hKDR-(+_+)人源化...遗传修饰荷瘤小鼠模型的建立_刘甦苏.pdf

DOI:10.12300/j.issn.1674-5817.2022.154实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineApr.2023,43(2)范昌发，博士，研究员，博士生导师，中国食品药品检定研究院模式动物研究室主任，组建了该院的遗传修饰动物模型制作平台，构建了全球首个人源化新冠小鼠模型hACE2-KI，自主建立了致癌模型KI.C57-ras V2.0等代表性小鼠模型，并广泛用于我国新冠疫苗研发及新药临床前致癌性评价。发表论文100余篇，包括Science（2篇）、Nature、Cell Host&Microbe、STTT（3篇）、NSR、EMI（3篇）、Cancer Science、Cell Research、Virus（2篇）、Vaccine（4篇）等杂志；获得Cell Press杂志社评选的“2020年度中国区最受欢迎论文”；申请专利13项，授权10项；承担或组织申请国自然基金、国家重大新药创制专项、国家传染病重大专项、国家病原学专项课题等17项；荣获中国药学会科学技术奖二等奖1项，北京市科学技术进步奖一等奖1项、二等奖1项。自主研制遗传修饰大、小鼠模型50余种。研究工作被英国The Economist、美国Cell Press、中国科学网、北京科技报等媒体专题报道。被科技部评选为“全国科技系统抗击新冠肺炎疫情先进个人”。刘甦苏，毕业于中国农业大学，动物医学专业硕士，副主任技师，现工作于中国食品药品检定研究院，一直从事与药品检定和安全评价相关的遗传修饰模式动物技术工作，涉及医药学术领域中的肿瘤类动物模型、传染病动物模型、人源化动物模型三大类研究范围。工作期间主持、参与国家级及院级课题共6项，发表期刊论文共29篇，其中第一作者7篇（SCI论文1篇，核心期刊论文6篇）；合编专著1部；专利申请/授权共10项，其中专利授权4项，新申请专利6 项；起草并发布中国实验动物学会团体标准2项。获北京实验动物行业协会科学技术二等奖、2020年北京实验动物行业协会先进个人称号。hKDR+/+人源化及Rag1-/-基因缺陷新型双靶点遗传修饰荷瘤小鼠模型的建立刘甦苏,吴勇,曹愿,赵皓阳,翟世杰,孙晓炜,李琳丽,范昌发(中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所,国家啮齿类实验动物资源库,北京 102629)摘要 目的通过增强血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）人源化小鼠（hKDR+/+）接纳不同来源的小鼠肿瘤细胞系的潜力，建立能支持多种肿瘤细胞系成瘤的、可评价针对VEGFR靶点药物的新型荷瘤小鼠模型。方法首先建立基于hKDR+/+人源化小鼠模型评价针对VEGFR靶点抗体体内活性的方法，同时采用CRISPR/Cas9技术构建重组激活基因1（recombination activating gene 1，Rag1）敲除的C57BL/6N小鼠（命名为Rag1-/-小鼠）。然后将Rag1-/-小鼠与hKDR+/+小鼠交配，筛选获得双基因纯合、双靶点基因修饰的hKDR+/+/Rag1-/-小鼠。最后在hKDR+/+、Rag1-/-、hKDR+/+/Rag1-/-和C57BL/6N小鼠上测试不同小鼠品系来源肿瘤细胞系的体内肿瘤生长差异。结果针对VEGFR靶点设计的抗体在hKDR+/+小鼠体内表现出明显的抗肿瘤活性，与PBS组相比，肿瘤体积明显减小（P0.01），肿瘤质量明显减轻（P0.05）。Rag1-/-小鼠、hKDR+/+/Rag1-/-小鼠的外周血B细胞和T细胞数量均明显减少（P0.05，P0.001）。C57BL/6小鼠来源的MC38细胞接种7 d后，在hKDR+/+/Rag1-/-、Rag1-/-、C57BL/6N和hKDR+/+四组小鼠体内均可见肿瘤生长。BALB/c小鼠来源的CT26细胞接种10 d后，仅在hKDR+/+/Rag1-/-和Rag1-/-小鼠体内见到肿瘤生长，在 C57BL/6N 及hKDR+/+小鼠中均未见肿瘤生长；接种后 3 周，hKDR+/+/Rag1-/-小鼠的成瘤体积明显大于Rag1-/-小鼠（P0.01）。结论获得了Rag1基因敲除小鼠，并进一步筛选获得新型hKDR+/+/Rag1-/-双靶点基因修饰小鼠模型；Rag1基因缺失时，不同品系小鼠来源的肿瘤细胞系更易成瘤。这提示可以通过降低hKDR+/+人源化小鼠的免疫反应能力，增强或扩大该模型小鼠接纳肿瘤细胞系的范围，构建多种可用于评价VEGFR靶点药物的荷瘤小鼠模型。关键词 hKDR+/+人源化小鼠；Rag1-/-基因敲除小鼠；VEGFR靶点；抗体；肿瘤中图分类号 Q95-33；R-332 文献标志码 A 文章编号 1674-5817（2023）02-0103-09 人类疾病动物模型 Animal Models of Human Diseases基金项目 国家科技重大专项课题“创新生物技术药评价及标准化关键技术研究”（2018ZX09101-001）第一作者 刘甦苏（1981），女，硕士，副主任技师，主要从事模式动物研究。E-mail：通信作者 范昌发（1970），男，研究员，主要从事模式动物研究。E-mail：。ORCID：0000-0001-5556-2025103实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineApr.2023,43(2)Establishment of hKDR+/+Humanized and Rag1-/-Gene Knockout Double Genetically Modified Mouse ModelLIU Susu,WU Yong,CAO Yuan,ZHAO Haoyang,ZHAI Shijie,SUN Xiaowei,LI Linli,FAN Changfa(Institute for Laboratory Animal Resources,National Institutes for Food and Drug Control;National Rodent Laboratory Animal Resources Center,Beijing 102629,China)Correspondence to:FAN Changfa(ORCID:0000-0001-5556-2025),E-mail:ABSTRACT ObjectiveThrough improving the potential of vascular endothelial growth factor receptor(VEGFR)-humanized mouse model(hKDR+/+)with C57BL/6N background to allow the growth of different mouse tumor cell lines,to establish novel tumor-bearing mouse models which can support in vivo tumorigenesis of different mouse tumor cell lines and be used to evaluate drugs targeting VEGFR.Methods Firstly,a method to evaluate the in vivo activity of antibody targeting VEGFR based on the hKDR+/+humanized mouse model was established.Recombinant activating gene 1(Rag1)knockout mice(Rag1-/-)were established using CRISPR/Cas9 technology.Then these Rag1-/-mice were crossed with hKDR+/+mice to get a double gene modified homozygous hKDR+/+/Rag1-/-mouse model by screening.Finally,tumor cell lines derived from different mouse strains were tested on the double gene-modified mouse model to compare the differences in tumor growth.ResultsAntibodies designed for VEGFR showed significant anti-tumor activity in hKDR+/+mice,which significantly reduced tumor volume and weight compared with the PBS group(P0.01,P0.05).The number of B cells and T cells in the peripheral blood of Rag1-/-mice and hKDR+/+/Rag1-/-mice decreased(P0.05,P0.001).Tumors were observed in hKDR+/+/Rag1-/-,Rag1-/-,wild-type,and hKDR+/+mice after 7 d of inoculation of MC38 cells derived from C57BL/6 mice.Tumors were only observed in groups of hKDR+/+/Rag1-/-and Rag1-/-mice,but not in the wild-type and hKDR+/+mice after 10 d of inoculation with CT26 cells derived from BALB/c mice.After 3 weeks of inoculation,the tumor volume of hKDR+/+/Rag1-/-mice was significantly larger than that of Rag1-/-mice(P0.01).ConclusionRag1 knockout mice were obtained and a novel hKDR+/+/Rag1-/-double genes modified mouse model was further screened.The tumor cell lines from different mouse strain origins were more prone to growth in mice with Rag1 gene deficiency.The results suggest that the reduced immune response of hKDR+/+humanized mice will improve the capacity of supporting the growth of mouse tumor lines in the model.As a result,more tumor-bearing mouse models may be constructed for the evaluation of drugs targeting VEGFR in this way.Key words hKDR+/+humanized mice;Rag1-/-knockout mice;VEGFR target;Antibodies;Tumor肿瘤血管生成与肿瘤生长、侵入和转移关系密切，因此抗血管生成是治疗肿瘤的重要策略之一。其中，以血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及 其 受 体 家 族（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR，即 KDR）为靶点的抗肿瘤治疗越来越受到研究人员的重视。目前，作用于VEGF/VEGFR通路的抗肿瘤药物主要有两类：一类是单克隆抗体，另一类是小分子VEGFR酪氨酸激酶抑制剂。这两类药物均已在我国临床中应用。针对VEGFR靶点的抗体药物如雷莫芦单抗（ramucirumab，商品名：Cyramza）作为一种全人源、靶向VEGFR的IgG1型单克隆抗体，是目前唯一上市的VEGFR靶点抗体药物。小鼠 VEGFR（mKDR）与人 VEGFR（hKDR）存在不同的关键氨基酸，导致二者功能差异较大。研究人员针对hKDR基因研发的抗体不能与mkdr基因结合，而且在评价相关抗体时缺少合适的小鼠模型。因此，建立人源化hKDR+/+小鼠模型有助于该靶点抗体药物的研发及其体内效力和安全性的评价1-3。常见的免疫缺陷小鼠有NOD scid 4、NOD Rag 5、NSG MHC-null6、Rag1、Rag2等，这些小鼠不能产生功能性T、B淋巴细胞或自然杀伤（natural killer，NK）细胞7-8，因而可以作为移植瘤模型的载体4，9，很好地支持非鼠源性肿瘤细胞成瘤，建立荷瘤小鼠模型。Rag1 基因编码重组激活（recombinase activating gene，Rag）复合物的催化成分，其突变或缺失会使其编码的重组酶活性完全或部分丧失，使T、B淋巴细胞104实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineApr.2023,43(2)的早期发育被阻断，导致原发性免疫缺陷病8。故Rag1基因敲除小鼠常被用于疾病小鼠模型，以损害T细胞和B细胞的发育来减弱免疫排斥。本实验室前期已建立hKDR+/+人源化小鼠模型，证实其能有效地评价人VEGFR抗体的体内效力及安全性。该小鼠模型全称为C57BL/6-KDRem1（hKDR）/NIFDC，简称hKDR+/+人源化小鼠。该模型采用CRISPR/Cas9基因编辑技术将hKDR基因的蛋白质编码区的部分外显子47，插入到mkdr基因的外显子4处构建获得10。该模型免疫系统正常，能很好地支持同背景来源的鼠源性肿瘤细胞的生长成瘤，但存在不同背景来源的鼠源肿瘤细胞系和人源肿瘤细胞相互排斥的问题，不易建成多类型的成瘤鼠模型。为解决这个问题，本研究首先测试了hKDR+/+人源化小鼠评价针对VEGFR靶点抗体体内活性的能力，同时采用CRISPR/Cas 9技术敲除C57BL/6N小鼠的Rag1基因，获得T、B淋巴细胞降低的免疫缺陷 Rag1-/-小鼠模型；随后将 Rag1-/-小鼠与hKDR+/+人源化小鼠杂交，筛选获得双靶点遗传修饰小鼠，该小鼠模型全称为C57BL/6-Rag1em1/KDRem1（hKDR）/NIFDC，简称hKDR+/+/Rag1-/-小鼠。本研究的目的是在hKDR+/+人源化小鼠模型的基础上，同时降低其对不同品系小鼠来源细胞的排斥，提高不同背景肿瘤细胞的接种成功率，为开展多种抗肿瘤抗体治疗研究提供合适的实验动物模型。1材料与方法1.1实验动物SPF级C57BL/6N和ICR小鼠来自中国食品药品检定研究院实验动物研究所 SCXK（京）2022-0002，繁育环境为屏障设施。动物接种及观察实验在屏障设施环境SYXK（京）2022-0014中进行，饲喂灭菌小鼠颗粒饲料，饮用灭菌自来水。在清洁级环境下进行动物取材。本实验所有研究均按照中国食品药品检定研究院实验动物福利伦理委员会批准的动物方案进行，审查编号为中检动（福）第2021（B）002号。1.2结肠癌细胞株鼠源结肠癌细胞MC38和CT26由北京神州细胞生物技术有限公司赠送。其中，MC38细胞来自C57BL/6小鼠结肠腺癌细胞系，购自上海慧颖生物科技有限公司（货号M023），CT26细胞来自BALB/c小鼠结肠腺癌细胞系，购自美国标准培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）（编号CRL-2638），均传代68代。1.3主要仪器及试剂480荧光定量PCR仪购自瑞士Roche公司；Nano Drop超微量分光光度购自美国Thermo公司；Cas9转录试剂盒（AM1344），Poly（A）加尾试剂盒（AM1350），MEGAshortscript T7 sgRNA 转 录 试 剂 盒（AM1354），MEGAclear转录清洁回收试剂盒（AM1908）均购自美国Life Technologies 公司，质粒提取试剂盒（#12362）和RNeasy Mini纯化试剂盒（#74104）购自中国Qiagen公司。细胞培养用培养基（11960044）、胎牛血清（10100147）、青链霉素混合液（15140122）、0.25%的胰蛋白酶（25200072）均购自美国Gibco公司；细胞流式细胞术所用试剂均购自美国BioLegend公司。抗体药物 Ramucirumab 购自美国 Eli Lilly 公司，VEGFR2-HK19由北京义翘神州科技股份有限公司赠送。本研究中所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。舒泰 50 购自法国 Virbac 公司 批准文号：（2020）外兽药证字06号，盐酸赛拉嗪购自长沙拜特生物科技研究所有限公司（批准文号：兽药字180121777）1.4用hKDR+/+人源化小鼠评价抗体的体内抗肿瘤活性hKDR+/+人源化小鼠模型的构建步骤详见文献10。选用3周龄雄性hKDR+/+小鼠，将鼠结肠癌MC38细胞（5106细胞/只）皮下接种到小鼠背侧。每天监测小鼠的一般健康状况，每周测量2次体质量，并使用游标卡尺测量肿瘤长径（a）和短径（b），计算肿瘤体积V=（ab2）/2。当肿瘤体积达到100200 mm3时，将荷瘤小鼠随机分为不同组（每组4只），每周两次给予Ramucirumab、VEGFR2-HK19 或同等体积的 PBS 溶剂，每只小鼠给药剂量为20 mg/kg，共治疗3周。给药后，每5 d测量1次肿瘤体积，每周测量1次小鼠体质量。实验结束时，采用CO2吸入法对实验动物实施安乐死后解剖小鼠，收集肿瘤组织，称重。1.5构建Rag1-/-免疫缺陷小鼠模型通过NCBI查询Rag1鼠源基因，Rag1基因位于2号染色体，全长11 kb（Gene ID：19373），利用crisp.mit.edu网站在Rag1基因的第二外显子内设计一对互补的敲除引物，并构建sgRNA表达载体。随后使用质粒提取试剂盒提取构建好的sgRNA表达载体，并使用引105实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineApr.2023,43(2)物Rag1-pT7-sgRNA-F、Rag1-pT7-sgRNA-R（序列见表1），以sgRNA质粒为模板进行PCR扩增。在37 条件下用MEGAshortscript T7转录试剂盒进行体外转录，并使用MEGAclear转录清洁回收试剂盒进行纯化。超数排卵C57BL/6N小鼠、显微注射并胚胎移植到ICR小鼠后，筛选获得Rag1杂合敲除小鼠模型。随后进一步通过交配筛选Rag1纯合敲除小鼠模型，并留种建系。为进一步验证基因敲除的正确性，随机取Rag1纯合基因敲除小鼠与野生型小鼠，针对Rag1基因的编码序列设计引物，上游引物为Rag1-F，下游引物为Rag1-R（序列见表1），扩增目的片段为351 bp，通过基因扩增测序后进行序列验证和比对，随后进一步采用外周血淋巴细胞流式细胞术进行表达验证。1.6构建hKDR+/+/Rag1-/-人源化免疫缺陷双靶点小鼠模型构建的hKDR+/+人源化小鼠和纯合Rag1-/-基因敲除小鼠，分别饲养于屏障设施，选取68周龄的小鼠交配。剪鼠尾提取DNA，用PCR鉴定其基因型，选出双基因阳性的小鼠定为F1代并同胞兄妹交配。依次类推，经过5代交配后得到双基因纯合的遗传修饰小鼠。选取出生37 d的hKDR+/+/Rag1-/-纯合人源化免疫缺陷小鼠 6 只，采用 PCR 方法鉴定基因型。剪取尾部0.5 cm左右组织，提取基因组DNA，PCR扩增筛选，引物见表1，分别命名为Rag1-F、Rag1-R、KDR-F、KDR-R和KDR-WF。1.7外周血淋巴细胞流式细胞术检测使用舒泰和赛拉嗪麻醉各实验分组的3只小鼠后，眼内眦采血，血样加入等体积的0.9%NaCl稀释；平铺至淋巴细胞分离液面上，离心取分离液层，去除红细胞后，PBS洗涤2次。将小鼠外周血淋巴细胞重悬于染色缓冲液中，分别加入抗CD3（PE标记）和抗CD19（APC标记）的荧光抗体进行标记，冰上避光孵育20 min，染色缓冲液洗涤2次后，按流式细胞常规方法检测T细胞（CD3标志）和B细胞（CD19标志）含量并分析细胞比例。采用CellQuest软件分析样品，每个样品收集1104个细胞检测淋巴细胞数量，结果以淋巴细胞百分含量散点图表示。1.8培养肿瘤接种细胞鼠源结肠癌 CT26 和 MC38 细胞用含 10%FBS 和1%PS的DMEM培养基，在37、5%CO2的培养箱中培养，待细胞铺满80%左右，使用胰蛋白酶消化细胞，离心收获并传代培养，至一定数量后收集，将收集到的细胞用锥虫蓝进行染色并计数。1.9建立双靶点遗传修饰的荷瘤小鼠模型选用 hKDR+/+、Rag1-/-、hKDR+/+/Rag1-/-和 C57BL/6N共4种不同小鼠，每组各5只，用于建立荷瘤小鼠模型。收集对数生长期的CT26和MC38细胞，使用无血清的DMEM培养液重悬细胞，并将细胞浓度调整为5106/mL后，各取100 L分别接种于小鼠左右后肢根部皮下。接种当日记为第0日，每日观察接种部位肿瘤生长情况，并称量小鼠体质量；待观察到肿瘤生长，每周2次用游标卡尺测量肿瘤长径（a）和短径（b），按照肿瘤体积V=（ab2）/2计算肿瘤体积。当小鼠体质量下降超过25%30%或肿瘤体积超过3 000 mm3，提示小鼠生存质量受到严重影响，这时即停止测量，并采用CO2吸入法对实验动物实施安乐死。测定时间是4周。1.10数据统计分析用GraphPad Prism 8.0软件对结果数据进行统计分析并制图方差齐性分析后，数据以-xs表示。多组间数据分析采用两因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1hKDR+/+人 源 化 小 鼠 模 型 能 很 好 地 评 价VEGFR2靶点抗体的抗肿瘤活性为了验证 hKDR+/+人源化小鼠模型，评价针对VEGFR靶点设计的抗体药物的抗肿瘤活性，本研究首先通过皮下注射MC38细胞建立了hKDR+/+荷瘤模型。如图1A所示，携带MC38衍生肿瘤的hKDR+/+小鼠接受Ramucirumab 和 VEGFR2-HK19 这两种针对 VEGFR 靶表1 模型建立所需引物信息Table 1 Primers for model development引物PrimerRag1-T7 sgRNA-FRag1-T7 sgRNA-RRag1-FRag1-RKDR-FKDR-RKDR-WF序列(5 3)Sequence(5 3)TAGGTGAAACGATTCCCACAGATGAAACCATCTGTGGGAATCGTTTCAGGGGAAACCTTACCTAGAACAGAGAATTCCGTCGGGTGGATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGCCAGCACTGTCTAAATTCAACGGCGTATGTGTTTCTCTGCCCTCCTCG106实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineApr.2023,43(2)点的单克隆抗体治疗。其中，单抗Ramucirumab抗体已经FDA批准上市。实验全程，测量肿瘤体积。结果表 明，与 PBS 对 照 组 相 比，经 Ramucirumab 和VEGFR2-HK19 治疗后 hKDR+/+小鼠的肿瘤外观见图1B；统计分析显示治疗组肿瘤体积（图1C）明显减小（P0.01），肿瘤质量（图1D）明显减轻（P0.05）。相比之下，PBS组不会导致hKDR+/+小鼠的肿瘤形状、肿瘤体积或质量改变。这些结果表明，抗体能有效抑制hKDR+/+小鼠的肿瘤生长，hKDR+/+小鼠能很好地评价针对VEGFR靶点抗体的体内抗肿瘤活性。2.2成功构建Rag1-/-免疫缺陷小鼠模型根据模型构建示意图（图 2A），设计并合成sgRNA后，将活性最高的sgRNA插入到带T7启动子质粒载体pT7-sgRNA上并进行体外转录，随后将sgRNA及Cas9 mRNA注射受精卵并移植至ICR假孕鼠。共注射并移植受精卵196枚，出生小鼠18只，筛选获得首建鼠1只。经过与野生型C57BL/6N杂交扩大繁殖后自交，获得3只Rag1-/-基因敲除小鼠；PCR鉴定基因型结果见图2B，只扩增出285 bp目的条带为纯合小鼠，扩增出365 bp及285 bp目的条带为杂合小鼠。针对 Rag1 基因双向 DNA 测序比对，结果证明Rag1基因在382到462位点缺失80 bp（图2E），片段缺失位点在sgRNA设计位点的前端。进一步扩繁后，取 Rag1-/-基因敲除小鼠的眼眶血，流式细胞术检测外周血中T细胞和B细胞含量。结果显示，Rag1-/-小鼠的 T 细胞（CD3 标志）和 B 细胞（CD19 标志）含量较 C57BL/6N 小鼠的明显降低（P0.05，P0.001，图 2CD），说 明 Rag1-/-免 疫 缺 陷 小 鼠 模 型 建 立成功。2.3成功交配获得hKDR+/+/Rag1-/-人源化免疫缺陷小鼠在验证 hKDR+/+人源化小鼠能很好地评价针对注：A为用人源化抗体或PBS治疗MC38荷瘤hKDR+/+小鼠的实验方案示意图（D0、D10、D13、D16、D20、D24和D25分别表示注射肿瘤细胞当天及之后的第10、13、16、20、24、25天）；B为在治疗结束时，对每只小鼠的肿瘤进行解剖，并确定肿瘤大小；C为Ramucirumab和VEGFR-HK19抗体能显著降低肿瘤体积（每组4只小鼠，*P0.01）；D为治疗结束时，各组肿瘤质量的比较（每组4只小鼠，*P0.05）。Note:A shows the experimental flow diagram of treating MC38 tumor bearing hKDR+/+mice with humanized antibody or PBS（D0,D10,D13,D16,D20,D24 和 D25 show the day of injection and the 10th,13th,16th,20th,24th和 25th day after the injection of tumor cells,respectively);B shows the tumors were dissected from each mouse in different groups at the end of the treatment period;C shows Ramucirumab and VEGFR-HK19 can significantly reduce tumor volume(n=4,*P0.01);D shows the tumor weight in different groups at the end of the treatment(n=4,*P0.05).图1 针对VEGFR2靶点的抗体能抑制hKDR+/+小鼠的肿瘤生长Figure 1 Antibody targeting VEGFR2 targets can inhibit tumor growth in hKDR+/+mouse107实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineApr.2023,43(2)VEGFR抗体的体内抗肿瘤活性基础上，进一步将雄性Rag1-/-小鼠与雌性hKDR+/+人源化小鼠交配，筛选获得hKDR+/+/Rag1-/-双靶点遗传修饰小鼠，交配及筛选流程见图3A。针对插入基因hKDR+及敲除基因Rag1设计引物，进行双靶点小鼠模型的基因型鉴定，hKDR+/+人源化小鼠目的条带大小为351 bp，Rag1-/-小鼠目的条带大小为285 bp，小鼠正确扩增这2种条带则判定为hKDR+/+/Rag1-/-小鼠。图3B中样本1、2、3即为双基因纯合小鼠。通 过 流 式 细 胞 术 检 测 hKDR+/+小 鼠 和 hKDR+/+/Rag1-/-小鼠外周血中 B 细胞（CD3 标志）和 T 细胞（CD19标志）含量，可见hKDR+/+/Rag1-/-双靶点小鼠中的T、B细胞含量较hKDR+/+人源化小鼠明显降低，差异有统计学意义（P0.05，P0.001，图3CD）。2.4hKDR+/+/Rag1-/-人源双靶点基因修饰小鼠利于CT26肿瘤细胞生长观察 CT26 和 MC38 鼠源肿瘤细胞分别接种于hKDR+/+、Rag1-/-、hKDR+/+/Rag1-/-和 C57BL/6N 这 4 种小鼠左右后肢根部皮下的肿瘤生长情况，结果显示，右后肢接种C57BL/6N小鼠来源的MC38细胞后，4种小鼠均在7 d左右开始有肿瘤生长，整个实验周期各种小鼠的成瘤体积差异无统计学意义（图4A）。左后肢接种BALB/c小鼠来源的CT26细胞10 d后，仅Rag1-/-和hKDR+/+/Rag1-/-小鼠观察到肿瘤生长，而C57BL/6N和hKDR+/+小鼠未见肿瘤生长；接种后3周，hKDR+/+/Rag1-/-小鼠的成瘤体积大于Rag1-/-小鼠，二者差异有统计学意义（P0.01），具体数据如图4BD所示。从成瘤实验结果可知，同一只小鼠同时接种 MC38 和注：A为模型的构建设计图示；B为Rag1基因敲除（Rag1-/-）小鼠的基因型鉴定图（hom，基因纯合小鼠；het，基因杂合小鼠；WT，野生型小鼠）；C为Rag1-/-基因小鼠和C57BL/6N野生型小鼠外周血T、B淋巴细胞百分含量散点图；D为2组小鼠T、B淋巴细胞百分含量分析柱状图（每组3只小鼠，*P0.05，*P0.001）；E为Rag1基因目的片段测序及序列对比，其中DEL表示敲除的片段。Note：A shows model construction design;B shows genotype identification map of Rag1-/-mice(hom shows homozygous mice;het shows heterozygous mice;WT shows wild-type mice).C shows scatter diagrams of the percentage of T and B lymphocytes in peripheral blood of Rag1-/-mice and C57BL/6N wild-type mice.D shows the bar chart of percentage analysis of T and B lymphocytes in the two groups of mice(n=3,*P0.05,*P0.001).E shows the sequence comparison of target fragments of the Rag1 gene.DEL shows the knockout segment.图2 Rag1-/-基因敲除小鼠的构建及验证Figure 2 Design strategy and validation of Rag1-/-gene knockout mice108实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineApr.2023,43(2)CT26细胞后成瘤情况不一致，提示不同来源背景的肿瘤细胞系只能在免疫缺陷的 hKDR+/+/Rag1-/-小鼠和Rag1-/-小鼠中有肿瘤生长。3讨论肿瘤的发生、发展与转移受到多种因素的影响，肿瘤微环境中新生血管的形成是多因素相互作用的结果，新生血管在肿瘤的发展转移过程中起到重要作用11。近年来，以hKDR基因及其受体为靶点的抗肿瘤治疗受到越来越多的关注，相关人源化小鼠模型在药效评价及其作用机制研究等方面可发挥基础性作用。本研究团队前期通过CRISPR/Cas9技术已获得了人VEGFR插入的hKDR+/+人源化小鼠模型10。本研究中，首先皮下接种C57BL/6来源的MC38细胞并使用靶点VEGFR的抗体药物进行治疗，结果显示抗体药物能抑制肿瘤生长，证明该模型能很好地评价VEGFR抗体的体内抗肿瘤活性。但前期实验接种BALB/c遗传背景的CT26鼠源细胞后不见肿瘤生长，分析原因可能是小鼠免疫系统对异源肿瘤细胞产生了排斥作用。因为表型均一、遗传稳定、背景数据充分的优势，模式动物的制作多用C57BL/6品系12。而在开展抗肿瘤研究时往往需要接种不同背景的肿瘤细胞，以获得不同肿瘤类型的荷瘤小鼠模型，用于药效学评价。不同背景的成瘤鼠模型对免疫抑制剂的免疫应答存在差异13。为此，在获得hKDR+/+人源化小鼠的基础上，本研究通过敲除C57BL/6N小鼠的Rag1基因的第二个外显子处前端80 bp片段，导致其编码的重组酶活性部分丧失，使T、B淋巴细胞的早期发育被阻断，导致免疫缺陷，获得Rag1-/-小鼠。较已报道的模型而言，本模型采用CRISPR/Cas9技术构建，周期较短，费用较注：A为hKDR+/+/Rag1-/-人源双靶点基因修饰小鼠繁育流程；B为hKDR+/+/Rag1-/-人源双靶点基因小鼠基因型鉴定（1、2、3为双基因纯合小鼠，hom指基因纯合小鼠，WT指野生型小鼠）；C为hKDR+/+/Rag1-/-人源双靶点基因修饰小鼠的外周血T、B淋巴细胞百分含量散点图；D为2组小鼠T、B淋巴细胞百分含量分析柱状图（每组3只小鼠，*P0.05，*P0.001）。Note：A shows breeding process of hKDR+/+/Rag1-/-humanized double target gene-modified mice;B shows genotype identification of hKDR+/+/Rag1-/-humanized double target gene mice(1,2,3 show homozygous mice with two genes，hom shows homozygous mice,WT shows wild-type mice);C shows scatter diagrams of percentage of T and B lymphocytes in the peripheral blood of hKDR+/+/Rag1-/-humanized double target gene-modified mice;D shows the bar chart of percentage analysis of T and B lymphocytes in the two groups of mice（n=3,*P0.05，*P0.001）.图3 hKDR+/+/Rag1-/-双靶点基因修饰小鼠的获得及验证Figure 3 Design strategy and validation of hKDR+/+humanized and Rag1-/-deficient double genetically modified mouse model109实验动物