线方程式得出各样本浓度。1.3统计学方法采用 GraphPad Prism 8.01 软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以均数标准差（xs）表示，两样本比较采用 t 检验，P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1手术诱发小鼠血浆炎性因子表达水平变化ELISA 法检测小鼠血浆炎性因子水平结果显示，术后24h手术组小鼠血浆中IL-1水平 （14.020.83）pg mL-1 高于对照组 （11.470.23）pg mL-1（P0.01）。2.2手术诱发小鼠肝脏 IL-1 mRNA、IL-18mRNA 和 NLRP3 蛋白表达水平变化qPCR 和 Western blot 检测结果表明，与对照组相比，手术组小鼠 IL-1 mRNA、IL-18 mRNA和 NLRP3 蛋白水平均增高（P 均0.05），见图 1。2.3手术诱发小鼠脾脏 IL-1、IL-18 mRNA 和NLRP3 蛋白表达水平变化qPCR 和 Western blot 结果显示，与对照组相比，手术组小鼠脾脏组织 IL-1 mRNA、IL-18 mRNA 和 NLRP3 蛋白水平均增高（P 均0.05），见图 2。蒋鑫，等.NLRP3炎症小体在小鼠手术模型诱导全身性炎性反应中的作用371宁夏医科大学学报45卷2.4手术对脑组织 IL-1 mRNA、IL-18 mRNA及其蛋白和 NLRP3 蛋白表达的影响qPCR 结果表明，手术组小鼠 IL-1 和 IL-18 的 mRNA 水平均高于对照组（P 均0.05）。ELISA 法检测结果显示，手术组小鼠脑组织 IL-1 和 IL-18 蛋白水平均高于对照组（P 均0.01）。Western blot 结果显示，手术组 NLRP3 蛋白水平较对照组增多（P0.05），见图 3。3讨论手术可以导致全身性炎性反应，若不能有效控制，则会引发一系列术后并发症20-22。本实验参考相关文献19，制作经典的颈动脉剥脱手术模型来观察手术对血浆、脑、肝脏等器官炎性反应的影响。本研究发现，小鼠术后 24 h 外周血中 IL-1较对照组增高，表明手术可以诱发血中炎性因子表达增高。研究23表明，手术可引起外周循环 IL-1 等炎性因子表达增高。但关于 NLRP3 炎症小体在其中作用的研究较少。NLRP3 炎症小体激活后可介导多种炎性疾病的发生、发展，推测手术后局部无菌性炎性反应可通过炎性因子和免疫细胞激活 NLRP3 炎症小体，产生更多的 IL-1，加重肝脏、脾脏、脑等重要器官损伤。肝脏存在大量的巨噬细胞等免疫细胞，这些细胞中含有丰富的 NLRP3 蛋白，NLRP3 在肝脏的急性损伤过程中起着关键作用24。本研究结果显示，肝组织中 NLRP3、IL-1 和 IL-18 表达在术后 24 h 增高，表明手术通过激活 NLRP3 炎症小体导致肝脏产生炎性反应。近期一项关于脾脏焦亡的研究发现，NLRP3、IL-1 和 IL-18 发挥着至关重要的作用25。本研究结果显示脾脏 NLRP3、IL-1 和 IL-18 表达增高，表明手术可通过NLRP3 炎症小体影响到脾脏的炎性反应。脑是炎症发生后最易受炎性因子侵犯的器官之一。炎性因子可通过直接和间接途径通过血脑屏障，引发大脑炎性级联反应20。大量的 IL-1积累可以引起神经细胞不同程度的损伤，从而影响到脑功能，这种损伤可以通过减少 IL-1 的产生来缓解26-27。也有研究28表明，抑制 IL-18 可以加速修复中枢神经系统的髓鞘，从而削弱神经反应后的损伤作用。本研究还发现，手术后脑组织IL-1 和 IL-18 的 mRNA 表达增高，同时，IL-1A：IL-1 mRNA；B：IL-18 mRNA；C：NLRP3 蛋白；*P0.05，*P0.01。图 1肝脏 IL-1 mRNA、IL-18 mRNA 和 NLRP3 蛋白表达水平比较A：IL-1 mRNA；B：IL-18 mRNA；C：NLRP3 蛋白；*P0.05，*P0.01。图 2脾脏 IL-1 mRNA、IL-18 mRNA 和 NLRP3 蛋白表达水平比较*对照组手术组对照组手术组对照组手术组对照组手术组118 KD37 KDNLRP3GAPDHCAB1.51.00.50.043210543210脾组织 NLRP3 蛋白表达量脾组织 IL-1 mRNA 的相对表达量脾组织 IL-18mRNA 的相对表达量*AB1209060210252015210对照组手术组对照组手术组118 KD42 KD肝组织 IL-18mRNA 的相对表达量肝组织 IL-1 mRNA 的相对表达量*C对照组 手术组对照组手术组NLRP3-actin1.51.00.50.0肝组织 NLRP3 蛋白表达量3724期*P0.05，*P0.01。图 3脑组织 IL-1、IL-18 mRNA 及其蛋白和 NLRP3 蛋白表达水平的影响和 IL-18 蛋白表达增高。IL-1 和 IL-18 主要通过 NLRP3 炎症小体相关通路剪切、激活。本研究也观察到手术后脑组织 NLRP3 蛋白表达明显增加。这些结果表明，NLRP3 炎症小体通路参与了手术引发的中枢炎性反应。Fan 等29通过使用MCC950 抑制 NLRP3 炎性小体改善了异氟醚麻醉诱发的中枢炎性反应，因此，推测阻断 NLRP3可能会减轻手术导致的中枢炎性反应。本研究结果显示，手术后小鼠肝脏、脾脏、脑组织均有不同程度的炎性反应及 NLRP3 炎症小体相关蛋白表达增高，但并未进行更加深入的机制研究，也未观察这些器官的功能变化，将在将来的实验中进一步探索。综上所述，本研究通过动物实验验证了手术可以激活 NLRP3 炎性小体，促使炎性因子大量产生，诱导全身性炎性反应的发生。NLRP3 炎症小体可能是防治围术期炎性反应的一个重要靶点。参考文献：1Chen B，Qin G，Xiao J，et al.Transient neuroinflammation following surgery contributes to long-lastingcognitive decline in elderly rats via dysfunction ofsynaptic NMDA receptor J.J Neuroinflammation，2022，19（1）：181.2 Yang Y，Liu Y，Zhu J，et al.Neuroinflammation-mediated mitochondrial dysregulation involved in postoperative cognitive dysfunction J.Free Radic Biol Med，2022，178（1）：134-146.3 Wang Y，Bellomo R.Cardiac surgery-associated acutekidney injury：risk factors，pathophysiology and treatment J.Nat Rev Nephrol，2017，13（11）：697-711.4 Serpa NA，Campos PP，Hemmes SN，et al.Kinetics ofplasma biomarkers of inflammation and lung injury insurgical patients with or without postoperative pulmonary complications J .Eur J Anaesthesiol，2017，34（4）：229-238.5 Scott DA，Evered LA，Silbert BS.Cardiac surgery，thebrain，and inflammation J.J Extra Corpor Technol，2014，46（1）：15-22.6 Muscat SM，Deems NP，D Angelo H，et al.Postoperative cognitive dysfunction is made persistent with morphine treatment in aged rats J.Neurobiol Aging，*对照组手术组对照组手术组对照组手术组对照组手术组对照组手术组对照组手术组118 KD42 KDNLRP3-actin1.51.00.50.0NLRP3 蛋白表达量5432103210IL-1mRNA 的相对表达量IL-18mRNA 的相对表达量1008060402001 0005000IL-1 浓度/（g mL-1）IL-18 浓度/（g mL-1）蒋鑫，等.NLRP3炎症小体在小鼠手术模型诱导全身性炎性反应中的作用373宁夏医科大学学报45卷2021，98：214-224.7 Lassig AAD，Lindgren BR，Itabiyi R，et al.Excessiveinflammation portends complications：Wound cytokinesand head and neck surgery outcomes J.Laryngoscope，2019，129（7）：238-246.8Zhang WJ，Chen SJ，Zhou SC，et al.Inflammasomesand fibrosis J.Front Immunol，2021，12：643149.9 Song N，Li T.Regulation of NLRP3 inflammasome byphosphorylation J.Front Immunol，2018，9：2305.10Guo DH，Yamamoto M，Hernandez CM，et al.Visceral adipose NLRP3 impairs cognition in obesity viaIL-1R1 on CX3CR1+cells J.J Clin 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neuroinflammationJ.JNeuroinflammation，2021，18（1）：128.28 Jha S，Srivastava SY，Brickey WJ，et al.The inflammasome sensor，NLRP3，regulates CNS inflammationand demyelination via caspase-1 and interleukin-18J.J Neurosci，2010，30（47）：15811-15820.29 Fan Y，Du L，Fu Q，et al.Inhibiting the NLRP3 inflammasome with MCC950 ameliorates isoflurane-induced pyroptosis and cognitive impairment in agedmice J.Front Cell Neurosci，2018，12（11）：426.（责任编辑：路锦绣）3744期The Role of NLRP3 Inflammasome in Systemic Inflammatory ResponseMediated by SurgeryJIANG Xin1，2，REN Yi1，3，LIU Yuanyuan4，WANG Rui1，3，MA Gang2（1.Clinical Medical College of Ningxia Medical University，Yinchuan750004，China；2.Department ofAnesthesiology，the General Hospital of Ningxia Medical University，Yinchuan750004，China；3.Department of Gastroenterology，the General Hospital of Ningxia Medical University，Yinchuan750004，China；4.School of Basic Medical Sciences，Ningxia Medical University，Yinchuan750004，China）Abstract：ObjectiveTo investigate the role of NOD-like receptor protein 3（NLRP3）contributes to systemicinflammatory response.MethodsMale C57BL/6J mice（8 weeks age）were randomly divided into the controlgroup and the surgical group（7 mice/group）.After 24 h of the bilateral carotid artery exposure surgery，specimensfrom plasma，liver，spleen，and brain were respectively collected.The mRNA expressions of IL-1 and IL-18were separately measured by quantitative PCR（qPCR）.Western blot was used to detect the expression of NL-RP3.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was used to determine the expressions of IL-1 andIL-18.ResultsCompared with the control group，the plasma level of IL-1 in the surgical group was signif-icantly increased（P0.01）.IL-1 mRNA，IL-18 mRNA，and NLRP3 protein expression also increased inliver and spleen tissues（P all0.05）.In the brain tissue，the results of qPCR showed that the mRNA levels ofIL-1 and IL-18 were higher in the operation group compared to the control group（P all0.05）.When com-pared to the control group，the surgery group s brain tissue had greater amounts of IL-1 and IL-18 protein，according to the ELISA results（P all0.01）.Western blot results revealed that the level of NLRP3 protein washigher in the surgery group compared to the control group（P0.05）.ConclusionSurgery mediated systemicinflammatory response is associated with the NLRP3 inflammasome pathway.Key words：surgery；NLRP3 inflammasome；systemic inflammatory response蒋鑫，等.NLRP3炎症小体在小鼠手术模型诱导全身性炎性反应中的作用按 GB 335882 统计学名词及符号 的有关规定书写，常用如下：1）样本的算术平均数用英文小写x-（中位数用 M）；2）标准差用英文小写 s；3）标准误用英文小写 s；4）t 检验用英文小写 t；5）F 检验用英文大写 F；6）卡方检验用希文小写2；7）相关系数用英文小写 r；8）自由度用希文小写 v；9）概率用英文大写 P（P 值前应给出具体检验值，如 t 值、2值、q 值等），以上符号均用斜体。关于资料的统计学分析：对于定量资料，应根据实验或调查设计类型和资料的条件选用合适的统计学分析方法，不能盲目套用 t 检验和单因素方差分析；对于定性资料，应根据实验或调查设计类型、列联表中定性变量的性质和分析目的选用合适的统计学分析方法，不能盲目套用 2检验；对于回归分析，应结合专业知识和散布图选用合适的回归类型，不能盲目套用简单直线回归分析。（本刊编辑部）本刊对统计学符号及统计学方法的要求x375